FI95044C - Uudet immobilisoidut biokatalysaattorit sekä niiden valmistus ja käyttö - Google Patents

Description

95044

Uudet, immobilisoidut biokatalysaattorit sekä niiden valmistus ja käyttö -

Nya immobiliserade biokatalysatorer samt deras fram-ställning och användning Tämä keksintö koskee uusia, immobilisoituja, veteen liukenemattomia hienojakoisessa muodossa olevia biokata-lysaattoreita, jotka sisältävät eläviä soluja, ja niiden valmistusta ja käyttöä.

US-patentissa nro 3,838,007 esitetään menetelmä veteen liukenemattoman entsyymikoostumuksen valmistamiseksi puoli jähmeässä tai jähmeässä, hienojakoisessa muodossa, suspendoimalla ei-proteolyyttinen entsyymi geelin muodostavan proteiinin vesipitoiseen liuokseen, saatu seos yhdistetään orgaanisen, veteen huonosti sekoittuvan tai veteen sekoittumattoman nesteen kanssa suspension muodostamiseksi hienojakoisessa muodossa, muodostunut suspensio käsitellään geelin muodostavan proteiinin geeliyttämiseksi ja muodostuneet, geeliytyneet proteiinihiukkaset saatetaan kosketukseen ristikytkentäaineen kanssa. Geelin muodostava proteiini, joka on mieluimmin gelatiini, on välttämätön entsyymien saattamiseksi veteen liukenemattomaan, hienojakoiseen muotoon halutunkokoisiksi partikkeleiksi, ja se myös stabilisoi entsyymin. Orgaaniset nesteet, joita käytetään saatettaessa vesipitoinen entsyymin ja geeliä muodostavan proteiinin sisältävä liuos hienojakoiseen muotoon, ovat mm. neljä tai useamman hiiliatomin sisältävät alifaattiset alkoholit, kuten butanoli, alkoholien ja alempien rasvahappojen esterit, kuten etyyliasetaatti, butyyliasetaatti ja etyylipropionaatti. Lopuksi mainitaan useita ei-proteolyyttisiä entsyymejä, jotka voidaan saattaa liukenemattomaan, hienojakoiseen muotoon. Mainittua koostumusta hienojakoisessa muodossa voidaan käyttää pylväs- ja kerrosreaktoreissa entsymaattisille reaktioille ja erityisen käyttökelpoinen se on niissä re 2 95044 aktioissa, joissa lopullinen tuote ei voi sisältää käytettyä entsyymiä.

Alan ammattimiehelle on selvää, että elävät solut, esimerkiksi leivinhiiva (Saccharomyces cerevisiae) kuolevat nopeasti orgaanisten liuottimien vaikutuksesta, jollaisia käytetään menetelmässä, joka esitetään US-paten-tissa nro 3,838,007. Useita orgaanisia liuottimia on esitetty autolyysin aloittamiseksi hiivassa. Etyyliasetaattia käytetään esimerkiksi leivinhiivan käsittelyssä valmistettaessa kiteistä sytokromi c:tä, Nature 178 (1956), 629-630 ja beta-fruktofuranosidaasia, J. Bacteriol. 112 (1972), 1346-1352.

Hough ja Lyons, Nature 235 (1972) 389 havaitsivat, että menetelmät entsyymien tekemiseksi liukenemattomiksi kovalenttisella sidoksella, olivat melko voimakkaat eläville organismeille niin, että he pitivät erittäin epätodennäköisenä, että nämä elävät organismit säilyisivät elinvoimaisina, jos niitä käytettäisiin kantoaineina. Silloin he esittivät menetelmän tiettyjen entsyymien ko-valenttiselle kytkennälle eläviin kantoaineisiin, nimittäin useisiin Saccharomyces cerevisiae-kantoihin, käyttäen titaanisuoloja ja muita epäorgaanisia suoloja kytken-täaineina. Tämä kytkentätekniikka oli muunnos alkuperäisestä tekniikasta, jonka on esittänyt Barker et ai., julkaisussa Process Biochem. 6. (1971), 11.

Saksalaisessa hakemusjulkaisussa 28 05 607, sivu 9, rivit 13-17, viitattiin julkaisuun Process Biochem. no. 7 (1972), 9-12, jossa esitettiin mikro-organismien sulkemista selluloosa-triasetaatti-kuituihin, käyttämällä liuottimina tolueenia tai metyleenikloridia. Mainitussa . saksalaisessa hakemus julkaisussa todettiin, että nämä liuottimet ovat hyvin myrkyllisiä, niin että mikro-organismien regeneraatio kasvattamalla kantoainematriisissa on tuskin mahdollista.

Vielä vähän aikaa sitten Haegerdal ja Mosbach, Food 3 95044

Process Eng., Proc. Int. Congr., 2nd 1979 (Pub. 1980) 2, 129-32, (vrt. Chemical Abstracts j)4 (1981) 119457k) kuvasivat leivinhiivan ko-immobilisaatin beta-glukosidaasin kanssa, jota oli tutkittu pienessä pylväsreaktorissa etanolin tuottamiseksi sellobioosista. Entsyymi oli kova-lenttisesti sitoutunut alginaattiin ja sen jälkeen lei-vinhiivasolut suljettiin myös (co-entrapped) tähän valmisteeseen alginaattigeelissä, mutta näiden elävien solujen kanssa ei käytetty orgaanista liuotinta eikä risti-kytken täainetta.

Kalsiumalginaatin haittana on se, että se on pysymä-tön fosfaatti-ionien tai muiden kelatoivien aineiden läsnäollessa. Elävissä soluissa fosfaattisuolat ovat välttämättömiä ravintoaineita, niin että tällaiset alginaatti-kantoaineet eivät ole sopivia käytettäväksi useimmissa immobilisoiduissa systeemeissä, jotka sisältävät elinvoimaisia soluja.

Eurooppalainen patenttihakemus EP-A-0 041 610 koskee ko-immobilisaatteja yhdessä entsyymien kanssa, joissa entsyymit on kytketty eläviin, käymiskykyisiin hiivaso-luihin niiden ympäroimiseksi suoraan. Nämä ko-immobili-saatit valmistetaaan poistamalla hiivasoluista vettä, vesipitoisen entsyymiliuoksen avulla liitetään uudestaan vettä, lisätään entsyymiä saostavaa ainetta, joka ei vaikuta hiivasolujen käymiseen ja mielellään lisätään vielä ristikytkentäainetta. Näiden ko-immobilisaattien valmistuksessa ei käytetä orgaanista liuotinta eikä dispergoi-vaa ainetta. Ko-immobilisaatit ovat sopimattomia käytettäväksi pylväsreaktoreissa ja vastaavissa, koska niistä puuttuu kantoainematriisi.

. Kaikki nämä viitteet opettavat, että ei tulisi käyt tää orgaanisia liuottimia ja erityisesti tolueenia, buta-nolin, butyyliasetaatin ja etyyliasetaatin tyyppisiä liuottimia valmistettaessa immobilisoituja, eläviä solukoos-tumuksia, joissa on jäljellä niiden fermentaatio- ja li- 4 95044 sääntymi skyky.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tuottaa immobilisoi-tuja, veteen liukenemattomia, halutun kokoisessa, hienojakoisessa muodossa olevia biokatalysaattoreita, jotka sisältävät eläviä soluja, ja joita voidaan käyttää erilaisiin tarkoituksiin, esimerkiksi pylvään täytteinä, leijukerrosreaktoreissa ja sekoitustankkireaktoreissa.

Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä mainittujen immobilisoitujen, veteen liukenemattomien partikkeleiden valmistamiseksi melko lievissä olosuhteissa (t.s. olosuhteet partikkeleissa, eroten ympäröivistä orgaanisista liuottimista, joihin suspensiot extrudoidaan) niin, että oleellinen osa elävistä soluista voi säilyä elossa tai voidaan regeneroida immobilisäätion jälkeen.

Nämä ja muut keksinnön kohteet ja edut käyvät ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Laajan tutkimuksen ja kokeilun jälkeen yllättävällä tavalla huomattiin, että elävien solujen elinvoimaisuuteen ja erityisesti elävien mikrobisolujen, esimerkiksi hiivojen elinvoimaisuuteen ei vaikuta haitallisesti se, että solut saatetaan kosketukseen orgaanisen, veteen huonosti liukenevan tai siihen liukenemattoman nesteen kanssa, jos elävät solut suspendoidaan geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen.

Näin ollen tämä keksintö koskee immobilisoitua, ve-teen liukenematonta, hienojakoisessa muodossa olevaa bio-katalysaattoria, joka sisältää eläviä soluja dispergoitu-na ristikytkettyyn geelinmuodostusaineeseen.

Tässä julkaisussa käytetyllä käsitteellä "elävät solut" on ymmärrettävä tarkoitettavan soluja, joilla on ky-. ky suorittaa lukuisia metabolisia (tai anabolisia) reak tioita, jotka ovat mahdollisia ainoastaan, jos mainitut solut säilyttävät rakenteellisen entiteettinsä. Esimerkkejä tällaisista reaktioista ovat energian synnyttäminen (ATP), solun aineosien uudelleenkierrättäminen ja solun

II

• s 95044 lisääntyminen.

Tässä julkaisussa käytettyä käsitettä "hienojakoinen muoto" tulisi tulkita laajassa mielessä. Hienojakoinen muoto voi olla pallomaisten tai melkein pallomaisten partikkelien muoto, mutta vaikka selityksessä yleensä tarkoitetaan näitä pallomaisia tai melkein pallomaisia partikkeleita, hienojakoinen muoto voi olla myös esimerkiksi kuitujen, esim. ekstrudoitujen kuitujen, valetun kalvon, astioiden päällysteen ja kyllästetyn kudoksen tai paperin muoto. Yleisesti "hienojakoinen muoto" tarkoittaa keksinnön mukaisen koostumuksen muotoa, jolla on määritelty, haluttu koko.

Tässä käytetyllä käsitteellä "geelinmuodostusaine" tarkoitetaan ainetta, jonka vesipitoinen liuos voidaan muuttaa jähmeään tai puolijähmeään tilaan tietyllä käsittelyllä, esim. jäähdyttämällä, käytettäessä gelatiinia tai agaria. Sopivia geelinmuodostusaineita keksinnön tarkoituksiin ovat esimerkiksi gelatiini, geelin muodostavan polyhiilihydraatin, kuten agarin ja vapaita aminoryhmiä sisältävän polymeerin, kuten kitosaanin, joka pystyy risti kytkeytymään sopivan bi- tai polyfunktionaalisen risti-kytkentäaineen kanssa, ja gelatiinin ja tällaisten yhdisteiden seokset. Gelatiini ja gelatiinin ja kitosaanin seokset ovat edullisia geelinmuodostusaineita.

Esimerkkejä sopivista ristikytkentäaineista tämän keksinnön tarkoituksiin ovat esimerkiksi glutardialdehy-di, joka on edullinen, ja parkkihappo.

Sopivia eläviä soluja immobilisoiduiksi, veteen liukenemattomiksi , keksinnön mukaisiksi biokatalysaattoreik-si ovat esimerkiksi mikrobisolut ja eläinten ja korkeampien kasvien solut. Sopivia eläviä mikrobisoluja, jotka ovat edullisia, ovat hiivat ja bakteerit, kuten Saccharo-myces cerevisiae (esim. leivinhiiva) ja Acetobacter-lajit (esim. Acetobacter pasteurianum ), Clostridium (esim. Clostridium butyricum, Clostridium thermocellum ja Clostri- 6 95044 dium acetobutylicum), Klebsiella ja Lactobacillus (esim. Lactobacillus bavaricus). Sopivia eläviä kasvisoluja ovat esimerkiksi solut, jotka kuuluvat Taqeter muuta-lajeihin .

Tämän keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti immobilisoidut, veteen liukenemattomat biokatalysaat-torit voivat myös sisältää yhden tai useamman entsyymin, erityisesti ei-proteolyyttisen entsyymin. Kun entsyymi liitetään biokatalysaattoriin, sen täytyy tietysti olla yhteen sopiva elävien solujen kanssa ja geelinmuodostus-aineen kanssa. Esimerkkejä entsyymeistä, joita voidaan sisällyttää keksinnön mukaisiin biokatalysaattoreihin, ovat esimerkiksi amyloglykosidaasi, laktaasi, maltaasi, amylaasi, glukoosi-isomeraasi, pullulanaasi, invertaasi, lipaasi, esteraasi, glukoosioksidaasi ja dehydrogenaasi. Voidaan käyttää myös entsyymien seoksia.

Proteolyyttisiä entsyymejä voidaan myös käyttää tietyissä olosuhteissa, jotka ovat alan ammattimiehelle selvät. Esimerkiksi proteolyyttisten entsyymien käyttöä tulisi välttää, kun geelinmuodostusaine on proteiini, kuten gelatiini, koska proteolyyttisesti aktiiviset entsyymit hajottaisivat geelinmuodostusproteiinin ja muodostuisi fysikaalisesti hyvin pysymättömiä tuotteita.

Edelleen erään tämän keksinnön suoritusmuodon mukai-; sesti immobilisoidut, veteen liukenemattomat biokataly- saattorit voivat vielä sisältää kahden- tai useammantyyp-pisiä eläviä soluja, mahdollisesti yhdessä yhden tai useamman entsyymin kanssa.

Tämän keksinnön mukaiset, immobilisoidut, veteen liukenemattomat biokatalysaattorit hienojakoisessa muodossa ovat erityisen käyttökelpoisia pylväsreaktoreissa, esimerkiksi leijukerrosreaktoreissa, tai sekoitustankkireak-toreissa, jatkuvissa biokatalyyttisissä reaktioissa. Sopivasti näitä biokatalysaattoreita voidaan käyttää tiettyjen hiilihydraattien muuttamisessa, kuten muutettaessa 95044 7 ologosakkaridit nesteytetystä tärkkelyksestä etanoliksi, muutettaessa laktoosi (esimerkiksi herassa) maitohapoksi tai etanoliksi ja muutettaessa sellobioosi etikkahapoksi, itakonihapoksi tai sitruunahapoksi. Sopivia, immobilisoi-tuja, keksinnön mukaisia biokatalysaattoreita ovat sellaiset, jotka sisältävät Saccharomyces cerevisiae1 n, glyserolin tuottamiseksi yhdessä etanolin kanssa, joka on sivutuote, tai yhdessä esimerkiksi laktaasin kanssa heran muuttamiseksi etanoliksi, tai jotka sisältävät Zymomonas mobilisin etanolin tuottamiseksi jatkuvasti ja nopeasti nesteytetystä tärkkelyksestä. Edullisia, immobilisoituja, veteen liukenemattomia biokatalysaattoreita ovat sellaiset, jotka sisältävät Saccharomyces cerevisiae1n, mahdollisesti amyloglykosidaasin kanssa, tällainen yhdistelmä on erityisen käyttökelpoinen fermentoinnissa etanolin tuottamiseksi nesteytetystä tärkkelyksestä, esim. deks-triinistä, ja vähäkalorisen oluen valmistuksessa. Muita sopivia keksinnön mukaisia biokatalysaattoreita ovat im-mobilisoidut organismit, jotka tuottavat mono-oksidaaseja hiilivetyjen muuttamiseksi ketoneiksi tai hapoiksi (esim. Clostridium-, Klebsiella- ja Aerobacter-laiit), immobili-soidut ligninaasia tuottavat organismit paperin valmistuksessa muodostuvien sulfiittiliemien käsittelemiseksi (esim. Coriolus-, Phanerochaete-, Sporotrichum- ja Strep-tomyces-la jit), immobilisoidut organismit, jotka tuotta-vat entsyymejä, jotka katalysoivat spesifisiä reaktioita tietyntyyppisten farmaseuttisesti aktiivisten yhdisteiden valmistuksessa (esim. Curvularia-, Mycobacterium- ja Pseudomonas-lajit, käyttökelpoisia esim. steroidien ja optisesti aktiivisten isomeerien valmistuksessa), immobilisoidut Acetobacter-lajit etikkahapon tuottamiseksi tärkkelyksestä tai glukoosista, ja immobilisoidut hybri-domasolut monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi .

Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti « 8 95044 edellä mainitut, immobilisoidut, veteen liukenemattomat biokatalysaattorit voidaan valmistaa menetelmällä, joka sisältää seuraavat vaiheet: (a) elävät solut suspendoidaan geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen, (b) näin saatu seos yhdistetään orgaanisen, veteen huonosti liukenevan tai siihen liukenemattoman nesteen kanssa vesipitoisten, elävät solut ja geelinmuodostusaineen sisältävien partikkelien suspension muodostamiseksi orgaaniseen nesteeseen, (c) suspensio käsitellään partikkelien sisältämän geelinmuodostusaineen geeliyttämiseksi, (d) kohdassa (c) saadut partikkelit käsitellään bi-tai polyfunktionaalisella ristikytkentäaineella partikkeleissa läsnäolevien polymeerien ristiinkytkemiseksi, ja (e) vaiheessa (d) saaduista partikkeleista poistetaan ainakin osa niiden sisältämästä vedestä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä on useita etuja, jotka tekevät sen erittäin huomionarvoiseksi teollisen käytön kannalta. Esimerkiksi se on yksinkertainen, niin että prosessia voidaan kunnolla kontrolloida. Saadut partikkelit ovat tasaisesti jakaantuneita ja homogeenisia.

Ne ovat tavallisesti puoli jähmeässä tai vielä mieluummin jähmeässä muodossa. Ekstrudoimalla butyyliasetaattiin tai : tolueeniin immobilisaatiomenetelmä on myös aseptinen.

Geelinmuodostusaine on edullisesti gelatiini tai seos, joka muodostuu pääasiassa gelatiinista ja kitosaa-nista ja joka myös stabilisoi mitkä tahansa biokataly-saattoriin liitetyt entsyymit.

Elävien solujen, entsyymin ja geelin muodostusaineen seos hienojakoisessa muodossa valmistetaan mieluimmin suspendoimalla elävät solut ja mahdollisesti entsyymi geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen ja yhdistämällä tämä seos veteen huonosti liukenevan tai siihen liukenemattoman orgaanisen nesteen kanssa, niin että saa

It • 9 95044 daan hienojakoinen muoto ja muodostunut suspensio hienojakoisessa muodossa käsitellään siten, että tapahtuu gee-linmuodostusaineen geeliytyminen, kuten esim. jäähdyttämällä, kun geelinmuodostusaineena on gelatiini. Elävät solut, mahdollisen entsyymin ja geelinmuodostusaineen sisältävän seoksen yhdistäminen orgaaniseen nesteeseen voidaan suorittaa sekoittamalla kontrolloiduissa ravistus-olosuhteissa tai upposuihkuttamalla elävien solujen, entsyymin ja geelinmuodostusaineen seos orgaaniseen nesteeseen. Viimeksi mainittu menetelmä voidaan suorittaa pystysuorassa kolonnissa, jossa muodostuneet partikkelit liikkuvat alaspäin orgaanisessa nesteessä, joka voi sisältää ristikytkentäaineen.

Eläviä soluja, mahdollisen entsyymin ja geelinmuodostusaineen seoksen ristiinkytkentä voidaan suorittaa erottamalla seos hienojakoisessa muodossa orgaanisesta nesteestä ja käsittelemällä se ristikytkevällä, bi- tai po-lyfunktionaalisella aineella. Vaihtoehtoisesti eräissä tapauksissa, esimerkiksi Clostridium-solui11a, seos hienojakoisessa muodossa suspendoituna orgaaniseen nesteeseen voidaan käsitellä mainitulla aineella. Kun halutaan liittää entsyymi biokatalysaattoriin, entsyymi voidaan lisätä geeliytyneeseen suspensioon ristikytkentävaihees-sa. Immobilisoidut elävät solut voidaan sen jälkeen ha-: luttaessa aktivoida uudelleen ja kasvattaa.

Ristikytkentävaiheen jälkeen saatavat partikkelit kuivataan, niin että ne voidaan sopivalla tavalla varastoida ja pakata. Ennen käyttöä partikkeleihin tavallisesti lisätään vettä ja immobilisoituja eläviä soluja mahdollisesti kasvatetaan.

Elävien solujen, entsyymin ja geelinmuodostusaineen seos, jota käytetään menetelmässä lähtöaineena, voidaan valmistaa suspendoimalla elävät solut ja mahdollisesti entsyymi geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen. Vesipitoisen geelinmuodostusliuoksen lämpötilan tulisi • ίο 95044 olla sellainen, että aktiivinen seos saadaan nestemäisessä muodossa. Sen vuoksi lämpötila noin 25°C - noin 40°C on edullinen, maksimilämpötilan riippuessa käytettyjen, elinvoimaisten solujen lämmönkestävyydestä (termotole-ranssista).

Liuoksen gelatiini riippuu käytetystä, spesifisestä gelatiinista ja voi vaihdella välillä noin 0,1 - noin 25 % painosta, laskettuna käytetystä vedestä, mieluimmin se on välillä noin 5 - 10 % painosta. Elävien solujen ja entsyymin (entsyymien) konsentraatio riippuu tarkoituksesta, johon liukenematonta biokatalysaattoria tullaan käyttämään sekä sen aktiivisuudesta. Käytettäessä gelatiinin ja kitosaanin seosta, kitosaanin konsentraatio voi vaihdella välillä noin 0,05 - noin 10 % painosta, laskettuna käytetystä vedestä, mieluimmin se on välillä noin 0,1 - noin 1 % painosta. Liuoksen pH on mieluimmin sellainen, jossa soluilla on niiden suurin stabiilisuus käytetyissä olosuhteissa, mutta kun läsnä on myös gelatiinia, pH:n tulisi olla noin 2 - 12, mieluimmin 3 - 10, jotta gelatiini pystyy geeliytymään. Muilla geelinmuodos-tusaineilla pH-alue voi olla eri.

Elävien solujen, entsyymin ja geelinmuodostusaineen seoksen valmistuksen kuluessa voidaan lisätä stabilisaat-toreita, jotka geelinmuodostusaineen lisäksi stabiloivat : eläviä soluja ja/tai entsyymejä, silloin kun niitä seok sessa on. On todettu, että periaatteessa myös kylmää vettä voitaisiin käyttää orgaanisen nesteen sijasta, mutta havaittu, että tämä menetelmä ei johda tyydyttäviin tuloksiin. Esimerkkejä stabilisaattoreista, jotka ovat käyttökelpoisia keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat sorbitoli, glyseroli, elävien solujen metaboloitumattomat substraatit ja käytetyt entsyymit.

Orgaaninen neste, jota käytetään elävien solujen, entsyymin ja geelinmuodostusaineen vesipitoisen liuoksen tai suspension hienojakoisen muodon saavuttamiseksi, on u 95044 veteen huonosti liukeneva tai liukenematon orgaaninen neste. Esimerkkejä sopivista nesteistä ovat 4 tai useamman hiiliatomin sisältävät alifaattiset alkoholit, esim. alkanolit, kuten butanoli; alkoholien ja alempien rasvahappojen esim. Ci_4-alkaanihappojen esterit, kuten etyyliasetaatti, butyyliasetaatti ja etyylipropionaatti, haarautuneet tai suoraketjuiset alifaattiset hiilivedyt, kuten parafiiniöljy, bensiini ja petrolieetteri, aromaattiset hiilivedyt, kuten bentseeni ja sen homologit, klooratut hiilivedyt, kuten metyleenikloridi ja triklooriety-leeni ja kahden tai useamman edellä mainitun nesteen seokset. Näistä butyyliasetaatti on edullinen, ennen muuta koska se saadaan yksinkertaisilla ja taloudellisesti edullisilla talteenottomenetelmillä.

Ravistelutapa, jota käytetään yhdistettäessä vesipitoinen, elävät solut, mahdollisesti entsyymin ja geelin-muodostusaineen sisältävä seos ja orgaaninen neste, muodostuneen suspension jäähdytysmenetelmä (käytettäessä gelatiinia) voi olla mikä tahansa, jolla saadaan vesipitoinen elävät solut, mahdollisesti entsyymin ja geelinmuo-dostusaineen sisältävä seos jaettuna halutun kokoisiin partikkeleihin. Saatujen partikkelien koko riippuu sekoi-tusvoimakkuudesta, erosta nesteiden ominaispainossa, nesteiden pintajännityksestä ja viskositeetista ja eräissä i tapauksissa jäähdytysnopeudesta, alkuperäisen vesipitoi sen, elävät solut, mahdollisesti entsyymin ja geelinmuo-dostuaineen sisältävän liuoksen tai suspension lämpötilasta ja konsentraatiosta. Yleensä sekoitus on riittävä, mutta muita menetelmiä suspension muodostamiseksi voidaan käyttää, kuten elävät solut, mahdollisen entsyymin ja geelinmuodostusaineen sisältävän seoksen suihkuttamista orgaaniseen nesteeseen. Elävät solut, entsyymin ja gelatiinin sisältävän seoksen, joka on orgaanisessa nesteessä, jäähdyttäminen esim. alle noin 10°C tai tämän alle ja jopa alle mainitun seoksen jäätymispisteen, voidaan tehdä « 12 95044 samanaikaisesti tai sen jälkeen kun seoksen suspensio orgaaniseen liuokseen on muodostunut, ja jäähdyttäminen voidaan suorittaa nopeasti tai hitaasti.

Ristikytkentävaihe suoritetaan bi- tai polyfunktio-naalisella ristikytkentäaineella, joka muodostaa kova-lenttisia sidoksia aminoryhmiä sisältävien polymeerien kanssa. Esimerkkejä sopivista bifunktionaalisista risti-kytkentäaineista ovat glutardialdehydi ja parkkihappo.

Keksinnön mukainen suoritusmuoto käsittää veden poistamisen (dehydrataatio) partikkeleista ennen ristikytken-tävaihetta. Veden poistaminen pienentää saatujen partikkelien kokoa ja saadaan parannettu ristikytkentäreaktio, kun nämä kutistuneet hiukkaset lisätään bi- tai polyfunk-tionaalisen ristikytkentäaineen vesipitoiseen liuokseen.

Vedenpoistovaihe suoritetaan mieluimmin kutistamalla partikkelit osmoottisesti esimerkiksi sorbitolilla tai glyserolilla. Ristiinkytkevä, bi- tai polyfunktionaalinen ristikytkentäaine voidaan lisätä tähän nesteeseen tai se voidaan käyttää partikkeleihin vedenpoistovaiheen jälkeen. Vedenpoistovaihe voidaan suorittaa myös sen jälkeen kun partikkelit on erotettu suspensiovaiheessa käytetystä orgaanisesta nesteestä.

Liukenemattomia täyteaineita (fillers) voidaan lisätä solut, mahdollisen entsyymin ja geelinmuodostuaineen sisältävään, menetelmässä käytettävään seokseen, koska ne voivat parantaa lopullisen hienojakoisen muodon fysikaalisia ominaisuuksia* Esimerkkejä sopivista liukenemattomista täyteaineista ovat hienojakoiset silikaatit tai si-likonioksidit, kuten KETJENSIL (synteettinen silikoniok-sidi), HYFLO, DICALITE, piimää, jne.

Keksinnön mukaiset immobilisoidut biokatalysaattorit voidaan myös päällystää suhteellisen raskailla aineilla, esim. zirkoniumoksidijauheella, jolloin partikkeleille saadaan enemmän painoa, niin että voidaan saada suurempi pintanestenopeus leijukerrosreaktoreihin, mikä johtaa 13 95044 korkeampaan happikonsentraatioon.

Lopuksi solut, mahdollisen entsyymin ja geelinmuodos-tusaineen sisältävät valmisteet, jotka saadaan menetelmällä hienojakoisessa muodossa, mielellään pestään. Esimerkkejä sopivista pesunesteistä ovat vesi tai puskuroidut liuokset, joiden pH-arvo riippuu biologisesta aktii-viaineesta. Yleensä hienojakoisessa muodossa olevan valmisteen kuivaaminen on edullista.

Keksinnössä käytettävä geelinmuodostusaine, kuten gelatiini on polyelektrolyytti, joka mahdollisesti vaikuttaa minkä tahansa läsnäolevan entsyymin näennäiseen pH-optimiin, t.s. pH-arvoon, jossa entsyymillä on sen korkein aktiivisuus. Lisäksi partikkeleihin voidaan sisällyttää muita yhdisteitä, jotka vaikuttavat entsyymin näennäiseen pH-optimiin, kuten muita polyelektrolyyttejä, joista esimerkkejä ovat protamiinisulfaatti ja polyakryy-lihappo, täten esimerkiksi sopeuttaen elävät solut, entsyymin ja geelinmuodostusaineen sisältävien partikkelien näennäisestä pH-optimia niiden tulevaa käyttötarkoitusta varten.

Eräs hiivan immobilisaatiossa ilmenevä käytännön ongelma on se, että tavanomaisella tavalla käytettävän hiivan käymisominaisuudet muuttuvat ennalta arvaamattomalla tavalla, kun hiiva immobilisoidaan, ja että toivottavat käymisominaisuudet, jotka havaitaan tavanomaisissa fer-mentointi-oloissa, eivät välttämättä säily, kun sama hiiva immobilisoidaan. On myös havaittu, että hiivan käymisominaisuudet vaihtelevat ennakolta aavistamattomalla tavalla riippuen siitä käytetäänkö hiivaa panosfermentoin-nissa vai jatkuvassa fermentoinnissa.

Jatkuvan fermentoinnin käyttämiseksi panimoteollisuudessa esiintyy huomattavaa mielenkiintoa, ja paljon tutkimus- ja kehitystyötä on tehty immobilisoitujen hiivojen valmistamiseksi, joita voidaan käyttää jatkuvatoimisissa fermentoreissa pidennettyjä ajanjaksoja. Ongelmat, jotka 14 95044 tällöin tulevat esiin, koskevat toisaalta immobilisoidun hiivan fysikaalista yhtenäisyyttä pidennettyjen reaktio-aikojen kuluessa ja myös hiivan kapasiteettia tuottaa pidennettyjen reaktioaikojen kuluessa toivotusta sokeriraa-ka-aineesta etanolia hyväksyttävän korkealla ja hyväksyttävän vakiolla konsentraatiolla. Edelleen ongelma, joka tulee esiin jatkuvan fermentoinnin kuluessa, on lämpö, joka muodostuu immobilisoidussa hiivamassassa. Monet hiivat, jotka ovat kiinnostavia panimoteollisuudessa, toimivat hyvin tyydyttävästi panosfermentoinnissa mutta samat hiivat käytettäessä jatkuvatoimisissa kerrosfermentoreis-sa joutuvat altiiksi lämpöongelmille, jotka vakavasti vaikuttavat niiden toimintaan. Tämä puolestaan tekee tarpeellisiksi monimutkaisten ja kalliiden jäähdytysmekanis-mien valmistuksen jatkuvatoimisiin kerrosfermentoreihin.

Yritettäessä indentifioida hiivaluokkia, jotka saattaisivat olla erityisen sopivia immobilisäätiöön ja käytettäväksi jatkuvassa fermentoinnissa, olemme seuloneet suuren määrän erilaisia hiivoja, joiden on sanottu olevan termofiilisiä tai ehkä paremminkin termotolerantteja. Hiivan termofiilisyys ilmenee sen kykynä kasvaa jatkuvasti panosviljelmässä usean sukupolven ajan (ainakin 4 ja 5) lämpötilassa, joka on yli 40°C, tavallisesti 40 -44°C. Hiivan termofiilisyys arvioitiin testillä, jossa ; sitä kasvatettiin määrätyllä kasvualustalla lämpötilois- sa, jotka olivat ainakin 40°C ja kasvun määrä määritettiin optisilla tiheyslukemilla. Käytetty menetelmä oli seuraava:

Testattavat hiivaviljelmät kasvatettiin vesipitoisessa kasvatusaineessa, joka sisälsi 1 % (paino/til.) bacto-hiivauutetta, 2 % (paino/til.) bacto-peptonia ja 2 % (paino/til.) glukoosia, tästälähin kasvatusainetta kutsutaan YEPD:ksi t.s. "yeast extract peptone dextrose". Testattavia hiivoja esikasvatettiin YEPD-kasvualustalla 32°C:ssa, jonka jälkeen ympättiin nopeudella, joka vasta- is 95044 si 150 mg hiivaa kuivana per 1 litra stationäärisoluja. Viljelmää kasvatettiin 16 tuntia 42,5°C:ssa ja hiivasolun kasvu määritettiin optisilla tiheyslukemilla. Hiivan, jonka optinen tiheyslukema on ainakin 2,5 kertaa suurempi kuin leivinhiivalla 2103 Ng (CBS 6131) saatu optinen tiheyslukema kasvatettuna identtisissä olosuhteissa, katsotaan termofiiliseksi, ja tässä selityksessä termofiilinen hiiva on sellainen, joka vastaa tätä optisen tiheysluke-man määritelmää.

Nämä tavoitteet mielessä olemme seuloneen useita ter-motolerantteja hiivoja, joilla on myös parantunut etanolin sietokyky, tarkoituksena indentifioida kantoja, jotka olisivat riittävän termofiilisiä immobilisointiin tämän keksinnön mukaisesti ja käytettäväksi jatkuvassa fermen-toinnissa.

Yksi tällainen hiiva, joka on läpikäynyt seulontates-timme, on alun perin nimetty Saccharomyces anamensis, joka on ensimmäisen kerran kuvattu 1913. Myöhemmät tutkijat ovat päättäneet, että tämä hiiva ei ole erillinen Saccha-romyces-laji, vaan itse asiassa Saccharomyces cerevisi-aen muunnos ja S. anamensisin ja S. cerevisiaen välinen identtisyys on esitetty ensimmäisessä ja toisessa painoksessa Lodderin ja Kreger van Rij'n julkaisua "The Yeasts"; North Holland Pubi. Co., Amsterdam, ja Kreger van Rij'n myöhemmissä painoksissa, julkaisija Elsevier.

Olemme tutkineet S. cerevisiae var. anamensi_s-näytteitä, jotka on saatu IFO:lta, Osakasta Japanista, talle-tusnumero IFO 0203, ja havainneet yllätykseksemme, että kannan kyky fermentoida esimerkiksi glukoosia vaihtelee odottamattomalla ja hyvin edullisella tavalla, kun se im-mobilisoidaan tämän keksinnön mukaisesti. Seulontates-teissämme kantaa IFO 0203 verrattiin erilaisissa testeissä tavanomaiseen leivinhiivaan, kantaan 227 Ng, jota myydään Englannissa nimellä Fermipan "red", valmistaja British Fermentation Products Ltd. (Fermipan on rekisteröity 16 95044 tavaramerkki). Havaitsimme, että IFO 0203 oli positiivinen kun taas 227 Ng oli negatiivinen termofiilisyystes-tissämme lämpötilassa 40°C ja sen yläpuolella. Toisessa testissä, tuotetun etanolin määrän mittaamiseksi 6 tunnin kuluessa 37°C:ssa, IFO 0203 tuotti 2,67 % (til./til.) kun taas samoissa olosuhteissa 227 Ng tuotti olennaisesti saman määrän 2,54 % (til./til.).

Näiden kahden hiivakannan välillä suoritettiin vertailu myös panosfermentoinnissa solutiheyden ollessa alussa korkea, jolloin havaittiin, että IFO 0203 pystyi tuottamaan 15 % (til./til.) etanolia ensimmäisten 16 tunnin kuluessa ja 16,5 % 24 tunnin kuluttua, kun taas samoissa olosuhteissa 227 Ng tuotti 18 % etanolia ensimmäisen 16 tunnin kuluessa ja 18,5 % etanolia 24 tunnissa. Nämä testit suoritettiin sellaisissa olosuhteissa, että käyminen ei loppunut fermentoitavan sokerin puutteen seurauksena .

Edelleen kantojen välillä suoritettiin vertailu määrittämällä niin sanottu sokerin D-arvo. Tämä on menetelmä, joka on esitetty itäsaksalaisessa patenttijulkaisussa DD 216480-A ja se indentifioi alkoholia sietäviksi hiivoiksi sellaiset, joilla on D-arvo suurempi kuin 25 sekuntia. D-arvo on se aika sekunneissa, joka vaaditaan, jotta 90 % hiivasoluista kuolee, kun ne joutuvat altiiksi . 58°C:n lämpötilalle. Hiivat, joiden D-arvo on alle 25 se- kuntia, katsotaan alkoholisensitiivisiksi. Tässä testissä IFO 0203 sai D-arvon 50 sekuntia, kun taas 227 Ng sai arvon 26 sekuntia, molemmat arvioitiin tällä testillä alkoholia sietäviksi.

Erilaisten, edellä kuvattujen tavanomaiseen fermen-tointiin perustuvien vertailutestien perusteella ei ollut mitään syytä olettaa, että näiden kahden hiivakannan käyttäytymisen välillä olisi mitään merkittävää eroa im-mobilisoitaessa tämän keksinnön mukaisesti ja käytettäessä jatkuvassa fermentoinnissa. Kuitenkin kun tämä vertai 17 95044 lu oli suoritettu, havaittiin mitä yllättävinäni n, että IFO 0203:n käyttäytymisessä oli hyvin merkittävä parannus. Kun 227 Ng ko-immobilisoitiin amyloglukosidaasin kanssa tämän keksinnön mukaisesti ja hienojakoinen aine pantiin kolonniin, jota jatkuvasti täydennettiin deks-triiniraaka-aineella ja etanolia tuottavaa tuotevirtaa jatkuvasti poistettiin, havaittiin, että tuotevirta sisälsi 8,5 - 9,5 % (til./til.) etanolia, fermentoinnin saavutettua vakaan (steady state) toiminnan. Kun sama menetelmä toistettiin kannalla IFO 0203, saavutettiin etanolipitoisuus 11 - 12 * ja se säilyi jopa kuuden kuukauden ajan.

Kantaa IFO 0203 tutkittaessa havaittiin, että eräitä muutoksia on tapahtunut kannan fermentointikyvyssä, verrattaessa siihen mitä olivat esittäneet kannan alkuperäiset eristäjät ja mitä esitetään Lodderin ensimmäisessä painoksessa, niin että päinvastoin kuin julkaistut ominaisuudet, me havaitsimme, että IFO 0203 kanta, jolla olimme suorittaneet edellä kuvatut kokeet, ei fermentoi maltoosia. Tämä osoittaa mielestämme, että mutaatio on tapahtunut sen jälkeen kun alkuperäinen materiaali on tallennettu, ja me olemme tallentaneet S. cerevisiae IFO 0203 kannan, joka ei fermentoi maltoosia, 7. toukokuuta 1986 (Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Alankomaat) jossa sille on annettu tai-‘ lennusnumero CBS 252.86.

Lisäksi olemme tutkineet kannan IFO (CBS 252.86) keinotekoisia mutanttikantoja. Olemme yrittäneet mutatoida tätä kantaa käsittelemällä hiivasoluja tunnetuilla muta-geeneilla lähes kuolettavilla annoksilla. Mutageeneja, joita olemme käyttäneet, ovat natriumnitriitti ja etyyli-metaanisulfonaatti. Erään erityisen mutantin, joka saatiin käsittelemällä kantaa IFO 0203 natriumnitriitillä ja etyylimetaanisulfnaatilla, on havaittu omaavan tiettyjä ominaisuuksia, jotka ovat ylivoimaisesti paremmat kuin 1β 95044 sen peruskannan. Olemme merkinneet tämän mutanttikannan 2490-KI13 ja olemme myös tallentaneet mutanttikannan 2490-KI13 7. toukokuuta 1986 Central Bureau voor Schim-melcultures-laitokseen, jossa sille on annettu tallennus-numero CBS 253.86. Lyhyyden vuoksi tulemme viittaamaan tähän tallennettuun mutanttikantaan mainitsemalla mutant-tikanta 13. Mutanttikanta 13 muodostaa tämän keksinnön erään suoritusmuodon.

Mutanttikanta 13 on saatettu alttiiksi useille ver-tailutesteille, jotka edellä kuvattiin peruskannalle IFO 0203. Termotoleranttikasvatustesteissä mutanttikanta 13 havaittiin vähemmän termotolerantiksi kuin sen peruskanta CBS 252.86 mutta melko paljon tolerantimmaksi kuin 227 Ng. Optiset tiheyslukemat tehtiin käyttäen Klett-Summer-son-densitometria, ja siinä suodatinta 66, ja 3 toisistaan riippumatonta lukemaa antoivat seuraavassa esitetyt keskimääräiset tulokset:

Kanta 40°C 41,5°C 42,5°C

IFO 0203 (CBS 252.86) 408 357 345

Mutanttikanta 13 (CBS 253.86) 383 338 305 227 Ng 325 113 100 2103 Ng (CBS 6131) 171 149 99

Tavanomaisessa fermentoinnissa 37eC:ssa mutanttikanta 13 tuotti 3,61 % (til./til.) etanolia verrattuna 2,67 %:iin, joka saatiin CBS 252.86:11a ja 2,54 %:iin 227 Ng:llä.

Testissä, jossa määritettiin alkoholin tuotanto 16 ja 24 tunnin jälkeen, mutanttikanta 13 tuotti ainoastaan 13,25 % (til./til.) alkoholia 16 tunnissa ja 15,5 % 24 tunnissa ollen selvästi huonompi alkoholin tuotannossa verrattuna sekä sen peruskantaan että kantaan 227 Ng.

Kuitenkin kun mutanttikanta 13 ko-immobilisoitiin tä- is 95044 män keksinnön mukaisesti amyloglukosidaasin kanssa risti-kytketyssä gelatiinissa ja partikkelit pantiin jatkuvatoimisen fermentorin kolonniin, etanolipitoisuus tuote-virrassa saavutti 11 - 12 %:n (til./til.) vakaassa tilassa, toisinsanoen se oli parempi peruskantaan CBS 252.86 verrattuna siinä, että se ylläpiti tämän alkoholin korkean pitoisuuden jatkuvasti aina 6 kuukauden ajan ja lisäksi saavutti alkoholituotantonsa tasapainon nopeammin.

Tämän keksinnön mukaisten biokatalysaattorien ylivoimaisesti suurin käyttö on hiilihydraattien muuttaminen, mutta riippuen elävien solujen luonteesta biokatalysaat-toreille löytyy käyttöä myös muista mikrobiologisista menetelmistä, joihin immobilisoidut solut kykenenvät.

Edelleen tämän keksinnön mukaisesti alkoholintuotan-toon käytettävää substraattia voidaan sopivasti esikäsi-tellä immobilisoidulla hiiva/amyloglukosidaasilla ennen substraatin laskemista fermentoriin, joka sisältää liukenevan hiivan ja amyloglukosidaasin.

Edelleen erään näkökohdan mukaisesti keksinnön mukaista immobilisoitua hiivabiokatalysaattoria voidaan käyttää viimeisteltäessä osittain muunnettu substraatti alkoholituotantoa varten. Esimerkiksi substraatti, joka sisältää 20 DS-dekstroosi-ekvivalenttia, muutetaan ensin reaktorissa 9 %:seksi etanoliksi (til./til.) liukenevalla hiivalla ja amyloglukosidaasilla. Tämä liuos syötetään immobilisoidun hiivan/amyloglukosidaasin sisältävään, keksinnön mukaiseen reaktoriin, joka sisältää alkoholia kestävän hiivan, esimerkiksi yhden hiivoista, jotka kuuluvat tässä edellä kuvattuun ryhmään.

Biokatalysaattoreiden, joissa elävät solut ovat hiivasoluja, yksi pääkäyttö on etanolin tuottaminen fermen-toimalla käymiskelpoista sokeria, erityisesti jatkuvan fermentoinnin olosuhteissa. Kuten edellä esitettiin, tämän keksinnön mukaisen biokatalysaattorin on havaittu olevan erityisen edullinen keino hiivasolujen lisäämisek- 20 9 5 0 4 4 si jatkuvatoimiseen fermentoriin, jossa on biokatalysaat-toria, kiinnitettyyn kerrokseen (fixed bed) leijukerrok-seen tai (jatkuvasti) hämmennettyyn tankkireaktoriin [(continuously) stirred tank reactor (CSTR)].

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa biokatalysaat-toria on läsnä leijukerrosreaktorissa, johon reaktioseos lisätään siten, että reaktorissa saavutetaan yhtenäinen leijuminen. On edullista laittaa monitoiminen erotusosa reaktoritilan yläosaan, jotta kaasu-neste-kiinteät aineet sisältävä seos, joka poistuu reaktiotilasta, täydellisesti erottuu ja biokatalysaattori täydellisesti palautuu reaktiotilaan. Tällainen leijukerrosreaktori, jossa on monitoiminen erotusosa, on kuvattu EP-A 0090450:ssa jäteveden, jossa biomassa on liittyneenä kantoainehiukkasiin, puhdistamiseksi. Nyt on yllättävällä tavalla havaittu, että samantyyppistä reaktoria voidaan myös käyttää edullisesti etanolin valmistamiseksi, erityisesti käytettäessä tämän keksinnön mukaista biokatalysaattoria. Reaktorin periaate, mitä tulee viipymisaikaan vs. elävien solujen, kuten hiivasolujen kasvunopeuteen, on samanlainen kuin mitä esitetään mainitussa eurooppalaisessa patenttijulkaisussa ja spesifiset olosuhteet optimikäytölle voi helposti alan ammattimies määrittää, niiden riippuessa mm. käytetyistä spesifisistä soluista.

Reaktoreita syötetään jatkuvasti raaka-aineena käytettävällä käymiskelpoisella sokerilla ja tuotevirtaa, joka sisältää etanolin, poistetaan jatkuvasti. On tietysti tarpeen sovittaa yhteen hiiva ja raaka-aineena käytetty käymiskelpoinen sokeri, ja erään erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan biokatalysaattori voi sisältää tallentamamme kannan S. cerevisiae CBS 252.86:n tai CBS 253.86:n yhdessä amyloglukosidaasin kanssa ja syötettävä raaka-aine voi sisältää dekstriiniä. Dekstriini voi olla dekstriiniä, joka valmistetaan hajottamalla entsymaattisesti tärkkelystä, esim. alfa-amylaasilla saadaan deks- 21 95044 triiniä, jonka keskimääräinen polymerointiaste on noin 7-10, ja dekstriinien lopullinen hajottaminen glukoosi-raaka-aineen valmistamiseksi suoritetaan itse biokataly-saattorissa amyloglukosidaasilla.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan useita edullisia suoritusmuotoja keksinnön havainnollistamiseksi. Kuitenkin olisi ymmärrettävä, että keksintöä ei ole tarkoitus rajoittaa spesifisiin suoritusmuotoihin.

Esimerkki 1 40 g kuivattua "instant"-hiivaa (Saccharomyces cere-visiae 2103 Ng, CBS nro 6131, 96,5 % kuiva-ainetta) sus-pendoitiin 960 mlraan vesipitoista liuosta, jossa oli 60 g gelatiinia , lämpötilan ollessa noin 40°C. Säädettiin pH arvoon 5,5. Tämä vesipitoinen hiiva-gelatiini-suspensio lisättiin sekoittaen 4000 ml:aan n-butyyliase-taattia, joka oli etukäteen kuumennettu 40°C:seen. Muodostunut suspensio jäähdytettiin nopeasti 10°C:seen, jolloin muodostui hiiva-gelatiini-partikkeleita. Dekantoi-tiin n-butyyliasetaatti. Partikkelit (1 kg märkiä helmiä) ristikytkettiin liuoksella, jossa oli 30 g glutardialde-hydiä (50 %:nen liuos til./til.) 2000 ml:ssa vettä, pH säädettynä arvoon 6,5, 1 tunnin ajan 5°C:n lämpötilassa. Partikkeleita pestiin vedellä, kunnes ei enää voitu havaita n-butyyliasetaatin hajua. Saaduilla partikkeleilla oli hyvä fysikaalinen stabiilisuus ja ne olivat veteen liukenemattomia. Suljettuja (entrapped) hiivasoluja inku-boitiin panoksittain 3000 ml:ssa ravintoalustaa aerobisissa olosuhteissa. pH pidettiin arvossa 4,5 0,1 N NaOH:lla ja lämpötila 35°C:ssa kierrättämällä vettä vaipassa termostaattisesti säädetystä vesihauteesta.

Valittua hiivaviljelmää kasvatettiin kasvatusalustassa, joka sisälsi (% paino/til.): 22 % glukoosia, 2 % NH4CI:a, 0,5 % KH2PO4:a, 0,1 % NaCl:a, 1 % MgS04.7H20:ta, 0,2 % CaCl2.2H20:ta, Tween 80:tä (1 ml/1), Ergosterolia 22 95044 (6,5 ml/1), 0,1 % hiivauutetta, vitamiini B:tä (7,5 mg/1) ja vaahdonestoainetta (0,5 ml/1).

Elinvoimaisten solujen määrät (bakteerit laskettiin mallasuuteagarmaljoilla) jotka suljettiin partikkeleihin immobilisaatiomenetelmän seuraavissa vaiheissa, on esite-ty taulukossa 1. Minkäänlaista n-butyyliasetaatin huonontavaa vaikutusta gelatiinin suljettuihin hiivasoluihin ei voitu havaita.

Taulukko 1 elinvoimaisten solujen «« ·♦_«> maa ra vaihe menetelmässä soluja/g (%) _kuivaa helmimassaa_ hiiva-gelatiini-suspensio 4 x 10^ 100 butyyliasetaatin jälkeen 4 x 10^ 100 ristikytkennän jälkeen 5 x 10^ 40 reqeneraation jälkeen_6 x 109_150

Esimerkki 2

Samalla tavalla kuin esimerkissä 1 on esitetty, mutta lähtemällä 40 grsta kuivaa "instant"-hiivaa (Saccharomy-; ces cerevisiae 2031 Ng, CBS Nro 6126, 96,5 % kuiva-ainet- •«

' ta) ja 8 ml:sta amyloglukosidaasia (AMIGASE LX 26.000 AGI

yksikköä/ml, Gist-Brocades) pelkän hiivan sijasta, saatiin ristikytkettyjä amyloglukosidaasi-gelatiini-partik-keleita, jotka olivat veteen liukenemattomia ja joilla oli hyvä fysikaalinen stabiilisuus.

Esimerkki 3

Hiiva-gelatiini-partikkelit valmistettiin esimerkissä 1 esitetyllä menetelmällä sillä erotuksessa, että käytettiin Saccharomyces cerevisiae 1777 Ng:tä, CBS nro 4877, 23 9 5 0 4 4 96,5 % kuiva-ainetta, ja partikkelit, jotka saatiin n-butyyliasetaatin dekantoinnin jälkeen, ristikytkettiin glutardialdehydin kanssa liukoisen amyloglukosidaasin läsnäollessa.

Liuosta, jossa oli 30 g glutardialdehydiä (50 % sinen liuos, til./til.) ja 200 ml amyloglukosidaasia (AMIGASE, vrt. Esimerkki 2) 200 mlsssa vettä, ja 1000 g märkiä helmiä ristikytkettiin tunnin ajan pHsssa 6,5 ja 5°C:n lämpötilassa.

Nesteen poistamisen jälkeen amyloglukosidaasilla päällystettyjä hiiva-gelatiini-partikkeleita pestiin useita kertoja, kunnes ristikytkentäaine oli kokonaan poistettu. Etanolitermentointi suoritettiin kuten esimerkissä 20 kuvataan. Amyloglukosidaasi-hiiva-gelatiini-par-tikkeleilla oli vielä korkeampi toiminnallinen stabiilisuus verrattuna esimerkin 2 menetelmän mukaisesti valmistettuihin partikkeleihin.

Esimerkki 4

Menetelmää muunnettiin seuraavalla tavalla liukenemattomaksi tehtyjen mikro-organismien jatkuvaksi tuottamiseksi. Mikro-organismit, jotka sisälsivät gelatiiniliu-oksen, pumpattiin useiden kapeiden putkien läpi kolonniin, jossa oli n-butyyliasetaattia, jota pidettiin , 5°C:ssa. Putket, jotka oli asennettu siten, että niiden alapää oli butyyliasetaattipinnan alapuolella, kuljettivat mikro-organismi-gelatiiniliuosta jatkuvana virtana, joka virta hajosi pieniksi pisaroiksi joutuessaan n-bu-tyyliasetaattiin. Pisaroiden koko riippui pumppausnopeu-desta. N-butyyliasetaatti sisälsi glutardialdehydiä. Kolonnin pituus oli 5 m niin että pisaroilla, jotka tulivat alas, oli riittävästi aikaa geeliytyä ja reagoida risti-kytkentäaineen kanssa. Saatuja helmiä kerättiin jatkuvasti kolonnin pohjalta, erotettiin n-butyyliasetaatista ja pestiin vedellä. N-butyyliasetaatti kierrätettiin uudes 24 9 5 0 4 4 taan kolonniin sen jälkeen kun se oli täydennetty kulutetulla glutardialdehydillä. Kolonnin sisähalkaisija oli noin 4 cm ja se tuotti noin 8 1 liukenemattomaksi tehtyjä mikro-organismihelmiä tunnissa.

Esimerkki 5

Ko-immobilisoituja mikro-organismipartikkeleita tuotettiin jatkuvasti esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, mutta sillä erolla, että gelatiiniliuoksen sisältämä(t) entsyymi (t) ja mikro-organismi(t) ekstrudoitiin kylmään n-bu-tyyliasetaattiliuokseen.

Esimerkki 6

Koesarjassa valmistettiin hiiva-gelatiini-partikke-leita, kuten esimerkissä 1 kuvataan, sillä erotuksella että n-butyyliasetaatin sijasta käytettiin seuraavia orgaanisia liuottimia peräkkäin: tolueeni bensiini petrolieetteri (korkea kiehumisfraktio, 70/110) sykloheksaani n-pentaani

Kaikissa tapauksissa elinvoimaisten solujen määrä ainakin 1 tunnin kestäneen inkuboinnin jälkeen näissä or-: gaanisissa liuottimissa oli 100 %.

Esimerkki 7

Samalla tavalla kuin esimerkissä 4 on kuvattu, mutta korvaamalla hiiva Acetobacter pasteurianum-kannalla ATCC 9325, saatiin liukenemattomaksi tehtyjä partikkeleita.

Elinvoimaisten solujen määrä (maljalaskenta B.H.I -agarilla, difco, pH 7,4), jotka suljettiin partikkeleihin immobilisaatiomenetelmän seuraavissa vaiheissa, on esitetty taulukossa 2. Minkäänlaista n-butyyliasetaatin huonontavaa vaikutusta gelatiiniin suljettuihin Acetobac- 25 95044 ter-soluihin eikä myöskään minkäänlaista glutardialdehy-din aikaansaamaa solujen vahingoittumista voitu havaita.

Taulukko 2 vaihe menetelmässä elinvoimaisten solujen määrä _%_

Acetobacter-gelatiini- suspensio 100 butyyliasetaatti-ekstruu- sion jälkeen 100 ristikytkennän jälkeen_100_

Esimerkki 8 20 g ravun kuoren kitosaania liuotettiin 450 ml:aan laimeaa etikkahappoa 40°C:ssa ja neutraloitiin pH-arvoon 6,0 30 g:11a natriumasetaattia. Sen jälkeen 250 g Aceto-bacter pasteurianum-kannan märkiä soluja suspendoitiin kitosaaniliuokseen ja lämpötila pidettiin 40°C:ssa. Erikseen liuotettiin 20 g agaria 500 ml:aan vesijohtovettä ja lämpötila nostettiin 100°C:seen.

Agarliuos jäähdytettiin 45°C:seen ja lisättiin Aceto-bacter-kitosaanisuspensioon♦ Suspensio ekstrudoitiin n-. butyyliasetaattiin 5°C:ssa kuten esimerkissä 4 kuvataan.

Saadut partikkelit pestiin vedellä ja ristikytkettiin glutardialdehydin kanssa, kuten esimerkissä 3 kuvataan, sillä poikkeuksella, että ristikytkentäaineen konsentraa-tio oli kaksinkertainen.

Partikkelit olivat veteen liukenemattomia ja omasi-vat hyvän fysikaalisen stabiilisuuden.

Esimerkki 9 250 g bakteerilietettä (Lactobacillus plantarum, 3,5 % kuiva-ainetta) suspendoitiin 750 ml:aan vesipitois- 26 9 5 0 4 4 ta liuosta, jossa oli 60 g gelatiinia, lämpötila oli noin 40 °C.

Tämä vesipitoinen bakteeri-gelatiini-suspensio lisättiin sekoittaen 4000 ml:aan n-butyyliasetaattia, joka oli etukäteen kuumennettu 40°C:seen. Muodostunut suspensio jäähdytettiin nopeasti 10°C:seen ja muodostui bakteerit ja gelatiinin sisältäviä partikkeleita. N-butyyliasetaat-ti dekantoitiin. Partikkeleita (1 kg märkiä helmiä) ris-tikytkettiin liuoksen kanssa, jossa oli 30 g glutardial-dehydiä (50 %:inen liuos, tl./til.) 2000 ml:ssa vettä, pH säädettynä arvoon 6,5 1 tunnin ajan 5°C:n lämpötilassa. Partikkeleita pestiin vedellä, kunnes n-butyyliasetaatin hajua ei enää voitu havaita. Muodostuneilla partikkeleilla oli hyvä fysikaalinen stabiilisuus ja ne olivat veteen liukenemattomia. Suljettuja bakteerisoluja inkuboitiin panoksittain 3000 ml:ssa ravintoalustaa mikroaerofHiisissä olosuhteissa. pH pidettiin arvossa 6,0 10 N NaOH:lla ja lämpötila 30°C:ssa kierrättämällä vettä vaippaan termostaattisesti kontrolloidusta vesihauteesta. Valittua bakteeriviljelmää kasvatettiin ravintoalustassa, joka sisälsi: 10 g/1 peptonia, 8 g/1 Lab-Lemcoa, 4 g/1 hiivauutetta, 20 g/1 glukoosia, 1 g/1 Tween 80:tä, 2 g/1 K2HPC>4:a, 3 g/1 natriumasetaattia, 2 g/1 triammoniumsit-raattia, 0,2 g/1 MgS04-7 H20:ta, 0,038 g/1 MnS04.H20:ta ja 60 g/1 GISTEXiä.

Elinvoimaisten solujen määrä (maljalaskenta MRS AGAR-maljoilla (OXOID CM 359)), jotka kapseloitiin partikkeleihin immobilisointimenetelmän seuraavissa vaiheissa, on esitetty taulukossa 3. Minkäänlaista n-butyyliasetaatin huonontavaa vaikutusta gelatiiniin suljettuihin bakteeri-soluihin ei voitu havaita.

27 95044

Taulukko 3 vaihe menetelmässä elinvoimaisten bakteerisolu- _jen määrä (%)_ bakteeri-gelatiini-suspensio 100 butyyliasetaatin jälkeen 100 ristikytkennän jälkeen 1 reqeneraation jälkeen_10*_ (* 9 x 10® bakteerisolua/g kuivaa helmimassaa).

Esimerkki 10

Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Weizmann-kanta)-kannan aktiivisesti kasvavaa viljelmää ympättiin (0,5 %) Taulukossa 4 kuvattuun kasvualustaan, ja inkuboitiin ilman pH-kontrollia 37°C:ssa typpiatmosfäärissä. Kahden viikon kuluttua fermentorin sisältö otettiin talteen ja itiöt pestiin kaksi kertaa steriilillä, demineralisoidul-la vedellä. Tyypillinen saanto oli 0,43 g itiöitä (märkä-paino)/g glukoosia. Yksi milligramma itiöitä vastaa 2,3 x loi® itiötä. Viljelmän maksimikasvuvauhti (μ maks.) valituissa olosuhteissa oli 0,36 h“l. Pestyt itiöt suspen-doitiin uudestaan lopullisen konsentraation ollessa 15 g/1 (noin 5 g/1, kuivapaino) ja eriä inkuboitiin 1 tunti < 5°C glutardialdehydin läsnäollessa (korkeintaan 1 % paino/paino). Pestiin steriilillä, demineralisoidulla vedellä, jonka jälkeen laimennossarja ympättiin aivo-sydän-infuusioliuokseen, joka sisälsi glukoosia (10 g/1) ja joka äkkikuumennettiin (2 min, 80°C) ja inkuboitiin 37°C:ssa. Glutardialdehydin minkäänlaista vaikutusta itiöiden elinvoimaisuuteen ei havaittu. Itiöt immobilisoi-tiin (0,2 % paino/paino) gelatiiniin (6,0 % paino/paino), ristikytkettiin glutardialdehydin kanssa (0,75 % paino/-paino) standardimenetelmän mukaisesti, joka on esitetty 28 95044 hiiva/amyloglukosidaasille. Itiöiden elinvoimaisuus tarkastettiin aika ajoin käsittelyn kuluessa. Proteolyytti-sellä entsyymisuspensiolla hydrolysoitiin gelatiini, jonka jälkeen laimennussarja maljattiin itiöiden lämpöakti-voinnin jälkeen BHI-agarille, joka sisälsi glukoosia (10 g/1) ja ditiotreitolia (0,08 % paino/paino). Määrät, jotka saatiin 37°C:ssa suoritetun 1 viikkoa kestäneen in-kuboinnin jälkeen anaerobisissa käymisastioissa, osoitti, että käytetty immobilisaatiomenetelmä ei ollut vaikuttanut C. acetobutylicum-itiöiden elinvoimaisuuteen.

Taulukko 4

Kasvualustan koostumus (1 litraa tislattua vettä kohti)

K-fosfaattipuskuri 15 mM

MgS04.6H20 0,2 g NH4CI 0,65 g hiivauute 5,0 g tryptoni 5,0 g vitamiiniliuosn 0,5 ml hivenaineliuos11 9,0 ml resatsuriini (0,1 %) 1,0 ml

Na2S-kysteiini HCl (5%) 10,0 ml glukoosi 30,0 ml 29 9 5 0 4 4

Vitamiinit: Hivenaineet: biotiini 40 mg/1 nitrilotrietikkahappo 12,8 g/1 pABA 100 mg/1 FeS04.7H20 0,1 g/1 foolihappo 40 mg/1 MCCI2.4H2O 0,1 g/1

Ca-painote- raatti 100 mg/1 C0C12.6H20 0,17 g/1 nikotiinihappo 100 mg/1 CaCl2*2H20 0,1 g/1 vitamiini Bl2 2 mg/1 ZnCl2 0,1 g/1 tiamiini.HCl 10 mg/1 CUCI2 0,02 g/1 pyridoksiini.- HCl 100 mg/1 H3BO3 0,01 g/1 tioktiinihappo 100 mg/1 NaMo04.2H20 0,01 g/1 riboflaviini 10 mg/1 NaCl 1,0 g/1

Na2Se03 0,02 g/1

NiCl2 0,1 g/1

Esimerkki 11

Lactobacillus plantarum immobilisoitiin esimerkissä 9 kuvatulla tavalla, mutta Lactobacillus-soluien immobili-sointiin käytettiin seosta, jossa oli gelatiinia (6 % paino/paino) ja kitosaania (Sigma, C-3646), 0,5 % paino/-paino). Elinvoimaisten solujen määrä (maljalaskenta esimerkissä 9 esitetyllä tavalla), jotka kapseloitiin partikkeleihin immobilisointimenetelmän seuraavissa vaiheissa, on esitetty taulukossa 5.

30 95044

Taulukko 5 vaihe menetelmässä elinvoimaisten solujen luku- _määrä %_

Lbll-gelatiini-kito- saani-suspensio 100 butyyliasetaatin jälkeen 100 ristikytkennän jälkeen 1* regeneraation jälkeen_>10_ * 1 % = 2 x IQS solua/g kuivaa helmimassaa_

Esimerkki 12

Esimerkissä 11 kuvattu menetelmä toistettiin, mutta hiivasolujen immobilisointiin käytettiin nyt seosta, jossa oli gelatiinia (6 % paino/paino) ja polyetyleeni-imii-niä (sp-200 Nippon shokubai) (2 % paino/paino). Elinvoimaisten solujen määrä (maljalaskenta kuten esimerkissä 1 on kuvattu), jotka kapseloitiin partikkeleihin immobili-sointimenetelmän seuraavissa vaiheissa, on esitetty taulukossa 6.

Taulukko 6 . vaihe menetelmässä elinvoimaisten solujen määrä _%_ hiiva-gelatiini-PEI- suspensio 100 butyyliasetaatin jälkeen 100 ristikytkennän jälkeen 1* regeneraation jälkeen_150_ * 1 x 104 solua/q kuivaa helmimassaa___ 3I 95044

Esimerkki 13

Esimerkissä 9 esitetty menetelmä toistettiin, mutta nyt käytettiin seosta, jossa oli gelatiinia (4 % paino/-paino) ja alginaattiamiinia (2 % paino/paino). Mainittu alginaattiamiini-johdannainen valmistettiin seuraavalla tavalla: liuokseen, jossa oli 20 g Manucol E/RE:tä, pH

3,5, 750 ml:ssa tislattua vettä, lisättiin nopeasti mutta pienissä erissä liuos, jossa oli 23 g (0,2 moolia) 1,6-heksaanidiamiinia 200 ml:ssa tislattua vettä, jona pH oli säädetty arvoon 10,0 lisäämällä konsentroitua etikkahap-poa. Reaktioseosta sekoitettiin 4 tuntia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen se laimennettiin 1,0 litralla meta-nolia. Sakka suodatettiin ja pestiin kaksi kertaa 200 mlslla metanolia. Kuivattiin tyhjössä 50°C:ssa, jonka jälkeen saatiin valkoinen jauhe, joka osoittautui olevan käyttökelpoinen kantoaine entsyymeille ja mikro-organismeille. Ristikytkettiin glutardialdehydin kanssa (katso esimerkki 1), jonka jälkeen saatiin liukenemattomat partikkelit, joilla oli hyvä fysikaalinen stabiilisuus ja elinvoimaisten solujen lukumäärät olivat vertailukelpoiset taulukossa 6 esitettyjen arvojen kanssa.

Esimerkki 14 75 g kasvisolulietettä (Tagetes minuta, 1,5 % paino/-paino, kuiva-ainetta) suspendoitiin 175 ml:aan vesipitoista liuosta, jossa oli 17 g gelatiinia noin 40°C:n lämpötilassa ja pH:ssa 5,0. Kasvisolut sisältävä gelatiini liuos pumpattiin lukuisten kapeiden putkien läpi kolonniin, jossa oli n-butyyliasetaattia jota pidettiin 5°C:ssa. Putket oli asennettu siten, että niiden alapäät olivat butyyliasetaatin pinnan alapuolella, putkien jakaessa kasvisolu-gelatiini-liuoksen vakiovirtana, joka virta purkaantui pieniksi pisaroiksi sen saavuttaessa n-bu-tyyliasetaatin. Pisaroiden koko riippui pumppausnopeudesta. Kolonnin pituus oli 5 m, niin että pisaroilla, jotka tu 32 9 5 0 4 4 livat alas, oli runsaasti aikaa geeliytyä. Helmiä, joita saatiin, kerättiin jatkuvasti kolonnin pohjalta, erotettiin n-butyyliasetaatista ja pestiin vedellä. N-butyyli-asetaatti palautettiin kiertoon kolonniin. Kolonnin sisä-halkaisija oli noin 4 cm ja se tuotti noin 8 1 liukenemattomaksi tehtyjä kasvisoluhelmiä tunnissa. Sen jälkeen partikkeleita ristikytkettiin glutardialdehydin vaihtele-vien konsentraatioiden kanssa 5°C:ssa ja pH:ssa 6,0 yhden tunnin ajan. Saadut partikkelit pestiin hyvin vesijohtovedellä. Ne olivat veteen liukenemattomia ja niillä oli hyvä mekaaninen stabiilisuus.

Esimerkki 15

Esimerkin 14 menetelmä toistettiin käyttäen bensiiniä n-butyyliasetaatin sijasta. Myös tässä kokeessa saatiin partikkeleita, joilla oli hyvä mekaaninen stabiilisuus ja jotka olivat veteen liukenemattomia.

Esimerkki 16

Koesarjassa valmistettiin hiiva-gelatiini-partikke-leita esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, mutta nyt lisättiin zirkoniumoksidijauhetta (325 mesh) hiiva-gelatiini-suspensioon ennen ekstrudointia kylmään n-butyyliasetaat-ti in. Kävi ilmi, että mitä korkeampi oli lisätyn Zr02:n määrä, sitä suurempi tiheys oli saaduilla märillä partikkeleilla. Tulokset tyypillisestä koesarjasta on esitetty kuviossa 1.

Esimerkki 17

Pieni määrä fosfatidyylikoliinia (lesitiiniä) lisättiin butyyliasetaattiin esimerkissä 4 kuvatussa kokeessa. Tämä johti siihen, että muodostui pieniä kuituja pienten helmien sijasta.

33 9 5 0 4 4

Esimerkki 18 20 g märkiä ko-immobilisoidun amyloglukosidaasin ja hiivan partikkeleita valmistettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Varastointistabiilisuuden lisäämiseksi hiiva-amyloglukosidaasi-gelatiini-partikkelit kuivattiin epäjatkuvassa laboratorioleijukerroslaitteessa 20 - 30 minuuttia, huolehtien siitä, että hiiva-granulaatin lämpötila ei noussut 40°C:seen. Suurta huomiota kiinnitettiin leijuttamiseen ilmalla ja kuivausmenetelmän aloitukseen, joka suoritettiin nopeasti samalla kun partikkeleita sekoitettiin tai vibrattiin manuaalisesti alkutilassa. Saadut partikkelit sisälsivät kuiva-ainetta 85 - 93 %. Hiivasolujen tai ko-immobilisoidun amyloglukosidaasin ei havaittu menettäneen yhtään aktiivisuuttaan 12 kuukauden kuluessa, varastoitaessa tyhjössä 5°C:ssa.

Esimerkki 19

Esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti saatuja partikkeleita, jotka sisälsivät hiivan ja gelatiinin, käytettiin bioreaktorissa (CSTR) (työskentelytilavuus: 800 ml), täyttämällä 350 gjlla märkiä partikkeleita ja valuttamalla steriloitua 20 %:ista (paino/til.) glukoosi-liuosta, johon oli lisätty kuvattua kasvatusalustaa pH:ssa 4,5, reaktorin läpi erilaisilla virtausnopeuksil-.· la. Lämpötila pidettiin 32°C:ssa. Bioreaktoria pidettiin jatkuvasti toiminnassa neljän kuukauden ajan. Etanolin, glukoosin ja glyserolin määrittämiseksi otettiin näytteet tänä aikana saadusta efluentista. Minkäänlaisia varotoimia ei suoritettu steriilisyyden ylläpitämiseksi, mutta mitään kontaminaatiota ei havaittu.

Saadut tulokset osoittivat immobilisoitujen hiivasolujen korkeata toiminnallista stabiilisuutta keskimääräisen etanolipitoisuuden ollessa 8,0 - 8,5 % tilavuudesta.

34 95044

Esimerkki 20

Esimerkissä 2 kuvatun menetelmän mukaisesti saadut hiiva-amyloglukosidaasi-gelatiini-partikkelit regeneroitiin ja käytettiin samalla tavalla kuin esitettiin esimerkissä 19/ mutta käyttäen 20 %:ista (paino/til.) malto-dekstriiniliuosta, jonka aloitus-DE-arvo oli 15 (Snowflake) glukoosin sijasta.

Tulokset on esitetty kuviossa 2 ja ne osoittavat käytetyn ko-immobilisoidun amyloglukosidaasin ja hiivasolujen korkeata toiminnallista stabiilisuutta ja mahdollisuutta muuttaa DE-15-maltodekstriinisubstraatti etanoliksi yksivaiheisessa menetelmässä. Keskimääräinen etanoli-konsentraatio oli 8f5 % tilavuudesta.

Esimerkki 21

Esimerkissä 7 kuvatun menetelmän mukaisesti saatuja Acetobacter-gelatiini-helmiä käytettiin bioreaktorissa (CSTR) (työskentelytilavuus: 800 ml), täyttämällä 80 g:11a märkiä helmiä ja 720 ml:11a steriloitua kasvualustaa, jossa oli 5 % (paino/til.) glukoosiliuosta ja 2 % (paino/til.) hiivauuteliuosta. Kasvatusalusta puskuroitiin fosfaatilla pH-arvoon 7,0. 16 tunnin inkuboinnin jälkeen 30°C:n lämpötilassa otettiin näytteet ja analysoitiin glukoosi ja etikkahappo.

V Etikkahapon lopullinen konsentraatio oli 0,5 g/1 ja • « happotuotannon nopeudeksi mitattiin 21 mg etikkahappoa per gramma soluja (kuiva-ainetta) per tunti.

Sama koe suoritettiin etanolilla, joka oli substraatti glukoosin sijasta. Viimeksi mainitussa tapauksessa etikkahapon loppukonsentraatio oli 0,8 g/1 ja tuotantono-peus 31 mg etikkahappoa per gramma soluja (kuiva-ainetta) per tunti.

35 9 5 0 4 4

Esimerkki 22

Esimerkissä 9 kuvatun menetelmän mukaisesti saatuja Lactobacillus plantarum-soluia ja gelatiinia sisältäviä partikkeleita käytettiin bioreaktorissa (CSTR) (työsken-telytilavuus: 800 ml), täyttämällä 140 g:11a märkiä partikkeleita yhdessä 300 ml:n kanssa esimerkissä 9 kuvattua kasvatusalustaa.

Fermentoinnin alussa lisättiin 352 ml 48 %:ista (pai-no/paino) glukoosiliuosta fermentoriin, nopeuden ollessa 16 ml/tunti 22 tunnin ajan. Lämpötila pidettiin 30°C:ssa ja pH arvossa 6,0 10 N NaOHslla. Kokonaispanosfermentoin-tiaika oli kuusi päivää ja tämän ajanjakson kuluessa otettiin näytteitä glukoosin ja maitohapon määrittämiseksi .

Minkäänlaisiin varotoimiin steriilisyyden säilyttämiseksi ei ryhdytty, mutta mitään kontaminaatiota ei havaittu. Saadut tulokset osoittavat maitohapon korkeata tuotantoa ja johtavat aina 96 %:n saantoon saakka lopussa. Maitohappokonsentraatio fermentoinnin lopussa oli 17,8 % (paino/til.) kuten on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 23 CSTR-bioreaktoria (viljelytilavuus 0,5 1), jota kaasutettiin N2:lla ja kasvatusalustaa, joka on kuvattu esi- ·.' merkissä 4, käytettiin orgaanisten liuottimien fermen- • · toinnissa immobilisoiduilla Clostridium-solui11a, kuten esimerkissä 10 on kuvattu. Helmien (0,25 1 sisältäen 2 g/1 itiöitä) "sterilisaatio" ja itiöiden aktivointi suoritettiin käyttäen vesipitoista etanolia (50 %:inen, paino/paino) Krouwel-menetelmän mukaisesti (Biotechnol. Letts. 3 (1981) 158-159). Etanoli poistettiin pesemällä steriileillä, fysiologisilla suolaliuoksilla ennen kasvatusalustan lisäämistä. Ainoastaan itiö- ja kasvufaaseja seurattiin. Saadut fermentointitulokset 160 ensimmäisen tunnin ajalta on esitetty kuviossa 4. Glukoosi muutettiin 36 95044 butanoliksi, butyraatiksi, asetaatiksi ja laktaatiksi. Jälkiä asetonista oli silloin tällöin havaittavissa (ei osoitettavissa). Maksimaalinen butanolin tuotanto saatiin 0,76 g/1 tunti glukoosi muuttumisnopeuden ollessa 5 g/1 h.

Helmien pyyhkäisyelektronimikrografit viljelyn eri vaiheissa osoittivat, että itiöt ja muutamat jäännössolut olivat tasaisesti levinneet gelatiinimatriisin läpi ja helmien täydellinen kolonisaatio (täyteen kasvaminen) saavutettiin seitsemässä päivässä.

Esimerkki 24

Immobilisoitujen kasvisolujen, joita on kuvattu esimerkeissä 14 ja 15, hapenkulutusta mitattiin Murashige ja Skoog kasvualustalla, jossa oli 2 % paino/til. sakkaroosia. Tulokset on esitetty kuviossa 5. Immobilisoitujen Tagetes minuta-solujen hapenkulutus oli samaa suuruusluokkaa kuin suspension solujen.

Esimerkki 25 S.cerevisiaen IFO 0203 (CBS 252.86) mutaatio

Menetelmä perustui hiivan jatkuvaan viljelyyn, käyttäen kasvusta riippuvia pH-muutoksia fermentoriin lisättävän uuden kasvatusalustan lisäysnopeuden kontrolloimiseksi ("phauxostat"). Menetelmän ovat kuvanneet G.A. Martin ja W.P. Hempfling, Arch. Microbiol. 107 (1976) 41-47. Yhden litran Gallenkamp-fermentori täytettiin perus-mini-mi-kasvualustalla, jonka koostumus on jäjempänä esitetty. Aluksi säädettiin alkoholipitoisuudeksi 3 % til./til.. Kaikki toimenpiteet suoritettiin steriileissä olosuhteissa ja fermentori, joka sisälsi 0,5 1 tätä kompleksikasvu-alustaa, ympättiin kannan S. cerevisiae IFO (CBS 252.86) esiviljellyllä viljelmällä. Aluksi pH pidettiin arvossa 4,5, fermentori oli varustettu sisäänviennillä 1N NaOH:ta varten, jota tarvittaessa injektoitiin pH:n säilyttämi 95044 37 seksi arvossa 4,5. Fermentorissa oli sisäänvienti myös uudelle kasvatusalustalle, jota "phauxostat" kontrolloi niin, että glukoosikonsentraatio ei koskaan ollut rajoittava. Alkulämpötila asetettiin 32°C:seen. Kun fermentori saavutti vakaan tasaisen toiminnan, lämpötila nostettiin 40°C:seen. Fermentori oli käynnissä jatkuvasti seitsemän kuukauden ajan.

Jäljempänä esitetyn kaavion mukaisesti hiivamassaa pommitettiin mutageeneilla, kun alkoholikonsentraatio tuli rajoittavaksi, ja jokaisessa myöhemmässä vaiheessa, kun alkoholikonsentraatio tuli uudestaan rajoittavaksi, hiivamassaa taas pommitettiin mutageeneilla. Aluksi etyy-limetaanisulfonaattia (EMS) injektoitiin sellainen määrä, että välittömästi injektion jälkeen EMS-konsentraatio fermentorissa oli prosenteissa paino/til. kuten jäljempänä esitetään. Kolmen EMS-pitoisen liuoksen injektioita sellaisina määrinä, että välittömästi injektion jälkeen natriumnitriitin konsentraatio fermentorissa oli milli-mooleissa per litra kuten jäljempänä on esitetty.

Peruskasvualustan konsentraatio oli seuraava: aZi NH4C1 2,5 KH2PO4 0,25

MgS04-7H20 0,1

NaCl 0,05 hivenaineita 0,1 (ml) vitamiineja 0,5 (ml) ergosterolia 1,72 (mg)

Tween 80:tä 0,25 glukoosia 100 g 38 95044

Mutageenipommituskaavio oli seuraava:

Aika ymppäyksestä (tunteja) Mutageenipulssi

160 0,01EMS

460 0,1EMS

650 1, OEMS

1200 0,lmM NaN02 1430 0,5mM NaN02 1600 1,OmM NaNC>2 1820 2,OmM NaN02 1960 3,OmM NaNC>2 Säännöllisin väliajoin otettiin näytteet ja kaikkiaan 2490 tunnin kuluttua otettu näyte laimennettiin ja mal-jättiin mallasagarille, jossa oli 6 % etanolia. 16 hyvin kasvavaa pesäkettä analysoitiin edelleen 6 tuntia 37°C:ssa alkoholin tuotantotestissä, joka edellä kuvattiin, kun havaittiin, että erilaiset eristetyt mutantti-kannat nostivat etanolikonsentraatiot 2,53 ja 3,61 %:n (til./til.) välille 6 tunnin viljelyn jälkeen 37°C:ssa. Pesäke, joka nosti etanolikonsentraation 3,61 %:iin, merkittiin mutantiksi 2490KI13 ja mutantti tallennettiin CBS 253.86:na kuten edellä kuvattiin.

Kantaviljelmän fermentointia jatkettiin ja otettiin edelleen näyte kaikkiaan 4860 tunnin kuluttua viljelyn t * aloittamisesta.

Eri näytteet, jotka oli eristetty, testattiin taas alkoholin tuotannon suhteen 6 tuntia 37eC:ssa edellä kuvatun menetelmän mukaisesti, kun havaittiin, että saadut mutantit pystyivät tuottamaan etanolia 2,69 ja 3,56 % til./til. välillä. Näyte, joka tuotti 3,56 % etanolia, merkittiin mutantiksi 4860KI1 ja mutantti, joka tuotti 3,31 % etanolia merkittiin mutantiksi 4860KI6.

3, 95044

Esimerkki 26

Fermentointi suoritettiin leijukerrosreaktorissa, jollainen on kuvattu kuviossa 6.

Fermentorin muodostavat olennaisesti leijukerrososa (1) joka on kolonni, jonka sisähalkaisija on 6 cm ja korkeus 1500 cm, ja jonka yläosassa on seisotusosa (2), jonka sisähalkaisija on 14 cm ja kaasunerotusosasto (3) sei-sotusaltaan (2) sisäpuolella. Leijukerrosta (1) syötetään alhaalta raaka-aineputkella (12) ja seisotusosa (2) varustetaan ulosvientiosalla (14) ja uudelleenkierrätys-osalla (15). Leijukerrososa (1) on termostaattisesti kontrolloitu vesivaipalla (4). Vesivaippaa (4) syötetään putken (6) kautta ja kontrolloidaan lämpötilansäätölaitteella (7) ja jäähdytysvesivaraajalla (11). Leijukerros-osan (1) sisäinen pH säädetään pH-säätölaitteella (10), joka säätelee injektioputken (5) kautta kulkevaa alkali-syöttöä. Raaka-aine tulee leijukerrososaan (1) raaka-ainevarastosta (16) sisääntuloputken (12) kautta, sisääntulo (12) on varustettu lämpötilaa osoittavalla laitteella (8) ja pH:n mittauslaitteella (9). Uudelleenkiertoon tuleva substraatti, joka lähtee seisotusosasta (2) putken (15) kautta, saatetaan uudelleen kiertoon pumpun (13) kautta ja johdetaan sisääntuloputkeen (12).

4o 95044

Valmistettiin seuraavan koostumuksen omaava substraatti : A. Maltodekstriineitä (DE 8-10) 160 g/1 NH4C1 2,5 g/1 KH2P04 0,25 g/1 B. Perussuolat

CaCl2·2H20 2,0 g/1

MgS04.7H20 10,0 g/1

NaCl 1,0 g/1 C. Hivenaineet sitruunahappo 0,250 g/1

FeS04 (NH4)2S04.6H20 0,450 g/1

ZnS04.7H20 0,084 g/1

CuS04.5H20 0,013 g/1

MnS04.4H20 0,010 g/1 H3BO3 0,010 g/1

Na2Mo04.2H20 0,010 g/1 KI 0,005 g/1 D. Vitamiinit inositoli 0,200 g/1 nikotiinihappo 0,010 g/1

Ca-D-pantotenaatti 0,010 g/1

Vit. Bl 0,010 g/1 p-aminobentsoehappo 0,006 g/1

Vit. B6 0,001 g/1 D-biotiini 0,04xl0~3 g/1 ergosteroli 0,001 g/1

Tween 20 0,250 ml/1 vaahdonestoaine 0,25 ml/1

Maltodekstriiniliuos, perussuola-alusta, vitamiini-liuos ja hivenaineliuos steriloitiin 20 minuuttia 120°C:ssa jokainen erikseen. Steriloinnin jälkeen nämä neljä liuosta lisättiin yhteen kuvatun koostumuksen muo- 4i 95044 dostamiseksi.

Leijukerrosreaktori (kuvio 6) täytettiin helmillä (keskimääräinen halkaisija: 1,8 mm) 50 %:iin (E=0,5) työskentelytilavuudesta (1). Nämä helmet muodostuivat re-aktivoiduista hiivasoluista ja amyloglukosidaasista, jotka oli immobilisoitu ristikytkettyyn kantoaineeseen kuten esimerkissä 2 on yksityiskohtaisesti kuvattu. Kokeissa, jotka tässä esimerkissä suoritettiin, käytettiin seuraa-via hiivakantojen tyyppejä: 1. Saccharomyces cerevisiae (leivinhiiva, 227 Ng) 2. Saccharomyces cerevisiae CBS 252.86 3. Saccharomyces cerevisiae CBS 253.86

Maltodekstriini (Morsweet, CPC)-liuosta lisättiin jatkuvasti fermentoriin varastosta (11) tietyllä nopeudella, joka oli sellainen, että kaikki oligosakkaridit voitiin sokeroida ja muuttaa etanoliksi. Lämpötila pidettiin 32°C:ssa ja pH 4,15:ssä lisäämällä 4,0 N NaOH:ta.

Substraattia fermentoitiin jatkuvasti edellä esitetyissä olosuhteissa. Helmien avustamiseksi leijumisessa reaktioseoksen lineaarinen nopeus säädettiin pumpulla (13) 0,15 cm/s kiertojohdossa (12). Efluenttiseoksen eta-nolikonsentraatio, sokerien, kuten maltodekstriinien, maltoosin ja glukoosin konsentraatio ja glyserolikonsent-raatio mitattiin joka päivä käyttäen korkeapainenestekro-matografia, jossa oli hiilihydraattikolonni tyyppiä HPX 07 C Biocad.

Kuviossa 7 esitetään substraatin suhde ja laimennus-nopeus reaktorissa ja lopullinen etanolikonsentraatio kolmella käytetyllä erityyppisellä hiivakannalla. Jokaista vakaata tilaa ylläpidettiin yksi viikko. Yllättävästi ainoastaan hiivakannat CBS 252.86 ja CBS 253.86 pystyivät saavuttamaan lopullisen etanolikonsentraation, joka oli yli 10,5 % tilavuudesta ja glyserolikonsentraation, joka oli alle 2 % verrattuna leivinhiivoilla saatuun lopulliseen etanolikonsentraatioon, joka oli alle 9 % ja glyse- 42 95044 rolikonsentraatioon, joka oli yli 3 % til./til. Lisäksi alkoholituotannon tasapainotila saavutettiin aikaisemmin kannalla CBS 253.86.

Esimerkki 27

Saccharomyces cerevisiae CBS 253.86 immobilisoitiin gelatiiniin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja inkuboi-tiin esimerkin 1 fermentointikasvualustan kanssa hapen läsnäollessa. Hiivasolujen kasvu helmissä mitattiin tietyin ajoin laskemalla maljoilta. Kuviossa 8 esitetään keskimääräinen elinvoimaisten solujen konsentraatio per gramma kuivaa helmimassaa suhteessa viljelyaikaan.

Lopulliseksi konsentraatioksi voitiin saada ainakin 4 x 10^ solua per gramma kuivaa helmimassaa. Panostamalla esimerkin 26 leijukerrosreaktori näillä aktivoiduilla helmillä saavutettiin hiivasolujen korkeat konsentraatiot reaktoritilavuutta kohti. Kuviossa 9 esitetään hiivasolujen lukumäärä reaktorin kuutiometriä (m3) kohti vastaan reaktorin panostaminen helmillä. Hiivasolujen konsentraatio oli ainakin kymmenen kertaa konsentraatio, joka saatiin ei-immobilisoiduilla reaktorisysteemeillä kuten uu-delleenkierto-solu-reaktoreilla.

Esimerkki 28

Korkeasti aktivoidut helmet, joissa oli ko-immobili-soitu amyloglukosidaasi ja S. cerevisiae CBS 253.86 (katso esimerkki 27), käytettiin kolmen leijukerrosreaktorin fermentointisysteemissä, kuten esimerkissä 26 on kuvattu, mutta ne yhdistettiin sarjassa toinen toisiinsa. Jokainen reaktori täytettiin helmillä 40 %:iin paino/til. työsken-telytilavuudestaan.

Ensimmäisen tilan, toisen tilan ja kolmannen tilan tilavuudet olivat vastaavasti: = 500 ml; V2 = 480 ml ja V3 = 800 ml. Raaka-aineen viipymisaika (T) näissä reaktoreissa oli Ti = 2,63 h; T2 = 2,53 h ja T3 = 4,21 h.

Il 43 9 5 0 4 4

Lopullisen etanolikonsentraation tulokset ja amylogluko-sidaasin jäännösaktiivisuus on esitetty kuviossa 2. Tämä kuvio esittää stabiilia reaktorisysteemiä etanolin tuottamiseksi keskimääräisen etanolikonsentraation ollessa kolmannessa tilassa 10,4 % tilavuudesta.

Taulukossa 7 esitetään keskimääräiset spesifiset reaktionopeudet, etanolikonsentraatiot, saannot ja tuo-tantonopeudet kolmessa tilassa.

Taulukko 7

Spesifinen reak- Etanoli- Saanto Tuotantono-tionopeus konsen- % peus (moolia (moolia traatio etanolia/h) etanolia/ kg (märkiä _helmiä/h)_

Tila 1 0,85 5,2 94 0,170

Tila 2 0,50 8,2 94 0,099

Tila 3 0,22 10,4 93 0,072 »

Claims (20)

1. 44 9 5 0 4 4
2. 1. Immobilisoitu, veteen liukenematon, hienojakoisessa muodossa oleva biokatalysaattori, joka sisältää eläviä hiiva-, bakteeri- tai kasvisoluja dispergoituna ristikyt-kettyyn geelinmuodostusaineeseen, tunnettu siitä, että ainakin osa ristikytkettyjen partikkelien sisältämästä vedestä on poistettu, ja että biokatalysaattori on valmistettavissa menetelmällä, jossa elävät solut sus-pendoidaan geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen, näin saatu seos yhdistetään orgaanisen, veteen huonosti liukenevan tai siihen liukenemattoman nesteen kanssa vesipitoisten, elävät solut ja geelinmuodostusaineen sisältävien partikkelien suspension muodostamiseksi orgaaniseen nesteeseen, suspensio käsitellään partikkelien sisältämän geelinmuodostusaineen geeliyttämiseksi, saadut partikkelit käsitellään bi- tai poly£unktionaalisella ristikytkentäaineella partikkeleissa läsnäolevan geelinmuodostusaineen ristiinkytkemiseksi, ja saaduista partikkeleista poistetaan ainakin osa niiden sisältämästä vedestä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että elävät solut dispergoidaan yhdessä yhden tai useamman entsyymin kanssa, jotka ovat yhteensopivat elävien solujen ja geelinmuodostusaineen kanssa.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että entsyymi on amyloglukosidaa-si.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että geelinmuodostus-aine on gelatiini tai seos, jonka muodostavat geelin muodostava polyhiilihydraatti ja polymeeri, joka sisältää vapaita aminoryhmiä, jotka pystyvät ristikytkeytymään 45 95044 ristikytkentäolosuhteissa.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että se sisältää elinvoimaisia S. cerevlsiae -soluja mahdollisesti yhdessä amyloglukosidaa-sin kanssa dispergoituna ristikytkettyyn gelatiiniin.
7. 6. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että siinä elävät solut ovat termofiiliseen S. cerevisiae -kantaan kuuluvia, jotka pystyvät kasvamaan hiivauute/ peptoni/glukoosissa lämpötilassa, joka on yli 40 °C.
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että termotolerantti kanta on S. cerevisiae CBS 252.86.
9. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että elävät solut ovat S. cerevisiaen etanolisensitiivistä kantaa, jonka D-arvo (aika, joka tarvitaan, jotta 90 % elävistä soluista kuolee 58 °C:ssa) on yli 25 sekuntia.
10. 9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen biokatalysaattori, tunnettu siitä, että etanolisensitiivinen kanta : on S. cerevisiae CBS 253.86.
11. 10. S. cerevisiae CBS 253.86.
12. 11. Menetelmä immobilisoidun, veteen liukenemattoman biokatalysaattorin, joka sisältää eläviä hiiva-, bakteeri- tai kasvisoluja, valmistamiseksi hienojakoisessa muodossa, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: (a) elävät solut suspendoidaan geelinmuodostusaineen vesipitoiseen liuokseen, 46 95044 (b) näin saatu seos yhdistetään orgaanisen, veteen huonosti liukenevan tai siihen liukenemattoman nesteen kanssa vesipitoisten, elävät solut ja geelinmuodostusai-neen sisältävien partikkelien suspension muodostamiseksi orgaaniseen nesteeseen, (c) suspensio käsitellään partikkelien sisältämän geelinmuodostusaineen geeliyttämiseksi, (d) kohdassa (c) saadut partikkelit käsitellään bi-tai polyfunktionaalisella ristikytkentäaineella partikkeleissa läsnäolevan geelinmuodostusaineen ristiinkytkemi-seksi, ja (e) vaiheessa (d) saaduista partikkeleista poistetaan ainakin osa niiden sisältämästä vedestä.
13. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi, joka on yhteensopiva elävien solujen ja geelinmuodostusaineen kanssa, lisätään vaiheen (a) suspensioon ja/tai se lisätään geeliytettyyn suspensioon ristikytkentävaiheessa (d).
14. 13. Patenttivaatimusten 11 tai 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan jossain patenttivaatimuksista 2-9 määritelty biokatalysaattori.
15. 14. Jonkin patenttivaatimuksista 11-13 mukainen menetel- ; mä, tunnettu siitä, että vaiheessa (c) saadut partikkelit dehydrataan mieluimmin osmoottisesti kutistamalla.
16. 15. Jonkin patenttivaatimuksista 11-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (e) saadut hiukkaset rehydrataan (lisätään vettä uudestaan) ja haluttaessa immobilisoituja soluja kasvatetaan. 1 Missä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 esitetyn bio-katalysaattorin käyttö hiilihydraattien muuntamiseksi. 47 9 5 0 4 4
17. 17. Menetelmä etanolin tuottamiseksi fermentoimalla käy-miskelpoista sokeria, tunnettu siitä, että käy-miskelpoinen sokeri saatetaan alttiiksi fermentointi-olosuhteille minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukaisen biokatalysaattorin läsnäollessa, jossa elävät solut ovat hiivasoluja.
18. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biokatalysaattoria pidetään kolonnissa jatkuvatoimisessa fermentorissa, sokeriraaka-ainetta syötetään jatkuvasti fermentoriin ja etanolia poistetaan jatkuvasti fermentorista.
19. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syötettävä raaka-aine on dekstrii-ni, elävät solut ovat S. cerevisiae CBS 252.86 tai S. cerevisiae CBS 253.86 ja biokatalysaattori sisältää lisäksi amyloglukosidaasia.
20. 20. Jonkin patenttivaatimuksista 17-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä; että käytetään leijukerros-reaktoria, jossa on päällä monitoiminen erotusosa. 48 9 5 0 4 4