CN103635586A - 结晶头孢氧哌唑中间体、其制备方法及其制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结构式(1)的头孢氧哌唑的中间体的一种晶型以及通过3’-硫代β-内酰胺核与苯基甘氨酸衍生物的酶促缩合来制备该化合物的方法。

Description

结晶头孢氧哌唑中间体、其制备方法及其制药用途
发明领域
本发明涉及头孢氧哌唑中间体的晶型，及其通过3’-硫代β-内酰胺核与苯基甘氨酸衍生物的酶促缩合的制备方法。
发明背景
通过母氨基β-内酰胺片段与侧链酸衍生物的酰化来酶法生产半合成β-内酰胺类抗生素已有广泛的描述(例如DE2163792，DE2621618，EP339751，EP473008，EP1394262，NL1010506，WO1992／01061，WO1993／12250，WO1996／02663，WO1996／05318，WO1996／23796，WO1997／04086，WO1998／56946，WO1999／20786，WO2005／00367，WO2006／069984，WO2008／110527和US3，816,253)。本领域中所用的酶大多数情况下是从大肠杆菌(Escherichia coli)得到的青霉素酰化酶，并且被固定化在多种类型的水不溶性材料上(如WO1997／04086)。
上述合成酶法已被描述为用于半合成青霉素如羟氨苄青霉素(amoxicillin)和氨苄青霉素(ampicillin)，以及用于半合成头孢菌素如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢罗齐(cefprozil)、头孢氨苄(cephalexin)和头孢拉啶(cephradine)。通常地，后一类头孢菌素仅包括β-内酰胺核的3′位没有取代的分子的例子。
然而，上述化合物之后，各种头孢菌素被开发出来，目的是改变，优选地改善抗菌性能。事实上，所有的这些化合物一直是且仍然是由发酵得到的头孢菌素C通过在C-3′位引入替代基团并且用其他侧链交换氨基己二酰侧链来化学制备的。
在分子C-3′位引入替代物确实影响了药代动力学和代谢性质，并且许多成功的抗生素通过引入基于巯基的离去基团而被开发出来，如头孢孟多(cefamandole)、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢氧哌唑(cefoperazone)、头孢雷特(ceforanide)、头孢替安(cefotiam)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢替唑(ceftezole)、头孢噻呋(ceftiofur)、头孢曲松(ceftriaxone)和头孢唑喃(cefuzonam)。(Antibiotic and chemotherapy：anti-infective agents and their use in therapy，Ed.R.G.Finch，Elsevier Health Sciences，2003，Chapter15“β-lactamantibiotics：cephalosporins”，由D.Greenwood)。
但是，在3′-位引入基于巯基的离去基团的药代动力学优势也成为了制备方法的一个重大挑战。值得注意的是，这对于环境友好的酶法似乎是真的。Won等(Appl.Biochem.Biotech.69，1—9(1998))观察到来自Escherichia coli CFC-04017的青霉素酰化酶被头孢唑啉微量的2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)基污染。在氨基己二侧链的酶水解中也类似地观察到了头孢氧哌唑和头孢匹胺的5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)基和头孢曲松的2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-双氧代-1，2，4-三嗪(TTZ)基(US6,642,020)。上述观察结果归因于少量游离巯基的释放，这是在通常利于酶促反应的水环境下容易发生的过程。事实上，与之前提到的头孢菌素相比，尚未见报道用合成的酶催化生成经济上吸引人的3′-硫代头孢菌素，如其中包含D-4-羟基苯基甘氨酸片段的化合物。因此，仍然需要通过3′-硫代β-内酰胺核与合适侧链的高效的和环境友好的酶促缩合来制备3′-硫代头孢菌素。
发明描述
在本发明的上下文中，“核”被定义为3′-硫代头孢菌素(即通式(2)的化合物)的β-内酰胺片段，并且是7-氨基-3-(1，2，3-三唑-4(5)-基硫甲基)-3-头孢烯-4-羧酸。
Figure BDA0000444619270000031
用语“侧链”被定义为在半合成的β-内酰胺化合物中连接到本文所定义的核的7-氨基位的片段，例如D-4-羟基苯基甘氨酸。用语“游离侧链”被定义为侧链的酸形式，例如D-4-羟基苯基甘氨酸。用语“侧链酯”是游离侧链的酯形式，其中游离侧链的羧基被醇酯化得到酯，例如D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯或D-4-羟基苯基甘氨酸乙酯。侧链酯可以是游离碱的形式或作为盐，例如作为盐酸盐并且侧链酯可以是固体形式或溶解在合适的溶剂中。
本发明的一个目的是提供一种通过苯基甘氨酸衍生物或类似物与核的酶促缩合来生产3′-硫代头孢菌素，如头孢曲嗪、头孢氧哌唑、头孢匹胺或类似物或中间体的方法。更具体地，本发明的一个目的是制备高度纯净的、结晶的头孢氧哌唑中间体。
核是通式(2)的化合物，被称为7-氨基-3-(1-甲基-1H-四唑-5-基硫甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(7-TMCA)。
苯基甘氨酸衍生物或类似物优选地是酯，例如D-4-羟基苯基甘氨酸乙酯、D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯。或者，苯基甘氨酸衍生物或类似物是酰胺，例如D-4-羟基苯基甘氨酸酰胺。最优选的苯基甘氨酸衍生物或类似物是D-4-羟基苯基甘氨酸酰胺、D-4-羟基苯基甘氨酸乙酯或D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯，因为由此取得的3′-硫代头孢菌素能够在具有抗菌性的头孢菌素(例如头孢氧哌唑和头孢匹胺)的制备中作为合适的中间体。
最优选的苯基甘氨酸衍生物是D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯。优选地，苯基甘氨酸衍生物或类似物具有下列性质：
·ee(对映体过量)优选地等于或大于90％，更优选地等于或大于95％，优选地等于或大于96％，优选地等于或大于97％，优选地等于或大于98％，最优选地等于或大于99％；并且
·盐含量优选地为20摩尔％或更少，更优选地为10摩尔％或更少，更优选地为5摩尔％或更少，更优选地为2摩尔％或更少，最优选地为1摩尔％或更少，表示为相对于酯的摩尔数的盐的摩尔数。
提供游离碱形式的酯能够具有所列盐含量的任何值与所列ee的任何值的组合，这对于本领域技术人员是明显的。
用于酶促缩合的酶便利地是适合于识别α-氨基酸(例如二氢苯基甘氨酸、4-羟基苯基甘氨酸和苯基甘氨酸)的酰胺或酯作为底物的酶，如青霉素酰化酶和α-氨基酸酯水解酶。在一个优选的实施方案中，发现如WO2010／072765描述的突变的青霉素G酰化酶非常适合于3′-硫代头孢菌素的合成，因为产生相对少量的不需要的硫醇。优选地，所述酶被固定化以便于从反应介质中分离以及回收以重复使用。固定化可以使用多种载体材料如硅石或基于明胶的载体来进行。
本发明提供了制备通式(1)的化合物的方法
Figure BDA0000444619270000041
其特征在于通式(2)的化合物或其盐
Figure BDA0000444619270000042
在酶的存在下与D-4-羟基苯基甘氨酸酰胺或D-4-羟基苯基甘氨酸的酯混合。
反应可以在很宽的温度范围进行，即-20℃至40℃。然而优选地，温度范围是-5℃至20℃，因为反应速度、降解速率和最佳转换之间的平衡在这个范围被调整得最好。最佳温度范围被发现是0℃到10℃，在此条件下能够得到高转换率以及低的产物降解。
反应进行的pH为5.0至10.0。然而优选地，pH范围是8.0至9.5，因为反应速度、降解速率和最佳转换之间的平衡在这个范围被调整得最好。最佳的pH范围被发现是8.5至9.0，在此条件下能够得到高转换率以及低的产物降解。在一个实施方案中发现，反应的前10至100分钟pH范围为8.8至9.2，然后pH保持在8.5至8.8的范围是有利的。这种方法一方面有利于起始材料的迅速溶解，同时在另一方面限制副产物如游离侧链和硫醇的形成。发现当起始核溶解在反应混合物中得到最高的转化率。
发现0℃至5℃的反应温度范围与8.4至9.1的pH范围的组合对于得到最高的产率和最低的副反应如形成硫醇是最优选的。在该pH范围能得到这种有利结果是出乎意料的，因为众所周知β-内酰胺在碱性pH下是不稳定的，这亦被EP1394262所证实，其提倡5.0至8.0的pH范围。一种更优选的温度范围是与8.6至8.8的pH范围结合的2℃至4℃。
可以通过在酶促反应过程中加入碱来保持pH值。合适的碱是氨、氢氧化钾水溶液和氢氧化钠水溶液。发现相比氨，氢氧化钠水溶液在不希望的硫醇的共同形成方面能够给出较好的结果。与氨相比之下，碱土金属氢氧化物如氢氧化锂水溶液、氢氧化钾水溶液或氢氧化钠水溶液惊奇地降低了不希望的硫醇的共同形成以致几乎能忽略不计。优选地，碱土金属氢氧化物的浓度为1M至10M。本领域技术人员将认为该范围的下端在量方面可能是次优的，然而上端有形成可能不利于酶和或β-内酰胺的所谓“热点(hot spots)”的风险。因此，碱土金属氢氧化物的更优选的浓度范围是2M至8M，最优选地是3M至6M。
侧链酰胺或侧链酯(如，例如D-4-羟基苯基甘氨酸酰胺或D-4-羟基苯基甘氨酸的酯)的添加可以通过将所述侧链酰胺或酯作为固体或溶解状态的添加来进行。溶解状态时，优选地是在水中，其中产生的溶液用酸如盐酸或硫酸调至低pH。在一个优选的实施方案中，侧链酯被溶解，并将得到的溶液在一定的时间间隔期间加入到反应混合物中。任选地，侧链酯以WO2008／110527和WO2008／110529所记载的方式被添加。所述时间间隔可以是10至300分钟，优选地为30至200分钟，最优选地为60至180分钟。
当酶促偶联反应达到所需的转化程度时，式(1)的3′-硫代头孢菌素用已知的方法回收，通常是在将pH降至1.5和6.5之间的一个值之后。例如，可以使用底室(bottom compartment)配备筛子且底部有出口的反应器。反应器中的内容物于是可以通过筛子排出，优选地使用向上搅拌。然后将得到的没有固定化酶的3′-硫代头孢菌素悬浮液进行过滤或离心。由于酶促偶联反应后存在的游离侧链为低量，所以最终3′-硫代头孢菌素的结晶可以在高浓度的3′-硫代头孢菌素下进行，这样得到高产率。
在一个实施方案中，产物(1)的分离包括通过过滤除去固定化的酶，通过用硫酸水溶液降低pH值(优选地降至2.5至6的值)使产物沉淀，通过过滤除去约80％的水，用甲醇稀释所得悬浮液以及过滤至干燥。任选地，还可以使用用甲醇进一步洗涤的工序。通过这种方式能够分离出产物(1)，一种具有94％产率和高品质的稳定的、可控的固体。出人意料的是，发现如果过滤期间不加入甲醇，产物变成粘性的胶状物或泥状物。以上可以适用各种有机溶剂。优选的溶剂是醇类和酮类，如丙酮、乙醇或甲醇。原则上，有机溶剂可以在过滤前加到淤浆(slurry)中，但在这种情况下混合物中存在的杂质(如D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯、D-4-羟基苯基甘氨酸和／或7-TMCA)会失去溶解性，可能污染最终产物。因此，优选地是在50-90％的液体通过过滤从淤浆中除去后，再加入醇或酮。
任选地，这对于酶促偶联之后得到的3′-硫代头孢菌素在如下所述的后续反应中衍生的情况是有用的，3′-硫代头孢菌素没有被分离和／或结晶。
在另一个实施方案中，通过上述本发明的方法得到的产物(1)进一步反应得到所希望的通式(3)的医药产品
Figure BDA0000444619270000061
其中R1选自4-乙基-2，3-双氧代-1-哌嗪羰基、4-羟基-6-甲基-烟基(或相应的酮形式6-甲基-4-氧代-1，4-二氢吡啶-3-羰基)、1H-咪唑-4-羰基-5-羧酸或衍生物如其酰胺、醚和酯组成的组的基团。优选地，R5是4-乙基-2，3-双氧代-1-哌嗪羰基或4-羟基-6-甲基-烟基。
这样的进一步反应优选地包括侧链氨基的衍生化，例如通过用酰卤在具有碳酸钾的水／乙酸乙酯中的反应，如DE2600880所描述。在所得头孢氧哌唑的形成和任选的分离之后，产物可以转化成药学上可接受的盐，优选地为钠盐，例如通过与无机钠盐如碳酸氢钠反应。
当不使用上面提到的4-乙基-2，3-双氧代-1-哌嗪酰氯，而使用4-羟基-6-甲基-烟基(或相应的酮形式6-甲基-4-氧代-1，4-二氢吡啶-3-羧酸)的活化衍生物时，反应顺序产生抗生素头孢匹胺。
在本发明的一个方面中，反应的产物(1)以晶型方式分离，该晶型由于迄今为止前所未有的酶促反应条件和下游处理工序而具备新颖性。有利的是，该晶型高度稳定和纯净从而使其成为高产率和高纯度生产头孢氧哌唑和头孢匹胺的极好的起始材料。本发明的晶型的XRD图谱显示了在13.9±0.3、15.6±0.3、19.1±0.3、19.9±0.3、22.4±0.3、23.2±0.3、24.8±0.3、28.1±0.3、29.0±0.3、32.2±0.3、33.9±0.3、38.6±0.3和48.8±0.3的2θ值的主峰。优选地，任何所述主峰的强度超过最强所述主峰的强度的10％。
在本发明的第二方面中，通过本发明的方法得到的产物用于生产具备抗菌性的药物。与化学合成的同类物相比，由此得到的药物具有能在低环境负担下以高纯度生产的优点。
附图说明
图1是通式(1)化合物在环境条件下贮存2.5小时后记录的X-射线粉末衍射图。X轴：2θ值(度)。Y轴：强度(cps)。可以看出下面明显的峰：
Figure BDA0000444619270000071
Figure BDA0000444619270000081
Figure BDA0000444619270000091
图2是通式(1)化合物在环境条件下贮存2.5小时之前记录的X-射线粉末衍射图。X轴：2θ值(度)。Y轴：强度(cps)。可以观察到的峰与图1相同，但是还有一个在2θ下的很宽的最大值-27。
材料与方法
固定化的青霉素酰化酶的制备
野生型和突变体青霉素G酰化酶的生产、分离和纯化可以按照WO1996／005318和WO2003／055998所述而进行。或者，编码突变体青霉素G酰化酶的基因可以通过基因合成获得。突变体青霉素G酰化酶的生产是通过如下实现的：将编码突变体青霉素G酰化酶的基因克隆插入适当的表达载体中，用所述载体转化合适的宿主如大肠杆菌(Escherichia coli)，并在适合生产突变体青霉素G酰化酶的条件下，培养转化的宿主，并且突变体的回收和纯化如WO 2010／072765所描述的进行。根据EP839192和EP222462所披露的方法，将如WO2010／072765的实施例1所披露的青霉素G酰化酶AA(大肠杆菌野生型青霉素G酰化酶，B：F24A和B：V148L突变)和青霉素G酰化酶突变体1(大肠杆菌野生型青霉素G酰化酶，V11A，A：S3L，A：V192E，B：F24A，B：V148L和B：F460L突变)进行固定化。
分析HPLC
反应随后进行定量HPLC分析。7-TMCA、HPGM、HPG和5-巯基-1-甲基四唑的保留因子使用标准计算；D-7-(4-羟基苯基乙酰胺基)-3-(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基头孢烯-4-羧酸的保留因子在第一批实验中基于质量平衡被扣除，然后用标准计算；头孢曲嗪的保留因子基于质量平衡被扣除。
仪器：惠普(Hewlett Packard)1100高效液相色谱仪(HPLC)，在220nm检测
柱：Intersil ODS-3，5μm4.6x150mm C／N5020-01731
流：1mL／min，停止时间37分钟
方法：洗脱剂A：KH2PO3(5.44g)和6mL H3PO41M，用MilliQ水配至2L
洗脱剂B：甲醇
洗脱剂C：乙腈
梯度：
时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％) 洗脱剂C(％)
0 98.5 0.5 1
2.5 96 3 1
11 74 25 1
15 59 40 1
25 39 60 1
28 19 80 1
32 19 80 1
32.1 98.5 0.5 1
37 98.5 0.5 1
pH值的测量
本发明中所指的pH值进行如下测量。
测量使用来自Metrohm的718STAT Titrino进行。pH电极来自Metrohm，序列号6.0234.110。它包含3M氯化钾。pH计在20℃、pH4与pH7下用来自Merck的标准溶液，用仪器的校准程序进行校准。
XRD测量
X-射线粉末衍射实验用BRUKER D8ADVANCE衍射仪、具有减少背景信号的Si-板的标准样品架进行；扫描范围5°<2θ<60°，样品旋转30rpm，0.3s／步长，0.00745°／步长，发散狭缝设置为0.3°；所有的测量条件在仪器控制文件CAMBRIDGE.DQL中设定；样品测量之外，刚玉参考样本A13-B73根据BRUKER手册的“仪器校准”一节中列出的条件测量。
实施例
实施例1
用酶制备D-7-(4-羟基苯基乙酰胺基)-3-(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基头孢烯-4-羧酸
实施例1a
将7-氨基-3-(1-甲基-1H-四唑-5-基硫甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(7-TMCA，5g)加入到蒸馏水(38g)并冷却至3℃。该混合物以400rpm搅拌并用NaOH水溶液(5M)将pH调至9.0，之后剩余的反应在pH8.8下进行。60-80分钟后，将悬浮液过滤。含4.1g7-TMCA的滤液被移回到反应器中，添加固定化的青霉素G酰化酶突变体1(3.5g，见材料与方法)，通过注射泵(加料时间2小时)以7mL／h的速度将D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯(HPGM)溶液滴注加入到所得的混合物中。该溶液通过在水(6.4g)以及25％的H2SO4(4.25g在水中)中溶解HPGM(4.0g，1.7当量)来制备。酶促反应后进行HPLC分析(见材料与方法)，并在HPGM添加结束时通过酶过滤停止。转化率为98％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有1.1％(w／w)的D-4-羟基苯基甘氨酸(HPG)、0.1％(w／w)7-TMCA、1.0％(w／w)HPGM、7.9％(w／w)的标题化合物和0.07％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。
在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.8滤液65g。在3℃的剧烈搅拌下，在10分钟内加入25％的H2SO4水溶液(2.70g)，使pH为5.7。将得到的悬浮液在3℃搅拌10分钟，然后在3号玻璃滤器进行真空过滤。当通过过滤除去60％的体积后(回收40g母液)，向滤器中剩余的悬浮液中加入MeOH(14g)，溶剂混合物通过过滤完全除去。最终的固体用MeOH(15g)洗涤。回收标题产物，产率以起始材料7-TMCA为基础为90％。以HPLC分析为基础，混合物含有0.08％HPG、0.63％HPGM、0.41％7-TMCA和98.88％标题化合物(以HPLC面积百分比为基础的数据)。1H-NMR(2％DCl在D2O中在300K，700MHz NMR)。数值以ppm给出，用TMS作为内标：3.5—3.7(dd，2H)，4.05(s，3H)，4.1—4.3(dd，2H)，5.1(d，1H)，5.25(s，1H)，5.7(d，1H)，7.0(d，2H)，7.4(d，2H)。XRD见图1。
实施例1b
如实施例1a，但具有以下不同：使用1M的氢氧化钠对反应进行滴定，且下游处理不使用MeOH。转化率是93％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.75％(w／w)HPG、0.3％(w／w)7-TMCA、0.2％(w／w)HPGM、6.6％(w／w)的标题化合物和0.13％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.6滤液81g。在3℃的剧烈搅拌下，在10分钟内加入25％的H2SO4水溶液(1.6g)，使pH为7.0。在此操作期间，沉淀出白色固体并将其分离，分离后形态变为褐色胶状物。
实施例1c
如实施例1b，但具有以下不同：HPGM作为固体在反应中加入，并且反应在pH8.7下进行。
240分钟后，转化率为67％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.43％(w／w)HPG、1.6％(w／w)7-TMCA、0.12％(w／w)HPGM、6.1％(w／w)标题化合物和0.12％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。
实施例1d
如实施例1c，但具有以下不同：用25％的氨水对反应进行滴定。
240分钟后，转化率为63％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.34％(w／w)HPG、3.04％(w／w)7-TMCA、0.14％(w／w)HPGM、6.1％(w／w)标题化合物和0.23％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。
实施例1e
如实施例1a，但具有以下不同：在pH8.8下用25％的氨水对反应进行滴定，下游处理不使用MeOH。
转化率为96％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.88％(w／w)HPG、0.26％(w／w)7-TMCA、0.16％(w／w)HPGM、7.14％(w／w)标题化合物和0.9％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.8滤液65g。在3℃的剧烈搅拌下，在10分钟内加入25％的H2SO4水溶液(3.52g)，使pH为4.0。在此操作期间，沉淀出白色固体并将其分离，分离后形态变为褐色胶状物。
实施例1f
如实施例1e，但具有以下不同：反应在pH7.2和18℃进行，并在相同的pH下在下游处理中应用过滤。
3小时后转化率为81％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有1.05％(w／w)HPG、0.78％(w／w)7-TMCA、0.02％(w／w)HPGM、6.4％(w／w)标题化合物且没有5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到一种固体，其呈现95％面积百分比的所需产物和5％面积百分比的起始材料7-TMCA。该样品的NMR分析显示83.7％的产物纯度，以及存在6.8％的7-TMCA。
实施例1g
如实施例1d，但具有以下不同：HPGM作为固体在酶促反应开始时加入，其在10℃pH8.7-7.7下进行。
245分钟后，转化率为88％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.77％(w／w)HPG、0.66％(w／w)7-TMCA、0.76％(w／w)HPGM、10.77％(w／w)标题化合物，以及非量化量(w／w)的5-巯基-1-甲基四唑。S／H的比值为9.4。
实施1h
如实施例1g，使用固定化的青霉素G酰化酶AA替代固定化的青霉素G酰化酶突变体1。
295分钟后，转化率为72％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.18％(w／w)HPG、2.03％(w／w)7-TMCA、2.51％(w／w)HPGM、8.56％(w／w)标题化合物以及非量化量(w／w)的5-巯基-1-甲基四唑。S／H的比值为18。
例如1i
如实施例1g，但具有以下不同：HPGM作为溶液在反应中加入。
180分钟后，转化率为95％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.89％(w／w)HPG、0.35％(w／w)7-TMCA、0.16％(w／w)HPGM、10.43％(w／w)标题化合物以及而非量化量(w／w)的5-巯基-1-甲基四唑。S／H的比值为4.1。
实施例1j
如实施例1a，但具有以下不同：使用10M NaOH将反应滴定并且将产物从pH2.72分离。
转化率为98％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有1.12％(w／w)HPG、0.12％(w／w)7-TMCA、1.18％(w／w)HPGM、8.9％(w／w)标题化合物以及0.04％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.8滤液59g。在3℃的剧烈搅拌下，在5分钟内加入25％的H2SO4水溶液，使pH为2.72。将所得悬浮液用同等体积的MeOH稀释，然后产物通过过滤被回收。以HPLC分析为基础，混合物含有3.8％HPG、2.9％HPGM、0.51％7-TMCA以及92.7％的标题化合物(以HPLC面积百分比为基础的数据)。
实施例1k
如实施例1j，在下游处理中加入丙酮代替MeOH。
在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.8滤液59g。在3℃的剧烈搅拌下，在5分钟内加入25％的H2SO4水溶液，使pH为2.72。将所得悬浮液用同等体积的丙酮稀释，然后产物通过过滤被回收。以HPLC分析为基础，混合物含有4.3％HPG、2.3％HPGM、0.51％7-TMCA、0.5％5-巯基-1-甲基四唑以及92.1％的标题化合物(以HPLC面积百分比为基础的数据)。
实施例11
如实施例1j，但具有以下不同：反应在pH8.5进行并且MeOH在下游处理开始时被加入。
转化率为97％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有1.44％(w／w)HPG、0.11％(w／w)7-TMCA、0.85％(w／w)HPGM、8.2％(w／w)标题化合物以及0.11％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.5滤液63g。在3℃的剧烈搅拌下，加入同等量的MeOH，然后加入25％的H2SO4水溶液，使pH为2.78。通过过滤回收的混合物含0.2％HPG、1.5％HPGM、0.3％7-TMCA以及98.5％标题化合物(以HPLC面积百分比为基础的数据)。
实施例1m
如实施例11，但具有以下不同：下游处理中在pH4.8沉淀化合物，并且过滤中使用丙酮代替MeOH。
转化率为94％(w.r.t.7-TMCA)。混合物含有0.64％(w／w)HPG、0.36％(w／w)7-TMCA、0.64％(w／w)HPGM、8.37％(w／w)标题化合物以及0.03％(w／w)5-巯基-1-甲基四唑。在HPLC色谱图中，能够看到2个轻微的未识别的<1％HPLC面积百分比的杂质。在酶促反应结束时，在1号玻璃滤器通过过滤除去酶，得到pH8.6滤液59g。在3℃的剧烈搅拌下，加入5g丙酮，通过在3℃滴注加入2.3g25％的H2SO4水溶液，pH降至4.8。混合物用5g额外的丙酮稀释，然后过滤。通过HPLC，滤器上的固体显示为面积百分比93.5％ABC、2.8％HPG、2.5％HPGM以及1.6％7-TMCA。母液中检测到约50％的产物。因此，将固体与母液混合和并用100g MeOH稀释。过滤后，73％的产物通过过滤回收。以HPLC分析为基础，混合物含有0.2％HPG、1.5％HPGM、0.3％7-TMCA和98.5％标题化合物(以HPLC面积百分比为基础的数据)。
实施例2
7-TMCA的降解
在酶促缩合实验中，7-TMCA发生了化学降解，这也发生在没有酶的情况下，在碱性pH和高浓度7-TMCA下会更快。降解产物是酶促反应过程形成的主要副产物，并且通过质量分析确定为5-巯基-1-甲基四唑。使用氨水(25％)滴定时会发生化学降解，但在使用NaOH水溶液(1M或5M或10M)时该化学降解是可忽略的。具体地，5-巯基-1-甲基四唑的量在使用5M的NaOH水溶液的溶解步骤中是检测不到的，在酶促反应结束时是0.05％(w／w)；在相同反应条件下使用氨水(25％)的溶解步骤中和酶促反应结束时分别为0.01％(w／w)和0.24％(w／w)，或在不同反应条件下更大。
实施例3
HPGM的降解
在7-TMCA和HPGM的酶促缩合反应中，后者化合物水解成HPG。如下所示，HPG的形成是由于在所施加的实验条件下的酶促而不是化学水解。两个反应在2℃下并行开始。两者均用pH8.7的水(40g)与HPGM溶液(0.5ml在H2SO4水溶液中，与存在于酶促反应中的HPGM的浓度相当)混合。在其中一个反应器中添加固定化的青霉素G酰化酶突变体1(5g)并通过分析HPLC监测这两个反应。5分钟内，HPGM被酶完全转换为HPG，而化学空白中在2h内没有HPG被记录，只有9％HPGM在20小时内被水解。
实施例4
头孢氧哌唑游离酸
D-7-(4-羟基苯基乙酰胺基)-3-(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基头孢烯-4-羧酸(500mg)在室温下悬浮于水(10ml)中。加入碳酸钾后(230mg，1.5当量)之后，悬浮液变成澄清溶液。向该混合物中加入乙酸乙酯(5mL)和乙基-2，3-双氧代-1-哌嗪酰氯(210mg，1当量)。搅拌过夜后，反应通过分析HPLC分析，显示了以起始材料为基础42％的所需产物头孢氧哌唑。

Claims (13)

1.一种结构式(1)的化合物的晶型，
Figure FDA0000444619260000011
其特征在于所述结构式(1)的化合物的所述晶型的XRD图谱有13.9±0.3、19.1±0.3、28.1±0.3、32.2±0.3和33.9±0.3的2θ值的峰。
2.根据权利要求1的晶型，进一步包括15.6±0.3，19.9±0.3，22.4±0.3，23.2±0.3，24.8±0.3，29.0±0.3，38.6±0.3和48.8±0.3的2θ值的峰。
3.根据权利要求1至2中任意一项的晶型，其中任意的所述峰的强度超过最强所述峰的强度的10％。
4.一种制备结构式(1)的化合物的方法，
Figure FDA0000444619260000012
其特征在于结构式(2)的化合物或其盐
Figure FDA0000444619260000013
在酶的存在下与D-4-羟基苯基甘氨酸酰胺或D-4-羟基苯基甘氨酸的酯混合。
5.根据权利要求4的方法，其中所述酶是固定化的青霉素G酰化酶。
6.根据权利要求4至5中任意一项的方法，其中所述酶是青霉素G酰化酶AA或青霉素G酰化酶突变体1。
7.根据权利要求4至6中任意一项的方法，所述方法在0℃和5℃之间并且在8.4至9.1的pH范围进行。
8.根据权利要求4至7中任意一项的方法，其中通过添加氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠或其混合物的水溶液来保持所述pH。
9.根据权利要求4至8中任意一项的方法，其中通过结晶和过滤或离心的方式分离所述结构式(1)的产物。
10.根据权利要求9的方法，其中所述分离通过过滤并且添加有机溶剂来除去50-90％的液体进行。
11.根据权利要求4至10中任意一项的方法，其中所述混合是与D-4-羟基苯基甘氨酸乙酯或D-4-羟基苯基甘氨酸甲酯。
12.根据权利要求11的方法，进一步包括将所述结构式(1)的化合物与4-乙基-2，3-双氧代-1-哌嗪羧酸的衍生物反应得到头孢氧哌唑。
13.根据权利要求1至3中任意一项所述结构式(1)的化合物的晶型在制造具有抗菌性药物中的用途
Figure FDA0000444619260000021
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