DE19714219A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Aktivitätsbestimmung immobilisierter Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Aktivitätsbestimmung immobilisierter Mikroorganismen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Abbauaktivität von immobilisierten Mikroorganismen.
Mit immobilisierten Mikroorganismen können Fremdstoffe aus Abluft, Abwasser und Böden biologisch abgebaut werden. Zur biologischen Abluftreinigung sind verschiedene Verfahren mit verschiedenen Trägermaterialien für Mikroorganismen im Einsatz. Gängige Apparate sind Biofilter, Biowäscher und Rieselbettreaktoren. Bisher mangelt es an Rahmendaten, die eine leistungsspezifische Auslegung der Apparate gestatten, um die aus industrieller Produktion in die Abluft emittierten, umwelt- und geruchsbelastenden Verbindungen mikrobiell zu eliminieren. Die Dimensionierung von Abluftreinigungs­ anlagen erfolgt derzeit vorwiegend nach VDI-Richtlinie 3477 /1/. Die Effizienz von Abluftreinigungsanlagen wird bestimmt durch die biologische Abbauaktivität und den Reaktortyp. Bisher konnte der Anteil der biologischen Abbauleistung an der Gesamtleistung bezüglich des Stoffüberganges vom Reaktortyp jedoch nicht differenziert werden.
Einen Überblick über die Bestimmungsmethoden der mikrobiellen Aktivität gibt Alef /2/. Die Aktivität von Biomasse kann bestimmt werden durch Methoden wie (i) meist der Atmungsaktivität, (ii) seltener der Aktivität unspezifischer Dehydrogenasen und (iii) der ATP-Konzentration oder (iv) vereinzelt der Wärmebildung mittels Mikrokalorimetrie. Die Bestimmung der Atmungsaktivität ist generell bevorzugt aus physiologischen und apparatetechnischen Gründen. Die Atmungsaktivität kann bestimmt werden mit O2-Elektroden oder mit Respirometern (z. B. Warburg-Apparat, Sapromat).
Zur Messung der Atmungsaktivität von Biofiltermaterial und anderer mikrobiologischer Untersuchungen, bei denen der Sauerstoffverbrauch interessiert, wird bisher meist der Sapromat verwendet. Dieser ist für die Bestimmung des BSB5 von Abwasserproben konzipiert. Die Bestimmung beruht auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs während der Inkubation einer Probe in einem geschlossenen System. Der Sauerstoff wird dem System elektrochemisch nachgeliefert, so daß der Sauerstoff in dem über der Probe befindlichen Gasraum nicht verarmt. Die Messung ist abhängig vom Stoffübergang des Sauerstoffes von der Gasphase in die Flüssigkeitsphase. Der Sapromat besteht aus einem temperaturgeregelten Wasserbad mit den Meßeinheiten, einem Steuergerät und einer Auswerteeinheit, so daß die Messungen kontinuierlich registriert werden können. Der Kaufpreis des Gerätes ist mit derzeit ca. DM 60.000 sehr hoch. Der Einsatz dampfdruckverändernder Prüfsubstanzen ist problematisch, da scheinbare Sauerstoff­ verbrauchsraten gemessen werden können /3/. Daher sind Kontrollen notwendig, die materialaufwendig durch erhöhte Anzahl von Meßplätzen und zeitaufwendig durch Meßvorbereitung sind. Der Prüfvorgang ist langwierig durch stundenlange Meßdauer. Bisher wurden die mit dem Sapromat ermittelten mikrobiellen Atmungsaktivitäten nicht mit der Abbauaktivität der Mikroorganismen korreliert.
Die Atmungsaktivität von suspendierten Mikroorganismen kann in einer Meßkammer (Rank Bros. Ltd., Cambridge, UK) mit integrierter Sauerstoffelektrode nach dem Clark-Prinzip (US patent 2913386) /4/ submers bestimmt werden. Die Bestimmung der substratabhängigen Atmungsaktivität von immobilisierten Mikroorganismen mit Sauerstoffelektroden ist bisher nicht beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Atmungsaktivität von immobilisierten Mikroorganismen unabhängig vom Stoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase einfach, quantitativ, reproduzierbar, und kostengünstig zu bestimmen. Die Meßapparatur soll für den Einsatz dampfdruckverändernder, als auch schwer wasserlöslicher Verbindungen geeignet und transportabel sein. Die Atmungsaktivität soll mit der Abbauaktivität der Mikroorganismen korrelierbar sein. Bei unbekannten Substraten sollen prinzipielle Leistungen der Mikroorganismen erfaßt werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Atmungsaktivität von immobilisierten Mikroorganismen in einer temperierten Meßzelle mit integrierter Sauerstoffelektrode submers gemessen wird. Die Immobilisate werden in einem Trägermaterialbehälter aufgenommen. Der gelöste Sauerstoff wie das Substrat werden homogen durchmischt, indem die Flüssigkeit mit einem Magnetrührkern gerührt und der Trägermaterialbehälter vertikal bewegt wird. Optimal ist eine Hubfrequenz des Behälters von 0.35 s-1 und eine Rührerdrehzahl von 700 rpm. Für die Messung sind eine Polarisationsspannung der Sauerstoffelektrode von 0.78 V und eine Gesamtmeßdauer von 2-10 min geeignet. Die Temperatur der Meßflüssigkeit sollte 30°C betragen. Bei unbekannten Substraten werden prinzipielle Leistungen von Mikroorganismen mit einem Mischsubstrat erfaßt.
Literatur
/1/ VDI 3477. 1991. Biologische Abgas/Abluftreinigung - Biofilter. 12/91. In Verein Deutscher Ingenieure (ed.), VDI-Handbuch Reinhaltung der Luft, VDI-Verlag, Düsseldorf.
/2/ Alef, K. 1991. Bestimmung der mikrobiellen Aktivitäten. In Alef K. (ed), Methodenhandbuch Bodenmikrobiologie, ecomed-Verlag, Landsberg/Lech, pp. 61-148.
/3/ Riis, V., D. Miethe und W. Babel (1996) Störungen durch flüchtige Substanzen bei der Messung des biologischen Sauerstoffverbrauches mit dem Sapromat. Acta hydrochim. hydrobiol. 24: 31-35.
/4/ Clark, L.C. 1956. Electrochemical device for chemical analysis. US patent 2913 386.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand des Ausführungsbeispiels, wie es in der Fig. 1 dargestellt ist, näher erläutert.
Die Meßanordnung besteht aus einer temperierbaren Glasmeßzelle (A) mit einer integrierten polarographischen Sauerstoffelektrode (B), die mit einen Spannungsgeber (C) und einem Schreiber (D) verbunden ist. Trägermaterial mit den daran immobilisierten Mikroorganimen wird in dem Trägermaterialbehälter (E) aus rostfreiem Chromnickelstahl (1.4571) aufgenommen. Der Behälter (E) besteht aus einem Zylinder mit einem Boden und einem anschraubbaren Deckel aus Quadratmaschengewebe. Das Volumen des Trägermaterialbehälters kann durch Einschrauben von Zwischenringen vergrößert werden. Die Flüssigphase mit dem darin gelösten Sauerstoff wird homogen verteilt durch Rühren mit einem Magnetrührkern (F) und durch kontinuierliche Hubbewegung des Trägermaterialbehälters. Das Meßsignal ist proportional zum O2-Partialdruck in der Meßlösung. Der Behälter wird durch eine Kolbenstange (G), die an eine rotierende Scheibe (H) gekoppelt ist, vertikal bewegt. Der Antrieb erfolgt durch einen Motor (I), dessen Drehzahl über einen Motorregler (K) eingestellt werden kann. Die Hubamplitude und die Hubfrequenz sind stufenlos verstellbar. Die luftblasenfrei gefüllte Meßkammer wird über einen Stempel (L) mit kapillarem Steigrohr einschließlich einer Injektionsöffnung (M) nach außen hin abgeschlossen. Das Meßvolumen ist durch Veränderung der Stempelhöhe variierbar.
Der Meßansatz beeinhaltet sauerstoffgesättigten, geeigneten Puffer, z. B. 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.2 und an Trägermaterial immobilisierte Mikroorganismen. Gemessen wird die Atmungsaktivität bei 30°C. Das Substrat wird in geeigneter (mM) Konzentration eingesetzt. Die substratabhängige Sauerstoffverbrauchsrate (v) wird aus dem Volumen des Puffers (Pv), dessen Sauerstoffkonzentration und der linearen pO2-Abnahme über die Zeit bestimmt (Gleichung 1).
Die spezifische Aktivität wird ausgedrückt als verbrauchter Sauerstoff pro Gewichteinheit Protein, die volumetrische Aktivität wird auf das Schüttvolumen des verwendeten Trägermaterials bezogen.
Mit der beschriebenen Apparatur wurden die Atmungsraten von Mischkulturen zum Abbau von n-Butanol, Toluol und Dichlormethan, die auf Tongranulat, Polyamid-Kugeln, gesintertem Styropor oder Aktivkohle immobilisiert waren, vermessen. Dazu wurden bis zu 10 cm3 bewachsenes Trägermaterial und 8 mM n-Butanol oder 5 mM Toluol oder 5 mM Dichlormethan eingesetzt. Ebenfalls wurden die Atmungsaktivitäten von bis zu 150 cm3 Biofiltermaterial aus industriellen Abluftreinigungsanlagen mit einem Mischsubstrat aus je 2 mM Glukose, Succinat, Pyruvat, Laktat und Acetat bestimmt. Spezifische Atmungsraten bis zu 1.2 µmol O2 min-1 mg Protein-1 wurden gemessen. Die volumetrischen Atmungsraten der Mikroorganismen korrelierten mit den spezifischen Abbauraten gemäß der Beladung des Trägermaterials mit den immobilisierten Mikroorganismen.
Die erzielten Vorteile der Erfindung sind:
  • - Mit dem entwickelten Meßverfahren kann über die Atmungsaktivität von immobilisierten Mikroorganismen deren Abbauaktivität bestimmt werden.
  • - Die Immobilisate werden in einem Trägermaterialbehälter aufgenommen und werden durch dessen Bewegung sowie durch Rühren der Meßlösung mit einem Magnetrührkern homogen mit dem in der Meßlösung gelösten Sauerstoff und dem Substrat durchmischt.
  • - Der Stoffübergang gas-flüssig/flüssig-gas entfällt, da das Substrat der Flüssigphase zugegeben wird, in der der Sauerstoff gelöst vorliegt.
  • - Die Meßergebnisse sind quantitativ und reproduzierbar innerhalb von 2-10 min zu ermitteln.
  • - Dampfdruckverändernde, als auch schwer wasserlösliche Verbindungen können als Substrate eingesetzt werden.
  • - Die gesamte Meßeinheit ist transportabel und kostengünstig in der Anschaffung.
Mit dem vorgestellten Meßsystem zur Bestimmung der mikrobiellen Atmungsaktivität erzielte Ergebnisse sind im Anlagenbau für die Dimensionierung von Abluftreinigungsanlagen bedeutungsvoll. Ebenfalls kann das Meßverfahren zur Überwachung von Anlagen zur biologischen Abluftreinigung eingesetzt werden. Im Rahmen mikrobiologischer Verfahren zur Sanierung von Böden ist die Abbauaktivität neben der chemischen Analyse des Schadstoffes direkt nachprüfbar. Die mikrobiologische Atmungsaktivität aus Bodenproben ist bestimmbar.

Claims (9)

1. Verfahren und Vorrichtung zur Aktivitätsbestimmung immobilisierter Mikroorganis­ men, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobielle Atmungsaktivität submers be­ stimmt wird in einer temperierbaren, luftblasenfrei verschließbaren Meßzelle mit inte­ grierter Sauerstoffelektrode und mit homogener Durchmischung der in einem Trägerma­ terialbehälter aufgenommenen Immobilisate mit dem in der Meßlösung gelösten Sauerstoff und dem Substrat mittels Bewegung der fixierten Biomasse.
2. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mi­ krobielle Atmungsaktivität unter Substratsättigung (nach Michaelis-Menten) gemessen wird.
3. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß flüchtige, schwer wasserlösliche und leicht wasserlösliche Verbindungen beziehungsweise Misch­ substrate eingesetzt werden.
4. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meß­ zelle aus Glas gefertigt ist.
5. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewe­ gung des Trägermaterialbehälters eine Auf- und Abwärtsbewegung ist.
6. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hub­ frequenz und die Hubamplitude des Trägermaterialbehälters stufenlos verstellbar sind.
7. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Im­ mobilisate zusätzlich durch Rühren mit einem Magnetrührkern mit Meßlösung durch­ mischt werden.
8. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Meß­ volumen variiert werden kann.
9. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Trä­ germaterialbehälter modular aufgebaut ist und das Volumen verändert werden kann.
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