<Desc/Clms Page number 1>
WERKWIJZE VOOR DE WINNING VAN CEFALEXINE
De uitvinding betreft een werkwijze voor de winning van cefalexine uit een mengsel dat cefalexine en 7-aminodesacetoxycefalosporinezuur (7-ADCA) bevat.
Bij de bereiding van cefalexine waarbij 7-ADCA wordt geacyleerd met een D-fenylglycinederivaat, is de winning van het cefalexine en de opwerking van het reaktiemengsel in het algemeen moeilijk. Zo staat bijvoorbeeld beschreven in WO-A-93/12250 dat de acyleringsreaktie nooit volledig verloopt en de uiteindelijke zuivering van het eindprodukt wordt bemoeilijkt doordat de zuur/base eigenschappen en oplosbaarheden van sommige onzuiverheden (in het bijzonder 7-ADCA en fenylglycine zoals beschreven in US-A-4003896) weinig verschillen van die van het eindprodukt. Bijgevolg treedt coprecipitatie op waardoor onzuiver cefalexine wordt verkregen. In WO-A-93/12250 en US-A-4003896 wordt het gebruik van een complexeringsmiddel zoals naftol voorgesteld. Een nadeel hiervan is echter dat een extra procesvreemde stof dient te worden toegevoegd.
Een andere methode om cefalexine zuiver te isoleren uit een mengsel dat cefalexine en geringe hoeveelheden 7-ADCA bevat, wordt beschreven in JP-A- 52111584. Volgens de in deze Japanse publikatie beschreven methode wordt het mengsel dat 7-ADCA en cefalexine bevat onderworpen aan een herkristallisatie in een organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld een mengsel van dichloormethaan, dimethylsulfoxide en een lagere alcohol, in aanwezigheid van een basische component, bijvoorbeeld diisopropylamine.
Deze methode heeft eveneens het nadeel dat procesvreemde stoffen moeten worden toegevoegd. Bovendien treedt bij deze zuivering 18% verlies aan cefalexine op.
<Desc/Clms Page number 2>
Het doel van de uitvinding is een eenvoudige werkwijze te verschaffen die het mogelijk maakt cefalexine zuiver te winnen zonder gebruik te maken van dergelijke procesvreemde organische verbindingen.
Dit wordt volgens de uitvinding bereikt doordat een mengsel dat cefalexine en 7-ADCA bevat met een pH groter dan 7, dat, afgezien van eventueel aanwezige vaste cefalexine, bij een pH tussen 7 en 8, 5 homogeen is, wordt onderworpen aan een pH-verandering tot een pH lager dan 7, 8 is bereikt en de aanwezige vaste stof wordt gewonnen.
Aanvraagster heeft gevonden dat het mogelijk is door de pH van het mengsel te verlagen tot een waarde lager dan 7, 8, bijvoorbeeld tussen 5 en 7, 8, in het bijzonder tussen 6, 0 en 7, 6, afhankelijk van de samenstelling van het reaktiemengsel, cefalexine met een
EMI2.1
zuiverheid groter dan 90 massa-%, in het bijzonder groter dan 98 massa-% te laten uitkristalliseren zelfs wanneer een grote hoeveelheid 7-ADCA in het mengsel aanwezig is, waarna het kan worden gewonnen. In het reaktiemengsel zijn naast cefalexine vaak nog waardevolle componenten aanwezig zoals bijvoorbeeld de 7-ADCA. Om te komen tot een commercieel aantrekkelijk proces is het dan ook van belang tevens de verliezen aan 7-ADCA en cefalexine te minimaliseren.
Gebleken is tevens dat wanneer vervolgens de pH van bovengenoemd reaktiemengsel wordt verlaagd tot een waarde lager dan 6, 5, in het bijzonder tussen 1, 5 en 5, 5, 7-ADCA en de resterende cefalexine nagenoeg volledig uitkristalliseren, waarna dit mengsel van 7-ADCA en cefalexine kan worden gewonnen, bijvoorbeeld door filtratie. Het verkregen mengsel van 7-ADCA en cefalexine kan eventueel worden hergebruikt zodat een werkwijze wordt verkregen waarin zuiver cefalexine wordt verkregen zonder significante verliezen aan 7-ADCA en cefalexine.
De werkwijze volgens de uitvinding is in het bijzonder geschikt om te worden toegepast in de opwerking van het reaktiemengsel dat wordt verkregen na de
<Desc/Clms Page number 3>
enzymatische acyleringsreaktie waarin 7-ADCA wordt geacyleerd met D-fenylglycineamide (PGA) of esters van Dfenylglycine.
Zo kan bijvoorbeeld de werkwijze volgens de uitvinding worden toegepast op een uitgangsmengsel dat wordt verkregen door het reaktiemengsel van een bij relatief hoge pH, bijvoorbeeld een pH tussen 8 en 10, uitgevoerde enzymatische acyleringsreaktie, achtereenvolgens te filtreren, waarbij (geimmobiliseerd) enzym wordt afgescheiden, de pH te verlagen tot een waarde tussen 7, 0 en 8, 5, afhankelijk van het mengsel zodanig dat PG is uitgekristalliseerd en cefalexine nog niet, de gevormde vaste stof, die meestal in hoofdzaak zal bestaan uit D-fenylglycine (PG) dat tijdens de enzymatische reaktie is gevormd, af te scheiden, en de pH eventueel verder te verlagen tot een waarde tussen 7 en 8, 5.
Een andere uitvoeringsvorm is die waarbij als uitgangsmengsel het mengsel wordt toegepast dat wordt verkregen na een enzymatische acyleringsreaktie die eindigt bij een relatief lage pH, bijvoorbeeld een pH tussen 7 en 8, 5, en na afscheiding van de vaste stof welke in hoofdzaak het geimmobiliseerd enzym en D-fenylglycine bevat.
In het uitgangsmengsel dat 7-ADCA en cefalexine bevat kan zich een significante hoeveelheid 7-ADCA bevinden. Meestal is de hoeveelheid 7-ADCA lager dan 75 mol% berekend ten opzichte van de totale hoeveelheid 7ADCA plus cefalexine, bij voorkeur 2-60%, in het bijzonder 5-50%.
Een pH-verlaging kan in het kader van de uitvinding op diverse wijzen worden bewerkstelligd, bijvoorbeeld chemisch door toevoegen van een zuur bijvoorbeeld een mineraal zuur, in het bijzonder zwavelzuur, zoutzuur of salpeterzuur. Een andere mogelijkheid is bijvoorbeeld, wanneer bij de acyleringsreaktie PGA is toegepast als acyleringsmiddel, of wanneer een ester van PG is toegepast en de pH tijdens
<Desc/Clms Page number 4>
de acyleringsreaktie op een constante waarde is gehouden via titratie met ammonia, een pH-verlaging door een fysische verwijdering van ammoniak. Geschikte fysische verwijderingsmethoden zijn bijvoorbeeld een stripbehandeling met stoom of een inert gas ; (stoom) destillatie onder verlaagde druk, in het bijzonder dunnefilm verdamping ; afdampen in een sproeitoren ; gasmembraanscheiding of elektrodialyse.
De optimale pH waarbij cefalexine wordt gewonnen hangt af van de samenstelling van het mengsel en wordt zo gekozen dat een optimale scheiding tussen 7-ADCA en cefalexine wordt verkregen. De optimale pH is in de praktijk een compromis tussen enerzijds hoge zuiverheid van het gewonnen cefalexine die wordt bereikt wanneer de pH waarbij cefalexine wordt gewonnen relatief hoog is zodat de cefalexine nog gedeeltelijk en de 7-ADCA nog volledig in oplossing is ; en anderzijds hoge opbrengst die wordt bereikt wanneer de pH waarbij cefalexine wordt gewonnen relatief laag is zodat de cefalexine nagenoeg volledig is neergeslagen maar waarbij tegelijkertijd ook een deel van de 7-ADCA is neergeslagen. De deskundige is eenvoudig in staat de voor zijn situatie optimale pH vast te stellen.
De temperatuur waarbij de opwerking wordt uitgevoerd ligt meestal lager dan 35OC, bij voorkeur tussen 0 en 30 C, in het bijzonder tussen 10 en 30 C.
Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding voor de winning van zuiver cefalexine in combinatie met recirculatie van het na verdere pHverlaging verkregen mengsel van 7-ADCA en cefalexine, op het mengsel dat verkregen wordt na enzymatische acylering van 7-ADCA met PGA kan in totaal een hoge selectiviteit op 7-ADCA, in het bijzonder groter dan 80%, worden verkregen.
Het resterende filtraat, dat hoofdzakelijk nog geringe hoeveelheden PGA bevat, kan desgewenst verder worden opgewerkt, bijvoorbeeld door het op een pH groter dan 8,
<Desc/Clms Page number 5>
in het bijzonder tussen 8, 5 en 10, te brengen. Desgewenst kan nog worden geconcentreerd en gekoeld tot een temperatuur lager dan 10 C, bijvoorbeeld tussen 0 en 8 C.
Op deze wijze wordt een werkwijze verkregen waarmee zowel 7-ADCA als PGA met hoog rendement kunnen worden toegepast.
In de enzymatische acyleringsreaktie kunnen als acyleringsmiddel bijvoorbeeld PGA of esters van PG worden toegepast.
Als enzym kan in principe elk enzym worden toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreaktie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van Acetobacter, Aeromones, Alcaliqenes, in het bijzonder Alcaliqenes faecalis, Aphanocladium, Bacillus so., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluyvera, Mycoplana, Protaminobacter, Pseudomonas en Xanthomonas, in het bijzonder Acetobacter pasteurianum, Bacillus meoaterium, Escherichia coli en Xanthomonas citrii.
Bij voorkeur wordt een geimmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig afgescheiden en hergebruikt kan worden. Gelmmobiliseerde enzymen zijn op zich bekend en commercieel verkrijgbaar. Bijzonder geschikt zijn gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzyge1e commerciëel verkrijgbaar is en het geimmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati.
De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal lager dan 35OC, bij voorkeur tussen 0 en 28 C. De pH waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 6 en 10, bij voorkeur tussen 6, 5 en 9.
De enzymatische acyleringsreaktie, en de opwerking van het reaktiemengsel wordt in de praktijk meestal uitgevoerd in water. Desgewenst kan het
<Desc/Clms Page number 6>
reaktiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol. %. Voorbeelden van organische oplosmiddelen die kunnen worden toegepast zijn alcoholen met 1-7 C-atomen, bijvoorbeeld een monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol ; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.
In het kader van deze uitvinding kunnen de verschillende componenten in de vrije vorm of als zouten in het reaktiemengsel aanwezig zijn. Met de genoemde pHwaarde wordt steeds de pH-waarde gemeten bij kamertemperatuur bedoeld.
De uitvinding zal verder worden toegelicht aan de hand van de voorbeelden, zonder evenwel daartoe te worden beperkt.
Afkortinqen : CEX = cefalexine
EMI6.1
CEX. O cefalexine-monohydraat 7-ADCA = PGA = D-fenylglycineamide PG = D-fenylglycine Voorbeeld I
Opwerking van een mengsel, verkregen na enzymatische koppeling van 550 mM PGA. HSO, met 410 mM 7ADCA bij 5 C.
Een mengsel van 80 g PGA.1/2H2SO4, 64,2 g 7-ADCA en 425 ml water werd gekoeld tot 50C waarna de pH op 7, 6 werd gebracht met 25 ml 25% NH. OH. De resulterende suspensie (de "voeding") werd toegevoegd aan 190 g nat geimmobiliseerd Pen-G acylase van Recordati (Milaan). Dit enzym is commercieel verkrijgbaar in een mengsel van water en glycerol ("nat enzym"), en werd voor gebruik 3x met 100 ml water gewassen.
Na 2 h roeren (de pH was nu opgelopen tot 8. 35)
<Desc/Clms Page number 7>
werd het reactiemengsel gefiltreerd over een G-3 glasfilter ; het residu werd gewassen met 2 x 50 ml water. Dit residu was een mengsel van enzym en tijdens de reactie gevormd PG.
Het filtraat (een gele oplossing) werd nu voorzichtig aangezuurd tot pH = 7, 2 met geconcentreerd H2SO, (totaal 4 ml). Na 30 min. werd gefiltreerd, gewassen met 3 x 30 ml water en gedroogd, waardoor 40, 8 9 CEX. H2O verkregen werd met een chemische zuiverheid (op watervrije basis) van > 99, 5%.
De moederloog van de CEX-kristallisatie werd opnieuw aangezuurd tot pH = 4, 0 met geconcentreerd HSO (totaal 3, 7 ml). Na 17 h roeren werd gefiltreerd en gewassen met 3 x 20 ml water, waardoor 30. 2 g vaste stof, berekend op watervrije basis, werd verkregen. Deze vaste stof bevatte een mengsel van CEX en 7-ADCA in een molaire verhouding 60 : 40.
Voorbeeld II
Enzymatische koppeling van 500 mM PGA en 500 mM 7-ADCA bij 5 C, gevolgd door opwerking.
Een voeding, bestaande uit 75, 0 g vrij PGA, 109, 2 g 7-ADCA, 10, 0 g PG en 750 ml water werd gekoeld naar 50C en vervolgens toegevoegd aan 150 g nat enzym (dat eerst gewassen was). Na 2 h en 10 min. roeren bij 50C werd het mengsel gefiltreerd (cver een G-3 glasfilter) en werd gewassen met 1 x 100 ml water.
Het resulterende filtraat bevatte de volgende componenten : CEX = 328 mmol 7-ADCA = 161 mmol PG = 75 mmol PGA = 46 mmol.
De conversie op 7-ADCA bedroeg derhalve 66%. Dit mengsel werd als volgt opgewerkt : met behulp van een rotatiefilmverdamper werd bij 200C van het totale mengsel
<Desc/Clms Page number 8>
(971, 4 g) 360 ml afgedestilleerd (in ca. 45-60 min.) waarna 360 ml vers water werd toegevoegd. Deze procedure werd Ix herhaald. De ontstane suspensie werd gefiltreerd over een G-3 glasfilter ; het residu werd nagewassen met koud water (1 x 50 ml) en aceton (2 x 30 ml) en vervolgens 1 nacht gedroogd. Opbrengst : 57, 0 9 witte stof ; het CEXgehalte op watervrije basis bedroeg > 99%.
Het filtraat van de CEX-filtratie (incl. waswaters) werd vervolgens weer gekoeld tot 50C en met behulp van 12 N H2SO, aangezuurd tot pH = 4, 5. Na 2 h roeren werd de suspensie gefiltreerd over een G-3 glasfilter. Opbrengst : 78, 4 g (berekend op watervrije basis) lichtgele stof ; deze stof bevatte een mengsel van CEX en 7-ADCA in een molaire verhouding 75 : 25.