<Desc/Clms Page number 1>
WERKWIJZE VOOR DE WINNING VAN EEN
B-LACTAM ANTIBIOTICUM
De uitvinding betreft een werkwijze voor de winning van een ss-lactam antibioticum uit een mengsel dat het ammoniumzout van de overeenkomstige ss-lactamkern en het ammoniumzout van het ss-lactam antibioticum bevat.
Bij de bereiding van een ss-lactam antibioticum, waarbij een overeenkomstige ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van een geschikt acyleringsmiddel, is de winning van het ss-lactam antibioticum en de opwerking van het reaktiemengsel in het algemeen moeilijk. In het reaktiemengsel zijn naast het ss-lactam antibioticum vaak nog waardevolle componenten aanwezig zoals bijvoorbeeld de ss-lactamkern. Om te komen tot een commercieel aantrekkelijk proces is het derhalve noodzakelijk het gevormde ss-lactam antibioticum nagenoeg zuiver te winnen en tegelijkertijd de verliezen aan ss-lactamkern en sslactam antibioticum te minimaliseren.
Het doel van de uitvinding is dan ook een werkwijze te verschaffen die het mogelijk maakt het sslactam antibioticum voldoende zuiver te winnen en het resterende mengsel eenvoudig en zonder significante verliezen aan ss-lactamkern en ss-lactam antibioticum op te werken dan wel te recirculeren.
Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door het mengsel te onderwerpen aan een fysische behandeling waarbij ammoniak uit de aanwezige ammoniumzouten wordt vrijgemaakt en als zodanig wordt afgevoerd en het neerslag van het vrijkomende ss-lactam antibioticum wordt gewonnen.
Gebleken is namelijk dat in de werkwijze volgens de uitvinding het vrije ss-lactam antibioticum selectief neerslaat terwijl de ss-lactam kern in oplossing achterblijft. Op deze wijze bleek het mogelijk het gevormde ss-lactam antibioticum met een zuiverheid groter
<Desc/Clms Page number 2>
dan 90% berekend als drooggewicht, in het bijzonder groter dan 98%, te winnen.
De term fysische behandeling staat in het kader van deze uitvinding tegenover chemische behandeling bijvoorbeeld de chemische reakties waarbij met behulp van sterk zuur anorganische ammonium zouten worden gevormd.
Voorbeelden van geschikte fysische behandelingen waaraan het mengsel kan worden onderworpen zijn een stripbehandeling met stoom of een inert gas zoals bijvoorbeeld beschreven in R. H. Perry, D. Green, Perry's Chemical Engineering Handbook 2* druk (1985), (stoom) destillatie onder verlaagde druk in het bijzonder dunne-film verdamping zoals bijvoorbeeld beschreven in Mutzenberg e. a., Chem. Eng. 72, 175-190 (1965), afdampen in een sproeitoren zoals bijvoorbeeld beschreven in Mehta en Shorma, Br. Chem. Eng. 15 1440,1465 (1970), gasmembraanscheiding, zoals bijvoorbeeld beschreven in D. J. Brose and P. v. Eikeren, Appl. Biochem. and Biotech., 24/25 (1990), 457-468 en electrodialyse, zoals bijvoorbeeld beschreven in de bovengenoemde referentie van R. H. Perry et al.
De werkwijze volgens de uitvinding kan geschikt worden toegepast bij de bereiding van bekende ss-lactam antibiotica, zoals bijvoorbeeld cefalexine, amoxicilline, ampicilline, cefaclor, cefradine, cefadroxyl en cefotaxim.
De temperatuur waarbij de behandeling wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 0 en 40 C, bij voorkeur tussen 5 en 30 C.
De pH van het te behandelen mengsel hangt af van de aard en de concentratie van de afzonderlijke componenten. In verband met de stabiliteit van de sslactamkern en het ss-lactam antibioticum wordt de behandeling meestal bij een pH lager dan 8, 5, in het bijzonder bij een pH tussen 5, 5 en 8, 5, bij voorkeur bij een pH tussen 6 en 8 uitgevoerd. Gedurende de behandeling wordt ammoniak verwijderd, waardoor de pH omlaag gaat.
<Desc/Clms Page number 3>
Door de intensiteit en de duur van de behandeling te sturen is het mogelijk de pH aan het einde van de behandeling te varieren. De optimale eind-pH hang af van de samenstelling van het mengsel en wordt zo gekozen dat een optimale scheiding tussen ss-lactamkern en ss-lactam antibioticum wordt verkregen. De optimale eind-pH is in de praktijk een compromis tussen enerzijds hoge zuiverheid van het gewonnen antibioticum die wordt bereikt wanneer de pH relatief weinig wordt verlaagd zodat het ss-lactam antibioticum nog gedeeltelijk en de ss-lactamkern nog volledig in oplossing is ; en anderzijds hoge opbrengst die wordt bereikt wanneer de pH zo ver wordt verlaagd dat het ss-lactam antibioticum nagenoeg volledig is neergeslagen maar waarbij tegelijkertijd ook een deel van de sslactamkern is neergeslagen.
De deskundige is eenvoudig in staat de voor zijn situatie optimale eind-pH vast te stellen.
De werkwijze volgens de uitvinding is in het bijzonder geschikt om te worden toegepast op het reaktiemengsel verkregen na een enzymatische acyleringsreaktie waarin een ss-lactam antibioticum wordt bereid door enzymatische acylering van de overeenkomstige ss-lactam kern met een geschikt acyleringsmiddel.
Geschikte voorbeelden van ss-lactamkernen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn penicillinezuurderivaten, bijvoorbeeld 6aminopenicillinezuur (6-APA), en cefalosporinezuur derivaten, bijvoorbeeld 7-aminocefalosporinezuur (7-ACA), 7-aminodesacetoxycefalosporinezuur (7-ADCA) en 7-amino-3chloorcefalosporinezuur (7-ACCA).
Geschikte acyleringsmiddelen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld a-aminozuurderivaten, in het bijzonder amiden en esters van fenylglycine, p-hydroxyfenylglycine en dihydrofenylglycine.
Als enzym kan in principe elk enzym worden
<Desc/Clms Page number 4>
toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreaktie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van Acetobacter, Aeromones, Aphanocladium, Bacillus so., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluvvera, Mvcoplana, Protaminobacter, Pseudomonas en Xanthomonas, in het bijzonder Acetobacter Dasteurianum, Bacillus
EMI4.1
meqaterium, Escherichia coli en Xanthomonas citrii.
Bij voorkeur wordt een geimmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig hergebruikt kan worden. Geimmobiliseerde enzymen zijn op zich bekend en commercieel verkrijgbaar. Bijzonder geschikt zijn gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygele commercieel verkrijgbaar is en het geimmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati.
De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 5 en 35OC, bij voorkeur tussen 20 en 28 C.
De pH waarbij de acyleringsreaktie plaatsvindt ligt meestal tussen 6 en 8, 5. De optimale pH is ondermeer afhankelijk van het antibioticum aangezien de stabiliteit en de oplosbaarheid van zowel het ss-lactam antibioticum als van de ss-lactamkern afhankelijk is van de pH. Wanneer als acyleringsmiddel een fenylglycinederivaat wordt toegepast ligt de pH bij voorkeur tussen 7 en 8 ; wanneer een p-hydroxyfenylglycinederivaat als acyleringsmiddel wordt gebruikt ligt de pH bij voorkeur tussen 6 en 7.
Daarnaast is ook de enzymaktiviteit pH-afhankelijk.
De acyleringsreaktie wordt in de praktijk meestal uitgevoerd in water. Desgewenst kan het reaktiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol. %. Voorbeelden van organische
<Desc/Clms Page number 5>
oplosmiddelen die kunnen worden toegepast zijn alcoholen met 1-7 C-atomen, bijvoorbeeld een monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol ; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.
In de bekende enzymatische acyleringsprocessen waarin de ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van amide als acyleringsmiddel, wordt een mengsel van de ammoniumzouten van het ss-lactam antibioticum en de sslactamkern verkregen. In deze acyleringsprocessen wordt in het algemeen de pH op een constante waarde gehouden door titratie met een sterk zuur. Hierbij worden echter anorganische zouten gevormd die de opwerking van het reaktiemengsel bemoeilijken en waarvan aanvraagster bovendien gebleken is dat ze de stabiliteit van het enzym verlagen zodat het relatief kostbare enzym minder vaak kan worden hergebruikt.
Bij voorkeur wordt de werkwijze volgens de uitvinding toegepast op een mengsel dat verkregen is door enzymatische acylering van een ss-lactamkern met behulp van een amide als acyleringsmiddel waarin de concentratie anorganische zouten in het reaktiemengsel lager is dan 1000 : n mM waarbij n de valentie van het anion is. Bij voorkeur wordt in een dergelijke werkwijze als acyleringsmiddel een vrij amide gebruikt en een molaire verhouding acyleringsmiddel tot ss-lactamkern tussen 0, 5 : 1 en 2 : 1 gekozen. Een dergelijke werkwijze kan bij relatief hoge concentraties worden uitgevoerd ; de som van de concentraties van het ss-lactam antibioticum en de sslactamkern ligt bijvoorbeeld tussen 200 en 800 mM, bij voorkeur tussen 300 en 600 mM.
Gebleken is dat onder dergelijke condities de pH tijdens de acyleringsreaktie voldoende laag blijft zodat tijdens de acyleringsreaktie geen pH-controle via titratie nodig is. Deze voorkeurswerkwijze heeft als voordeel dat tijdens het gehele proces in essentie geen anorganische zouten worden gevormd zodat het na de acyleringsreaktie verkregen reaktiemengsel, na
<Desc/Clms Page number 6>
de fysische behandeling, waarbij ammoniak wordt vrijgemaakt en verwijderd, en na de afscheiding van het neergeslagen ss-lactam antibioticum, als zodanig kan worden teruggevoerd naar de acyleringsreaktie. In een dergelijke werkwijze gaan derhalve in essentie geen ss-lactamkern en geen ss-lactam antibioticum verloren.
In de bekende enzymatische acyleringsprocessen waarin de ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van een ester wordt in het algemeen de pH op een constante waarde gehouden door titratie met ammonia waardoor eveneens een mengsel van de ammoniumzouten van het ss-lactam antibioticum en de ss-lactamkern wordt verkregen. Bij voorkeur wordt in een dergelijke werkwijze als acyleringsmiddel een vrije ester gebruikt. Een dergelijke werkwijze kan bij relatief hoge concentraties worden uitgevoerd ; de som van de concentraties van het ss-lactam antibioticum en de ss-lactamkern ligt bijvoorbeeld tussen 200 en 800 mM, bij voorkeur tussen 300 en 600 mM.
Deze voorkeurswerkwijze heeft als voordeel dat tijdens het gehele proces in essentie geen anorganische zouten worden gevormd zodat het na de acyleringsreaktie verkregen reaktiemengsel, na de fysische behandeling, waarbij ammoniak wordt vrijgemaakt en verwijderd, en na de afscheiding van het neergeslagen ss-lactam antibioticum, als zodanig kan worden teruggevoerd naar de acyleringsreaktie. Ook in een dergelijk proces gaan in essentie geen ss-lactamkern en geen ss-lactam antibioticum verloren.
Daarnaast is gebleken dat in een dergelijke werkwijze waarin de winning van het ss-lactam antibioticum wordt toegepast op het reaktiemengsel verkregen na de enzymatische acyleringsreaktei als hierboven beschreven, het enzym vele malen kan worden hergebruikt, zonder dat de aktiviteit sterk afneemt.
De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de voorbeelden zonder evenwel daartoe te worden
<Desc/Clms Page number 7>
beperkt.
Afkortinaen : CEX = cefalexine
EMI7.1
CEX. cefalexine-monohydraat 7-ADCA = aminodesacetoxycefalosporinezuur D-PGA = D-fenylglycineamide D-PG = D-fenylglycine Voorbeeld I
Aan een mengsel van 50 mmol (10, 7 g) 7-ADCA, 50 mmol (18, 2 g) CEX. H2O en 25 mmol D-PGA in 215 ml water werd bij 210C 6 ml 25 massa-% ammonia (78 mmol) toegevoegd. De pH van de heldere oplossing was 7, 92 bij 21 C. Achtereenvolgens werden bij een druk van 12 mm Hg 125 ml afgedestilleerd, 125 ml water toegevoegd, 130 ml afgedestilleerd en 130 ml water toegevoegd. De pH van de resulterende suspensie was 7, 55 bij 21 C.
De CEX werd afgefiltreerd, nagewassen met 2x10 ml methanol en 2x10 ml aceton en gedroogd bij 20 mm Hg/20 C.
Opbrengst : 7, 8 g CEX. H2O als vaste stof. Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 99, 2 massa-% (HPLC).
Voorbeeld II
Als uitgangsmengsel werd toegepast een mengsel verkregen na de enzymatische acyleringsreaktie van 7-ADCA en D-PGA dat 50 mmol (10. 7 g) 7-ADCA, 50 mmol (18, 2 g) CEX. H2O en 25 mmol D-PGA (3, 8 g), 26 mmol D-PG (3, 9 g) 220 ml water, en ammoniak (77 mmol) grotendeels aanwezig als ammoniumzout van CEX. H2O, 7-ADCA en D-PG, bevatte.
De pH van de heldere oplossing was 7, 90 bij 21 C.
Achtereenvolgens werd bij een druk van 12 mm Hg 140 ml afgedestilleerd en 140 ml water toegevoegd. De pH van de resulterende suspensie was 7, 38 bij 21 C.
De CEX werd afgefiltreerd, nagewassen met 2 x 10 ml
<Desc/Clms Page number 8>
methanol en 2 x 10 ml aceton en gedroogd bij 20 mm Hg/20 C. Opbrengst : 8, 7 9 CEX. H2O als vaste stof.
HPLC-analyse : CEX 92, 8 massa-% 7-ADCA 0, 08 massa-% D-PGA 0, 19 massa-% en D-PG 0, 1 massa-%.
Watergehalte : 6, 0 massa-% (Karl-Fischer titratie).
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 7 massa-%.
Voorbeeld III 218, 6 g (zuiverheid : 99%) CEX. H2O, 128, 7 g (zuiverheid : 98, 3%) 7-ADCA, 63, 8 g 25 wt. % NH OH en 2640 g demi-water ; totaal 3051 g werden toegevoegd aan een vacuümkristallisator. De pH bedroeg 8, 06. De temperatuur was 20, 5 C. Er ontstond een heldere vloeistof. De concentraties van CEX. H2O en 7-ADCA waren resp. 195 en 191 mM. Afdamping werd gestart door evacuatie naar 24 mbar (ca. 28 C). Door suppletie van demi-water werd het niveau constant gehouden. De temperatuur van het verwarmingselement werd ingesteld op 45 C. Op deze wijze werd in 65 minuten 3056 g condensaat verzameld (gemiddeld indampsnelheid : 2820 g/uur). Onder deze omstandigheid bedroeg de superficiële dampsnelheid ca. 2 m/s.
Tijdens het indampen trad kristallisatie op. Na het stoppen van de indamping werd de slurry ca. 1 uur nagekristalliseerd.
De eind-pH bedroeg 7, 42 (T = 20, 5 C). De slurry werd zonder problemen gefiltreerd over een glasfilter. Het gewicht van de wetcake bedroeg 197, 1 g.
Na wassing met 3x50 ml aceton en droging gedurende ca. 16 uur bij 300C en een relatieve vochtigheid van 30% werd 110, 1 g CEX. H20 verkregen. Deze stof bestond uit naaldvormige kristallen met een gemiddelde lengte van 150 pm en een gemiddelde diameter van 10-15 pm.
<Desc/Clms Page number 9>
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 4 massa-%.
Voorbeeld IV 218, 6 g (zuiverheid : 99%) CEX. H2O, 130, 8 g (zuiverheid : 98, 3%) 7-ADCA, 64, 9 g 25 wt. % NH OH en 2641 g demi-water ; totaal 3055 g werden toegevoegd aan een vacuümkristallisator. De pH bedroeg 8, 06, de temperatuur bedroeg 20 C. Er ontstond een heldere vloeistof. De concentraties van CEX. H2O en 7-ADCA waren resp. 194 en 194 mM. Afdamping werd gestart door evacuatie naar 22 mbar (ca. 25 C). De temperatuur van het verwarmingselement werd ingesteld op 45 C. Op deze wijze werd in 34 minuten 1602 g condensaat verzameld (gemiddeld indampsnelheid : 2830 g/uur). Onder deze omstandigheid bedroeg de superficiöle dampsnelheid ca. 2 m/s.
Tijdens het indampen trad kristallisatie op.
Vervolgens werd 1500 g demi-water toegevoerd en de indamping hervat. In 21 minuten werd 1437 g condensaat verzameld (gemiddelde indampsnelheid : 4106 g/uur, dampsnelheid ca. 3 m/s).
De eind-pH bedroeg 7, 19 (T = 23, 4 C). De slurry werd zonder problemen gefiltreerd over een glasfilter. Het gewicht van de wetcake bedroeg 197, 9 g.
EMI9.1
Na wassing met 1x100 ml demi-water, 1x100 ml 80 vol% aceton en droging gedurende ca. 16 uur bij 300C en een relatieve vochtingheid van 30% werd 110, 5 9 CEX. H2O verkregen. Deze stof bestond uit naaldvormige kristallen met een gemiddelde lengte van 150 pm en een gemiddelde diameter van 10-15 pm.
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 1 massa-%.