NL1007302C2

NL1007302C2 - Werkwijze voor de bereiding van een ß-lactam antibioticum.

Info

Publication number: NL1007302C2
Application number: NL1007302A
Authority: NL
Inventors: Harold Monro Moody; Theodorus Johannes Godf Dooren; Johanna Christ Wagemans-Smeets
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 1999-04-20
Also published as: AU9560198A; CN1165626C; IN188152B; WO1999020786A1; EG21235A; EP1023454B1; KR20010024519A; ATE234934T1; TR200000991T2; KR100516271B1; US6287799B1; BR9813079A; ES2195400T3; CN1282377A; EP1023454A1

Description

- 1 - PN 9377 WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN EEN fi-LACTAM ANTIBIOTICUM 5

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een β-lactam antibioticum waarbij een β-lactamkern wordt onderworpen aan een enzymatische acyleringsreactie met behulp van een acyleringsmiddel bij 10 een molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern kleiner dan 2,5.

Een dergelijke werkwijze is bijvoorbeeld beschreven in WO-A-96/23897.

De in de enzymatische acyleringsreactie te 15 behalen opbrengst aan β-lactam antibioticum per hoeveelheid ingezette β-lactamkern en per hoeveelheid ingezet acyleringsmiddel bij gebruikmaking van de bekende werkwijze is in het algemeen relatief laag aangezien de β-lactamkernen en/of de β-lactam antibiotica vaak relatief 20 instabiel zijn, terwijl door de veelal geringe oplosbaarheid van de reactanten, de reactietijd relatief lang is. Daarnaast geldt dat bij de genoemde relatief lage verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern slechts een relatief lage opbrengst aan β-lactam antibioticum per 25 hoeveelheid ingezette β-lactamkern kan worden bereikt.

De uitvinding voorziet in een werkwijze waarin in een enzymatische acyleringsreactie een kortere reactietijd wordt gerealiseerd en een hogere opbrengst aan β-lactam antibioticum per hoeveelheid ingezette β-30 lactamkern en/of per hoeveelheid ingezet acyleringsmiddel wordt gerealiseerd, terwijl de verhouding toegepaste hoeveelheid acyleringsmiddel tot β-lactamkern relatief laag is.

Dit wordt volgens de uitvinding bereikt doordat 35 gedurende ten minste een deel van de acyleringsreactie het acyleringsmiddel en/of de β-lactamkern oververzadigd aanwezig is/zijn in het reactiemengsel.

10 07302 - 2 -

Aanvraagster heeft namelijk gevonden dat het mogelijk is een sterke oververzadiging van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel in het reactiemengsel te realiseren en dat, en dit is een bijzonder verrassend 5 aspect, de oververzadiging urenlang stabiel kon worden gehandhaafd. Hierdoor kan de concentratie van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel in oplossing sterk worden verhoogd, waardoor een snellere reactie wordt gerealiseerd waarbij minder afbraak van het β-lactam 10 antibioticum en/of de reactanten plaatsvindt, en tevens een hogere opbrengst aan β-lactam antibioticum per hoeveelheid ingezette β-lactamkern en/of per hoeveelheid ingezet acyleringsmiddel kan worden bereikt. Dit resulteert tevens in een hogere productiecapaciteit.

15 Daarnaast is het bekend uit de literatuur, bijvoorbeeld uit WO-A-92/01061 dat een hoge opbrengst aan β-lactam antibioticum per hoeveelheid ingezette β-lactamkern kan worden verkregen door een hoge molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern toe te 20 passen. Een nadeel van het toepassen van een hoge molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern is echter dat ten gevolge van optredende hydrolyse van het acyleringsmiddel (en eventueel het β-lactam antibioticum), grote hoeveelheden acyleringsmiddel verloren gaan.

25 Bijgevolg wordt een lage synthese/hydrolyse verhouding (S/H), de molaire verhouding syntheseproduct (β-lactam antibioticum) tot hydrolyseproduct, gerealiseerd.

Bovendien is gebleken dat de opwerking van het β-lactam antibioticum veelal bemoeilijkt wordt, doordat een 30 relatief grote hoeveelheid gehydrolyseerd acyleringsmiddel ten opzichte van β-lactam antibioticum aanwezig is in het na de enzymatische acyleringsreactie verkregen reactiemengsel, waardoor een kleinere hoeveelheid β-lactam antiobioticum kan worden geïsoleerd.

1007302 - 3 -

Onder de in de acyleringsreactie te behalen opbrengst aan β-lactam antibioticum per hoeveelheid ingezette reactant (β-lactamkern of acyleringsmiddel) wordt in het kader van deze uitvinding verstaan de 5 (molaire) hoeveelheid in de acyleringsreactie gevormd β-lactam antibioticum per (molaire) hoeveelheid ingezette reactant.

Onder oplosbaarheid van een verbinding in een mengsel wordt in het kader van deze uitvinding verstaan de 10 opgeloste concentratie van de verbinding in aanwezigheid van alle andere componenten van het mengsel, uit te drukken in mmol/liter of massa%. De oplosbaarheid wordt gemeten door de verbinding bij constante pH en temperatuur en in aanwezigheid van alle componenten van het mengsel op 15 te laten lossen. Uit de na het bereiken van de evenwichtssituatie (verzadigde oplossing) opgeloste hoeveelheid van de verbinding kan vervolgens de oplosbaarheid berekend worden.

In het kader van deze uitvinding geldt dat een 20 verbinding oververzadigd in een mengsel aanwezig is wanneer de opgeloste concentratie van die verbinding in het mengsel groter is dan oplosbaarheid. Onder de oververzadigingsfactor wordt de verhouding van beide boven genoemde oplosbaarheden bedoeld (oververzadigd gedeeld 25 door verzadigd). De te behalen oververzadigingsfactor en de tijd gedurende welke de oververzadiging in stand wordt gehouden hangen af van een aantal factoren bijvoorbeeld de aard en concentratie van de verbinding, de aard en concentraties van de overige componenten in het mengsel, 30 de pH en de temperatuur.

De concentratie opgeloste β-lactamkern wordt uitgedrukt als de hoeveelheid β-lactamkern in molen per kg reactiemengsel; de totale concentratie, opgeloste en niet opgeloste, β-lactamkern en β-lactam antibioticum wordt i y U ! o U i- - 4 - uitgedrukt als de hoeveelheid β-lactamkern plus β-lactam antibioticum in molen per kg totaal reactiemengsel; het totale reactiemengsel kan naast de oplossing een aantal vaste stoffen bevatten, bijvoorbeeld β-lactamkern, β-5 lactam antibioticum (gehydrolyseerd) acyleringsmiddel en geïmmobiliseerd enzym.

Een mengsel waarin de β-lactamkern respectievelijk het acyleringsmiddel oververzadigd aanwezig zijn, kan bijvoorbeeld worden verkregen met 10 behulp van pH-variatie. Daarbij kan zonodig eerst een geconcentreerd mengsel als slurry of oplossing worden gemaakt door in de vorm van vaste stof aanwezige β-lactamkern respectievelijk acyleringsmiddel, op te lossen bijvoorbeeld met behulp van pH-verhoging of pH-verlaging, 15 respectievelijk pH-verlaging. Bij voorkeur is in het verkregen mengsel de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel in opgeloste vorm aanwezig. Het is echter ook mogelijk dat nog een deel van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel in vaste vorm aanwezig is. Vervolgens 20 kan deze slurry of oplossing worden onderworpen aan een pH-verlaging of een pH-verhoging, respectievelijk pH-verhoging. Hierdoor wordt een slurry of oplossing verkregen waarin de β-lactamkern respectievelijk het acyleringsmiddel oververzadigd aanwezig is.

25 Het oplossen van eventueel aanwezige vaste β- lactamkern kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door pH-verlaging tot een pH lager dan 3, bij voorkeur lager dan 2, in het bijzonder lager dan 1 is bereikt; of door pH-verhoging tot een pH hoger dan 6, bij voorkeur hoger dan 30 7, in het bijzonder hoger dan 8. In de praktijk zal de eind pH bij voorkeur zodanig gekozen worden dat de β-lactamkern net volledig in oplossing gaat, en dus een zo geconcentreerd mogelijke oplossing wordt verkregen. In de praktijk zal de geconcentreerde oplossing meestal een ] 0 π 7 9 9/ - 5 - concentratie van ten minste 5 gew.% hebben. De eind pH zal meestal lager zijn dan 10 en groter dan 0.

Uit een, eventueel na pH-verlaging danwel pH-verhoging verkregen, oplossing kan vervolgens een 5 oververzadigde oplossing worden verkregen door de pH te verhogen danwel te verlagen bijvoorbeeld tot een waarde tussen 4,5 en 9,0, bij voorkeur tussen 5,5 en 8,5, in het bijzonder tussen 6,0 en 8,0.

Het oplossen van eventueel aanwezig vast 10 acyleringsmiddel kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door pH-verlaging tot een pH-waarde lager dan 8,0, bij voorkeur lager dan 6,5, in het bijzonder lager dan 5,0 is bereikt, bij voorkeur wordt de eind pH zodanig gekozen dat het acyleringsmiddel net volledig is opgelost en dus een zo 15 geconcentreerd mogelijke oplossing wordt verkregen. In de praktijk zal de geconcentreerde oplossing meestal een concentratie van ten minste 5 gew.% hebben. De eind pH zal veelal groter dan 1 zijn.

Uit een, eventueel na pH-verlaging, verkregen 20 mengsel, bij voorkeur een oplossing, kan bijvoorbeeld een in het acyleringsmiddel oververzadigd mengsel worden verkregen door de pH te verhogen bijvoorbeeld tot een waarde groter dan 4,5, bij voorkeur groter dan 5,5, in het bijzonder groter dan 6,0.

25 Een andere manier om een mengsel te verkrijgen waarin de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel oververzadigd aanwezig zijn, is bijvoorbeeld na temperatuurverlaging, eventueel nadat eerst via temperatuurverhoging of pH-verandering eventueel aanwezige 30 vaste β-lactamkern en/of vast acyleringsmiddel tenminste gedeeltelijk is/zijn opgelost.

Het oplossen kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door temperatuurverhoging bijvoorbeeld totdat (nagenoeg) alle vaste stof in oplossing is, bijvoorbeeld tot een 1007302 - 6 - temperatuur hoger dan 15°C, bij voorkeur hoger dan 20°C, in het bijzonder hoger dan 25°C. Uit het verkregen mengsel kan vervolgens een oververzadigde slurry of oplossing worden verkregen door temperatuurverlaging tot een 5 temperatuur lager dan 20°C, bij voorkeur lager dan 15°C, in het bijzonder lager dan 10°C.

Bij voorkeur wordt het oververzadigde mengsel bereid via pH-verandering aangezien dan een hogere oververzadigingsfactor kan worden bereikt. In de praktijk 10 zal veelal tegelijk een pH-verandering en een temperatuurverlaging worden toegepast bij de bereiding van een oververzadigde oplossing.

In een geschikte uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt eerst een mengsel 15 waarin de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel oververzadigd aanwezig zijn/is aangemaakt waarna de acyleringsreactie wordt gestart bijvoorbeeld door toevoegen van (geïmmobiliseerd) enzym. Tijdens de acyleringsreactie zal de concentratie van de reactanten 20 afnemen waardoor de oververzadiging aan het einde van de acyleringsreactie zal zijn verdwenen. In een andere geschikte uitvoeringsvorm wordt de acyleringsreactie gestart met een deel van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel, al dan niet oververzadigd aanwezig, en 25 wordt vervolgens de oververzadiging in stand gehouden danwel gecreëerd door een geconcentreerd mengsel van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel met een andere pH of hogere temperatuur dan de pH of temperatuur waarbij de acyleringsreactie wordt uitgevoerd, toe te voegen aan het 30 reactiemengsel, bijvoorbeeld door middel van tritratie.

In de praktijk kunnen de β-lactamkern en het acyleringsmiddel beide oververzadigd tijdens de acyleringsreactie aanwezig zijn, bijvoorbeeld door aan de acyleringsreactor tegelijk een geconcentreerde oplossing 1007302 -Ιοί slurry van de β-lactamkern (met hoge pH of eventueel met lage pH) en een geconcentreerde oplossing of slurry van het acyleringsmiddel (met lage pH) te doseren. Desgewenst kan daarbij de pH tijdens de acyleringsreactie 5 constant gehouden worden, bijvoorbeeld door titratie.

De werkwijze volgens de uitvinding kan bijzonder geschikt worden toegepast in de bereiding van cefaclor. Cefaclor is bij hoge pH (> 6,5) weinig stabiel terwijl de oplosbaarheid van de overeenkomstige β-lactamkern (7-10 amino-3-chloor-cef-3-em-4-carbonzuur;7-ACCA) laag is bij die pH-waarden (ongeveer 6,0-6,5) waar de afbraak van cefaclor nog relatief laag is. Hierdoor was zowel bij relatief hoge als bij relatief lage pH de opbrengst aan cefaclor laag, waardoor een technisch/commercieel 15 aantrekkelijk proces niet mogelijk was. Door gebruik te maken van bijvoorbeeld naftol als complexerend agens kon de opbrengst aan cefaclor per hoeveelheid ingezet 7-ACCA en per hoeveelheid ingezet acyleringsmiddel, weliswaar worden verbeterd; de toepassing van dergelijke toxische 20 hulpstoffen in de bereiding van antibiotica is echter nadelig aangezien ze volledig dienen te worden verwijderd, hetgeen extra processtappen met zich meebrengt waardoor de economie van het proces sterk negatief wordt beïnvloed.

Verrassenderwijze is gebleken dat met de werkwijze volgens 25 de uitvinding een bijzonder hoge oververzadigingsfactor (> 10) kan worden bereikt, waardoor het mogelijk is om de acyleringsreactie uit te voeren bij een relatief lage pH (6,0-6,5), terwijl toch de concentratie van de β-lactamkern voldoende hoog is. Hierdoor is het mogelijk 30 geworden cefaclor in hoge opbrengst te bereiden via enzymatische acylering zonder gebruik te maken van hulpstoffen, waardoor een technisch/economisch aantrekkelijk proces gerealiseerd kan worden.

Een andere toepassing van de werkwijze volgens ' U ύ ( vi U £ - 8 - de uitvinding ligt bijvoorbeeld in de bereiding van ampicilline door acylering van 6-aminopenicillaanzuur (6-APA) met behulp van D-fenylglycineamide (FGA). Aangezien 6-APA en ampicilline relatief snel afbreken bij hoge 5 concentratie en bij hoge pH is het van belang de acyleringsreactie zo snel mogelijk te laten verlopen bij een zo laag mogelijke pH. Door bijvoorbeeld eerst van een mengsel van 6-APA en FGA de pH te verhogen tot een waarde tussen 7,0 en 8,0, deze weer direct te verlagen tot een pH 10 tussen 6,0 en 6,5 en vervolgens direct de enzymatische reactie te laten plaatsvinden, blijkt het mogelijk om in korte tijd een hoge opbrengst aan ampicilline per hoeveelheid ingezet 6-APA en per hoeveelheid ingezet acyleringsmiddel te bereiken waarbij slechts gedurende 15 zeer korte tijd een relatief hoge concentratie 6-APA in oplossing aanwezig is, terwijl bij de relatief laag gekozen pH-waarde de afbraak van ampicilline laag wordt gehouden. Daarnaast is tevens de hydrolyse van FGA tot D-fenylglycine (FG) lager.

20 De werkwijze volgens de uitvinding kan eveneens

met voordeel worden toegepast in de enzymatische bereiding van cephalexine via acylering van 7-aminodesacetoxy-cefalosporaanzuur (7-ADCA) met behulp van D-fenylglycineamide (FGA). De acyleringsreactie wordt 25 veelal uitgevoerd bij een relatief hoge pH-waarde, bijvoorbeeld tussen 7,5 en 8,5, waarbij tevens (ongewenste) hydrolyse van het FGA tot D-fenylglycine (FG) plaatsvindt. Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding bijvoorbeeld door een mengsel van FGA en 7-ADCA 30 eerst op een hogere pH te brengen, bijvoorbeeld een pH

tussen 8,0 en 9,0, en vervolgens weer aan te zuren tot een pH tussen 6,5 en 8,5, wordt een snellere reactie gerealiseerd waarbij de hydrolyse van het acyleringsmiddel wordt beperkt.

1007302 - 9 -

Een ander voorbeeld van de werkwijze volgens de uitvinding is de toepassing in de enzymatische bereiding van amoxicilline uit 6-APA en D-p-hydroxyfenylglycine methylester (FGHM) en in de bereiding van cefadroxil uit 5 7-ADCA en FGHM. De oplosbaarheid van FGHM is relatief laag en neemt af met oplopende pH, terwijl tevens de oplosbaarheid van 6-APA resp. 7-ADCA relatief laag is en afneemt bij afnemende pH. Gebleken is dat bijvoorbeeld door een mengsel van 6-APA resp. 7-ADCA en FGHM te 10 onderwerpen aan een pH verlaging tot een waarde waarbij FGHM nagenoeg volledig is opgelost (bijvoorbeeld een pH waarde tussen 5 en 6) en vervolgens aan een pH-verhoging tot een waarde bijvoorbeeld tussen 6 en 7,5, een oververzadiging van FGHM van ongeveer een factor 3-5 kan 15 worden bereikt. Hierdoor is het mogelijk de acyleringsreactie uit te voeren bij iets hogere pH, waarbij de concentratie van de β-lactamkern in oplossing hoger is, terwijl ook de concentratie van het acyleringsmiddel nog relatief hoog is.

20 Een andere uitvoeringsvorm is het relatief geconcentreerd oplossen van 7-ADCA met een base tot een pH tussen bijvoorbeeld 8 en 9, en vervolgens toevoegen van een geconcentreerde, zure oplossing van FGHM, waarbij de pH daalt. In deze uitvoeringsvorm kan tegelijkertijd een 25 oververzadiging van zowel 7-ADCA als FGHM worden bereikt. De enzymatische reactie kan worden gestart na toevoegen van alle reactanten. Het is ook mogelijk om tijdens de reactie nog (een gedeelte van de) geconcentreerde FGHM- of 7-ADCA-oplossing (of slurry) toe te voegen.

30 De werkwijze volgens de uitvinding kan geschikt worden toegepast bij de bereiding van β-lactam antibiotica, bijvoorbeeld cephalexine, ampicilline, cefaclor, amoxicilline, cephradine, cefadroxil, cefotaxim, cefazoline, cefprozil, loracarbef en cefaloglycine.

10 0730 2 - 10 -

In principe kan elke β-lactamkern worden toegepast; in het bijzonder een β-lactamkern met de algemene formule (1) 5 E° /\ io o'

o * "OH

waarin R0 staat voor H of een alkoxygroep met 1-3 C-atomen; Y staat voor CH2, O, S of een geoxideerde vorm van 15 zwavel; en Z staat voor X“' Ί Ίι \ 2 0 Ri r ^Ri , of ^\:η2 waarin RL bijvoorbeeld staat voor H, OH, halogeen, een alkoxygroep met 1-5 C-atomen, een alkylgroep met 1-5 C-atomen, een cycloalkylgroep met 4-8 C-atomen, een aryl of 25 een heteroarylgroep met 6-10 C-atomen, waarbij de groepen eventueel gesubstitueerd kunnen zijn bijvoorbeeld met een alkyl-, een aryl-, een carboxy- of een alkoxygroep met 1-8 C-atomen; en waarin de carbonzuurgroep desgewenst een estergroep kan zijn.

30 Geschikte voorbeelden van β-lactamkernen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn penicillinederivaten, bijvoorbeeld 6-aminopenicillaanzuur (6-APA), en cefalosporine-derivaten, bijvoorbeeld een 7-aminocefalosporaanzuur al of niet met 35 een substituent op de 3-plaats, bijvoorbeeld 7-aminocefalosporaanzuur (7-ACA), 7-aminodesacetoxycefalosporaanzuur (7-ADCA) en 7-amino-3- 10 07302 - 11 - chloor-cef-3-em-4-carbonzuur (7-ACCA) en 7-amino-3-chloor- 8-oxo-l-azabicyclo[4.2.0]oct-2-een-2-carbonzuur.

In de (enzymatische) acyleringsreactie kunnen als acyleringsmiddel bijvoorbeeld een fenylglycine in 5 geaktiveerde vorm bij voorkeur een (primair, secundair of tertiair) amide of zout daarvan, of een lager alkyl (1-4C) ester, bijvoorbeeld een methylester worden toegepast; als fenylglycines komen bijvoorbeeld in aanmerking al dan niet gesubstitueerde fenylglycines in het bijzonder 10 fenylglycine, p-hydroxyfenylglycine, dihydrofenylglycine.

Als enzym kan daarbij in principe elk enzym worden toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreactie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding 15 penicilline amidase of penicilline acylase. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld beschreven in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry, Augustus 1989 p. 146-154 en in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry International, Juni 1990, p. 97-103. Voorbeelden van geschikte enzymen 20 zijn enzymen afgeleid van Acetobacter, in het bijzonder Acetobacter pasteurianum. Aeromonas, Alcaliaenes. in het bijzonder Alcaliaenes faecalis. Aphanocladium. Bacillus sp.. in het bijzonder Bacillus meaaterium. Cephalosporium. Escherichia, in het bijzonder Escherichia coli.

25 Flavobacterium. Fusarium. in het bijzonder Fusarium oxvsporum en Fusarium Solani. Kluvvera. Mvcoplana. Protaminobacter. Proteus. in het bijzonder Proteus rettaari. Pseudomonas en Xanthomonas. in het bijzonder Xanthomonas citrii.

30 Bij voorkeur wordt een geïmmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig afgescheiden en hergebruikt kan worden.

Van de geïmmobiliseerde enzymen die commerciëel verkrijgbaar zijn, zijn bijvoorbeeld bijzonder geschikt 10 07302 - 12 - gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygel® commercieel verkrijgbaar is, het geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati en het geïmmobiliseerde Penicilline-5 G acylase van Pharma Biotechnology Hannover. Daarnaast kunnen enzymen ook als kristallijne stof worden ingezet (CLEC 's™).

De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal lager dan 10 40°C, bij voorkeur tussen -5 en 35°C. De pH waarbij de enzymatische acyleringsreactie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 5,5 en 9,5, bij voorkeur tussen 6,0 en 9,0.

Bij voorkeur wordt de reactie vrijwel volledig gestopt wanneer nagenoeg de maximale conversie is bereikt. 15 Een geschikte uitvoeringsvorm om de reactie te stoppen is het verlagen van de pH, bij voorkeur tot een waarde tussen 4,0 en 6,3, in het bijzonder tussen 4,5 en 5,7. Een andere geschikte uitvoeringsvorm is het verlagen van de temperatuur van het reactiemengsel zodra de maximale 20 conversie is bereikt. Ook een combinatie van beide uitvoeringsvormen is mogelijk.

Nadat de reactie vrijwel gestopt is bij het bereiken van maximale conversie, is het reactiemengsel meestal aanwezig in de vorm van een suspensie die meerdere 25 vaste stoffen, bijvoorbeeld het antibioticum, D- fenylglycine en eventueel geïmmobiliseerd enzym bevat. Het geïmmobiliseerde enzym wordt, vanwege de proceseconomie, bij voorkeur teruggewonnen. Dit kan bijvoorbeeld geschikt worden uitgevoerd door het reactiemengsel roerend te 30 filteren over een zeef, waarbij bij voorkeur de draairichting van de roerder zodanig wordt gekozen dat de suspensie in het centrum van de roerder omhooggepompt wordt. Vervolgens kunnen waardevolle componenten, bijvoorbeeld het antibioticum en FG, worden gewonnen, 10 07302 ' - 13 - bijvoorbeeld met behulp van een pH-verandering.

Een pH-verlaging kan in het kader van de uitvinding bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door toevoegen van een zuur. Geschikte zuren zijn bijvoorbeeld 5 minerale zuren, in het bijzonder zwavelzuur, zoutzuur of salpeterzuur en carbonzuren, bijvoorbeeld azijnzuur, oxaalzuur en citroenzuur. Een pH-verhoging kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door toevoegen van een base. Geschikte basen zijn bijvoorbeeld anorganische 10 basen, in het bijzonder ammonia, kaliloog of natronloog en organische basen, bijvoorbeeld triethylamine en FGA. Bij voorkeur wordt ammonia toegepast.

De enzymatische acyleringsreaktie en de aangegeven maatregelen bijvoorbeeld de aanmaak van de 15 oververzadigde mengsels kunnen worden uitgevoerd in water. Desgewenst kan het reaktiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol.%. Voorbeelden van organische oplosmiddelen die kunnen worden toegepast 20 zijn alcoholen met 1-7 C-atomen, bijvoorbeeld een monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.

De molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-25 lactamkern, d.w.z. de totale hoeveelheid toegevoegd acyleringsmiddel gedeeld door de totale hoeveelheid toegevoegde β-lactamkern uitgedrukt in molen, is kleiner dan 2,5. Bij voorkeur ligt de molaire verhouding tussen 0,5 en 2,0, in het bijzonder tussen 0,7 en 1,8.

30 De enzymatische acyleringsreactie wordt bij voorkeur als batch proces uitgevoerd. Desgewenst is het ook mogelijk om de reactie continu uit te voeren.

De uitvinding zal verder worden toegelicht aan de hand van de voorbeelden zonder evenwel daardoor te 1007302 - 14 - worden beperkt.

Voorbeelden 7-ACCA: 7-amino-3-chloor-cef-3-em-4-carbonzuur 5 7-ADCA: 7-aminodesacetoxycefalosporaanzuur 6-APA: 6-aminopenicillaanzuur AMPI: ampicilline CC1: cefaclor CEX: c epha1ex i ne 10 FG: D-fenylglycine FGA: D-fenylglyc ineamide FGH: D-p-hydroxyfenylglycine FGHM: D-p-hydroxyfenylglycine methylester 15 Assemblase™ is een geïmmobiliseerde Escherichia coli penicilline acylase uit E. coli ATCC 1105, zoals beschreven in WO-A-97/04086. De immobilisatie is uitgevoerd als beschreven in EP-A-222462, waarbij gelatine en chitosan als gelerend agens en glutaaraldehyde als 20 crosslinker zijn gebruikt.

De uiteindelijke activiteit van de Escherichia coli penicilline acylase wordt bepaald door de hoeveelheid enzym die aan de geactiveerde bolletjes is toegevoegd en bedroeg 3 ASU/g drooggewicht waarbij 1 ASU (Amoxicilline 25 Synthese Unit) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per uur 1 g Amoxicilline.3H20 genereert uit 6-APA en FGHM (bij 20°C); 6,5% 6-APA en 6,5% FGHM).

Vergelijkend Experiment A

30 Synthese van Cefaclor (geen 7-ACCA oververzadiging)

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 μπι gaas, werd gevuld met 100 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 75,4 1007302 - 15 - g FGA (0,500 mol), 4,0 g natriumbisulfiet, 700 g water, 6,6 g 4N H2S04 en 72,1 g 7-ACCA (0,300 mol). Dit mengsel werd geroerd bij T = 10°C; de pH was 7,5. Vervolgens werd het mengsel in de aanmaakreactor op t = 0 met behulp van 5 118 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

Op t = 0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. De temperatuur werd op T = 10°C gehouden. De pH werd op 7,5 gehouden door middel van titratie met 4N H2S04. Op t = 48 minuten bevatte de enzymreactor ca.: 10 215 mmol CC1 (conversie = 72%)

70 mmol 7-ACCA 175 mmol FGA 95 mmol FG

Op t = 81 minuten bevatte de enzymreactor ca.: 15 212 mmol CC1 (conversie = 71%)

61 mmol 7-ACCA 83 mmol FGA 182 mmol FG

Daarna nam de hoeveelheid CC1 af. De concentraties tijdens 20 de reactie zijn weergegeven in grafiek 1.

Voorbeeld I

Synthese van Cefaclor (7-ACCA oververzadiging)

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), 25 voorzien van een zeef bodem met 175 f/m gaas, werd gevuld met 300 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 86,6 g 7-ACCA (0,360 mol), 67,8 g FGA (0,450 mol), 4,0 g natriumbisulfiet en 402 g water. Dit mengsel werd 5 30 minuten geroerd bij T = 10°C; de pH was 7,4.

Al roerende werd de pH op 8,0 gebracht met behulp van 16,8 g geconcentreerde ammonia. Daarna werd de pH verlaagd van 8,0 naar 6,4 door dosering van 73,8 ml 4 N H2S04 gedurende 20 minuten. Vervolgens werd het mengsel 1007302 - 16 - vanuit de aanmaakreactor op t = 0 met behulp van 140 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

Op t = 0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet; T = 10°C. De pH werd op 6,4 gehouden door middel 5 van titratie met 4 N H2S04. Na 7 uur was er 66,0 ml zuur toegevoegd. De reactor bevatte nu: 300 mmol CC1 (conversie = 83%)

55 mmol 7-ACCA 100 mmol FGA

10 45 mmol FG

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 2.

Voorbeeld II

15 Synthese van Cefaclor (7-ACCA oververzadiging en 7-ACCA dosering tijdens de enzymatische reactie).

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 μιη gaas, werd gevuld met 150 g netto-nat Assemblase™.

20 Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 48,1 g 7-ACCA (0,200 mol), 75,4 g FGA (0,500 mol), 4,0 g natriumbisulfiet en 175 g water. Dit mengsel werd 5 minuten geroerd bij T = 10°C; de pH was 7,43.

Al roerende werd de pH op 9,0 gebracht met 25 behulp van 15,5 g geconcentreerde ammonia. Daarna werd de pH verlaagd van 9,0 naar 6,4 door dosering van 80,6 ml 6N H2S04 in 45 minuten. Vervolgens werd het mengsel vanuit de aanmaakreactor op t = 0 met behulp van 40 g water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

30 Op t = 0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. De temperatuur werd op T = 10°C gehouden. Gedurende 109 minuten werd 244 g (0,200 mol) 7-ACCA oplossing met constante snelheid gedoseerd. De oplossing was vers gemaakt door bij T = 3°C 48,1 g 7-ACCA (0,200 10 07302 ' - 17 - mol) te suspenderen in 183 g water en de pH te verhogen naar 8,2 met behulp van 13,2 gec. NH3, waarbij alle 7-ACCA oploste. Vanaf t = 0 werd de pH in de enzymreactor op 6,4 gehouden door middel van titratie met 6N H2S04. Op t = 350 5 minuten bevatte de enzymreactor: 350 mmol CC1 (conversie = 88%)

45 mmol 7-ACCA 80 mmol FGA 65 mmol FG

10

Op t = 400 minuten was de hoeveelheid Cefaclor maximaal en werd de pH verlaagd naar 5,0 door middel van toevoegen van 6N H2S04. De enzymreactor bevatte nu: 370 mmol CC1 (conversie = 92%)

15 25 mmol 7-ACCA

40 mmol FGA 85 mmol FG

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 3.

20

Vergelijkend Experiment B

Synthese van Ampicilline (geen 6-APA oververzadiging).

301,6 g FGA (2,00 mol) werd gesuspendeerd in 650 g water bij T = 5°C. Onder roeren werd in 1 uur 102,1 g 25 96% H2S04 (1,00 mol) toegedruppeld, waarbij de temperatuur d.m.v. koelen op T < 25°C werd gehouden.

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeef bodem met 175 μτα gaas, werd gevuld met 300 g netto-nat Assemblase™.

30 Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 131,6 g 6-APA (0,600 mol), 30,2 g FGA (0,200 mol) en 400 ml water (T = 10°C). Dit mengsel werd 15 minuten geroerd bij T = 10°C en vervolgens op t = 0 m.b.v. 100 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

10 0 73 0 2 - 18 -

Op t = O werd de roerder in de enzymreactor aangezet. Gedurende 283 minuten werd 423,7 g (0,800 mol) FGA.1/2H2S04 oplossing met constante snelheid toegevoegd, waarbij de temperatuur op 10°C werd gehouden. De pH was 5 ca. 6,3. Vanaf t = 328 minuten werd de pH op 6,3 gehouden d.m.v. titratie met 6N H2S04.

Op t = 540 minuten was de hoeveelheid Ampicilline maximaal en werd de pH verlaagd naar 5,6 d.m.v. toevoegen van 6N H2S04.

10 De enzymreactor bevatte nu: 575 mmol AMPI (=96% t.o.v. de ingezette hoeveelheid 6-APA)

15 mmol 6-APA 50 mmol FGA 15 365 mmol FG

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 4.

20 Voorbeeld III

Synthese van Ampicilline (6-APA oververzadiging).

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 /jm gaas, werd gevuld met 300 g netto-nat Assemblase™.

25 Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 600 ml water (T = 10°C), 143,3 g (0,950 mol) FGA en 22,6 g 96% H2S04. Na 10 minuten bij 10°C was de pH 7,2. Vervolgens werd er 131,6 g (0,600 mol) 6-APA toegevoegd en na 15 minuten roeren bij 10°C werd het mengsel op t = 0 met 30 behulp van 100 ml water (T = 10°C) in de enzymreactor overgebracht.

Op t = 0 was de temperatuur 10°C en de pH = 6,3. Gedurende de enzymreactie werd de pH op 6,3 gehouden door middel van titratie met 6N H2S04. Op t = 300 minuten was 1C 073 02 - 19 - de hoeveelheid AMPI maximaal en werd de pH verlaagd naar 5,6 door middel van toevoegen van 6N H2S04.

De enzymreactor bevatte nu: 575 mmol AMPI (= 96% t.o.v. de ingezette 5 hoeveelheid 6-APA)

15 mmol 6-APA 50 mmol FGA 315 mmol FG

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in 10 grafiek 5.

Vergelijkend experiment C

Synthese van Cephalexine (geen 7-ADCA oververzadiging).

Een enzymreactie (1,5 1, diameter 11 cm), 15 voorzien van een zeef bodem met 175 μπι gaas, werd gevuld met 75 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 668 ml water (T=4°C), 4,0 g natriumbisulfiet, 130,3 g 7-ADCA (0,600 mol) en 75,4 g FGA (0,500 mol). Er werd 7,8 g 20 geconcentreerde ammonia toegevoegd, waarna de suspensie 15 minuten werd geroerd bij T=4°C. De pH was 7,8.

Vervolgens werd de suspensie op t=0 m.b.v. 50 ml water (T=4°C) in de enzymreactor overgebracht.

Op t=0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. De 25 temperatuur werd steeds op T=4°C gehouden. Na circa 75 minuten was alle 7-ADCA opgelost; daarna was een, afgezien van vast Assemblase™, heldere oplossing aanwezig. Na 210 minuten was de pH gestegen tot 8,6.

De reactor bevatte nu: 30 393 mmol CEX (conversie = 66%; S/H =6,1) 200 mmol 7-ADCA 64 mmol FG 33 mmol FGA.

De S/H als functie van de conversie is weergegeven in 10 07302 - 20 - grafiek 6.

Voorbeeld IV

Synthese van Cephalexine (7-ADCA oververzadiging) 5 Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 μχα gaas, werd gevuld met 75 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 600 ml water (T=4°C), 4,0 g natriumbisulfiet, 130,3 g 7-ADCA 10 (0,600 mol) en 90,5 g FGA (0,600 mol). De suspensie werd 15 minuten geroerd bij T=4°C. De pH was 7,6.

Al roerende werd de pH op 8,6 gebracht m.b.v. 43,8 g geconcentreerde ammonia. Er werd 5 minuten geroerd bij T=4°C. Daarna werd 21,2 g geconcentreerd H2S04 15 toegevoegd. De heldere oplossing werd 15 minuten geroerd bij T=4°C. De pH was 7,4.

Vervolgens werd de suspensie op t=0 m.b.v. 50 ml water (T=4°C) in de enzymreactor overgebracht. Op t=0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. De temperatuur 20 werd steeds op T=4°C gehouden. Op t=90 minuten was de pH gestegen tot 8,05. Er werd 5,5 g geconcentreerd H2S04 toegevoegd, waardoor de pH daalde naar 7,75. Tijdens de gehele enzymreactie was een, afgezien van vast Assemblase™, heldere oplossing aanwezig.

25 Na 340 minuten was de pH gestegen tot 8,5.

De reactor bevatte nu: 445 mmol CEX (conversie = 74%; S/H = 7,2)

146 mmol 7-ADCA 62 mmol FG

30 80 mmol FGA.

De S/H als functie van de conversie is weergegeven in grafiek 6.

1007302 ' - 21 -

Voorbeeld V

Synthese van Cephalexine (7-ADCA oververzadiging)

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 /vm gaas, werd gevuld 5 met 75 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 500 ml water (T=4°C), 4,0 g natriumbisulfiet, 162,9 g 7-ADCA (0,750 mol) en 113,1 g FGA (0,750 mol). De suspensie werd 15 minuten geroerd bij T=4°C. De pH was 7,6.

10 Al roerende werd de pH op 8,7 gebracht m.b.v.

55,6 g geconcentreerde ammonia. Er werd 5 minuten geroerd bij T=4°C. Daarna werd 9,6 g geconcentreerd H2S04 toegevoegd. De heldere oplossing werd 15 minuten geroerd bij T=4°C.

15 De pH was 8,0.

Vervolgens werd de suspensie op t=0 m.b.v. 50 ml water (T=4°C) in de enzymreactor overgebracht. Op t=0 werd de roerder in de enzymreactor aangezet. De temperatuur werd steeds op T=4°C gehouden. Na 60 minuten was de pH 20 gestegen tot 8,3. De pH werd nu op 8,3 gehouden d.m.v. titratie met geconcentreerd H2S04.

Op t=300 minuten was getitreerd met in totaal 23,4 g geconcentreerd H2S04. De titratie werd nu gestopt; op t=450 minuten was de pH gestegen tot 8,7.

25 Tijdens de gehele enzymreactie was een, afgezien van vast Assemblase™, heldere oplossing aanwezig.

Op t=450 minuten bevatte de reactor: 545 mmol CEX (conversie = 73%; S/H = 8,5)

195 mmol 7-ADCA 30 64 mmol FG

129 mmol FGA

De S/H als functie van de conversie is weergegeven in grafiek 6.

10 07302 - 22 -

Vergelijkend experiment D

Synthese van Cefadroxil (geen 7-ADCA oververzadiging en geen FGHM oververzadiging).

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), 5 voorzien van een zeefbodem met 175 /m gaas, werd gevuld met 300 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 63,7 g 7-ADCA (0,293 mol), 107,1 g FGHM (0,590 mol), 4,0 g natriumbisulfiet en 440 g water. Dit mengsel werd 5 10 minuten geroerd bij T=10°C, terwijl de pH op 7,0 werd gehouden m.b.v. 7,5 g geconcentreerde ammonia.

Op t=0 werd de suspensie vanuit de aanmaakreactor m.b.v. 50 ml water (T=10°C) in de enzymreactor overgebracht. Op t=0 werd de roerder in de 15 enzymreactor aangezet. De temperatuur werd op T=10°C gehouden; de pH bleef constant op 7,0 (geen titratie).

Na 380 minuten bevatte de enzymreactor:

68 mmol Cefadroxil (conversie = 23%; S/H = 0,67) 222 mmol 7-ADCA 20 420 mmol FGHM

101 mmol FGH

De concentraties tijdens de reactie zijn weergegeven in grafiek 7.

25 Voorbeeld VI

Synthese van Cefadroxil (FGHM oververzadiging en 7-ADCA oververzadiging)

Een enzymreactor (1,5 1, diameter 11 cm), voorzien van een zeefbodem met 175 μτα gaas, werd gevuld 30 met 270 g netto-nat Assemblase™.

Een aanmaakreactor (1,2 1) werd gevuld met 97,7 g 7-ADCA (0,448 mol), 4,0 g natriumbisulfiet en 250 g water (T=10°C). De suspensie werd 5 minuten geroerd bij T=10°C. Daarna werd de pH op 8,1 gebracht m.b.v. 40,3 g 10073 02 - 23 - geconcentreerd NH3, waarbij een heldere oplossing ontstond (T=10°C).

Een tweede aanraaakreactor werd gevuld met 98,5 g FGHM (0,538 mol), 60 g water (T=10°C) en 105,1 g 6N H2S04 5 oplossing. Deze oplossing werd op T=10°C gebracht; pH = 2,3.

De 7-ADCA-oplossing uit de eerste aanmaakreactor werd m.b.v. 20 ml water (T=10°C) in de enzymreactor overgebracht. De roerder in de enzymreactor werd aangezet. 10 Vanaf t=0 werd de FGHM-oplossing uit de tweede aanmaakreactor met constante snelheid gedurende 120 minuten gedoseerd aan de enzymreactor. De temperatuur werd op T=10°C gehouden.

Na 30 minuten was de pH gedaald van 8,1 naar 15 6,8. Vervolgens werd de pH constant op 6,8 gehouden d.m.v.

titratie m.b.v. geconcentreerde ammonia.

Op t=120 minuten was er 8,3 g geconcentreerde ammonia toegevoegd. De titratie werd gestopt; de pH bleef 6,8.

Na 420 minuten bevatte de enzymreactor: 20 390 mmol Cefadroxil (conversie = 87%; S/H = 4,0)

50 mmol 7-ADCA 44 mmol FGHM 97 mmol FGH

De concentraties tijdens de reactie zijn weegegeven in 25 grafiek 8.

10 073 02 1

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een β-lactam antibioticum waarbij een β-lactamkern wordt 5 onderworpen aan een enzymatische acyleringsreactie met behulp van een acyleringsmiddel bij een molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern kleiner dan 2,5, met het kenmerk, dat gedurende ten minste een deel van de acyleringsreactie het 10 acyleringsmiddel en/of de β-lactamkern oververzadigd aanwezig is/zijn in het reactiemengsel.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het acyleringsmiddel en/of de β-lactamkern aan het begin van de acyleringsreactie oververzadigd in het 15 reactiemengsel aanwezig is/zijn.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij een geconcentreerde slurry of oplossing van de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel met een andere pH of een hogere temperatuur dan de pH of de 20 temperatuur waarbij de acyleringsreactie wordt uitgevoerd, wordt toegevoegd aan het reactiemengsel tijdens de acyleringsreactie.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, waarbij de β-lactamkern oververzadigd in het reactiemengsel 25 aanwezig is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij een mengsel waarin de β-lactamkern in oplossing aanwezig is wordt onderworpen aan een pH-verlaging of een pH-verhoging tot een pH tussen 4,5 en 9,0 is bereikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de pH- verlaging of pH-verhoging wordt uitgevoerd tot een pH tussen 5,5 en 8,5 is bereikt.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, waarbij het acyleringsmiddel oververzadigd in het reactiemengsel 10 07302 ' - 25 - aanwezig is.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij een mengsel waarin het acyleringsmiddel in oplossing aanwezig is, wordt onderworpen aan een pH-verhoging.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij een pH- verhoging tot een pH groter dan 5,5 wordt uitgevoerd.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij een pH-verhoging tot een pH hoger dan 6 wordt uitgevoerd.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 4-10, waarbij 10 een mengsel waarin de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel in oplossing aanwezig is/zijn, wordt onderworpen aan een temperatuurverlaging.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij een temperatuurverlaging tot een temperatuur lager dan 15 15°C wordt uitgevoerd.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarbij een temperatuurverlaging tot een temperatuur lager dan 10°C wordt uitgevoerd.

14. Werkwijze volgens een der conclusies 7-13, waarbij 20 als acyleringsmiddel de methylester van p- hydroxyfenylglycine wordt toegepast.

15. Werkwijze volgens een der conclusies 1-13, waarbij als acyleringsmiddel een amide wordt toegepast.

16. Werkwijze volgens een der conclusies 1-15, waarbij 25 als β-lactamkern 7-aminodesacetoxycefalosporaanzuur (7-ADCA), 7-amino-3-chloor-cef-3-em-4-carbonzuur (7-ACCA), 6-aminopenicillaanzuur (6-APA), 7-aminocefalosporaanzuur (7-ACA) of 7-amino-3-chloor-8-oxo-l-azabicyclo[4.2.0]oct-2-een-2-carbonzuur wordt 30 toegepast.

17. Werkwijze voor de bereiding van een β-lactam antibioticum zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden. j λ η ί c π o *·*; I v./ ··.' ) o -J i-