CN1282377A - 用于制备β－内酰胺抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备β－内酰胺抗生素的方法,其中通过酰化剂在酰化剂/β－内酰胺环的摩尔比小于2.5的条件下使β－内酰胺环进行酶促酰化反应,其间在酰化反应的至少部分时间里酰化剂和/或β－内酰胺环在反应混合物中是过饱和的。在该方法中,将例如β－内酰胺环和/或酰化剂的浓缩的浆液或溶液在酰化反应过程中加入到反应混合物中,其中的浆液或溶液具有与进行酰化反应时的pH不同的pH或具有比其温度更高的温度。在反应混合物中,β－内酰胺环和酰化剂都可以是过饱和的。

Description

用于制备β-内酰胺抗生素的方法
本发明涉及一种用于制备β-内酰胺抗生素的方法，其中通过酰化剂在酰化剂/β-内酰胺环的摩尔比小于2.5的条件下使β-内酰胺环进行酶促酰化反应。
例如在WO-A-96/23897中公开了类似的方法。
由于β-内酰胺环和/或β-内酰胺抗生素常常相当不稳定，因此在根据现有技术的酶促酰化反应中每单位所用β-内酰胺环和每单位所用酰化剂实现的β-内酰胺抗生素的产量一般是相当低的，同时由于反应物的溶解度通常很低，因此反应的时间是相当长的。而且，在所提到的酰化剂与β-内酰胺环之比相当低的情况下，每单位所用β-内酰胺环仅仅可以获得相当低产量的β-内酰胺抗生素。
本发明提供了一种方法，其中在酶促酰化反应中，在所用的酰化剂与β-内酰胺环的数量之比相当低的情况下实现了更短的反应时间并且在所用的每单位β-内酰胺环和/或每单位酰化剂下实现了更高产量的β-内酰胺抗生素。
根据本发明实现了这一目标，这是因为在酰化反应的至少部分时间里酰化剂和/或β-内酰胺环在反应混合物中是过饱和的。
本申请人已经发现在反应混合物中实现β-内酰胺环和/或酰化剂的高度过饱和是可能的，并且尤其令人吃惊的是可以使过饱和状态保持稳定达数小时。这就可以使β-内酰胺环和/或溶解的酰化剂的浓度剧烈地增加，从而反应可以更加迅速地进行，同时伴随着β-内酰胺抗生素和／或反应物更少的降解以及在每单位所用β-内酰胺环和/或每单位所用酰化剂下β-内酰胺抗生素更高的产量。这也导致了更高的生产能力。
此外，从文献(例如W0-A-92/01061)中已知在每单位β-内酰胺环下β-内酰胺抗生素的高产量可以通过在酰化剂和β-内酰胺环之间采用高的分子之比来获得。但是，在酰化剂和β-内酰胺环之间采用高的分子之比的缺点为由于酰化剂(以及可能的β-内酰胺抗生素)的水解，大量的酰化剂损失掉。结果，产生了低的合成/水解比(S/H)，其中该比值为合成产物(β-内酰胺抗生素)和水解产物之间的摩尔比。而且，已经发现生产β-内酰胺抗生素时常受相当大量水解的酰化剂的阻碍，该酰化剂的量是相对于存在于酶促酰化反应后得到的反应混合物中的β-内酰胺抗生素而言的，于是就会分离出更少量的β-内酰胺抗生素。
对本发明而言，在酰化反应中达到的每单位反应物(β-内酰胺环或酰化剂)的β-内酰胺抗生素的产量是指在每(摩尔)单位所用反应物下在酰化反应中形成的β-内酰胺抗生素的(摩尔)量。
对本发明而言，混合物中化合物的溶解度是指在混合物的所有其它组分存在下所述化合物的溶解浓度，该溶解度表示为毫摩尔/升或质量％。溶解度是通过在恒定的pH和温度下溶解化合物并且在混合物的所有组分都存在的情况下进行测量的。此后，由达到平衡时(饱和溶液)溶解的化合物的量可以计算出溶解度。
对本发明而言，当化合物在混合物中的溶解浓度大于溶解度时，该化合物在混合物中是过饱和的。过饱和因子是指两种前述溶解度之间的比值(过饱和的除以饱和的)。所达到的过饱和因子和维持过饱和状态期间的时间取决于许多因素，如化合物的性质和浓度、混合物中其它组分的性质和浓度、pH和温度。所得到的过饱和因子大部分取决于所含的化合物，并且优选大于2、更具体地大于5。
将溶解的β-内酰胺环的浓度表示为每千克液态反应混合物中溶解的β-内酰胺环的摩尔量；将溶解的和没有溶解的β-内酰胺环的总浓度表示为每千克总反应混合物中β-内酰胺环的摩尔量；除溶液以外，总的反应混合物还可以含有多种固体，例如β-内酰胺环、β-内酰胺抗生素、(水解的)酰化剂和固定化酶。类似的定义也适用于酰化剂和β-内酰胺抗生素。
其中的β-内酰胺环或酰化剂分别是过饱和的混合物例如可以通过pH的变化来得到。为此，如果需要的话，例如通过增加pH或降低pH或者分别降低pH来分别溶解以固体形式存在的β-内酰胺环或酰化剂，首先可以把浓缩的混合物制成浆液或溶液。优选的是将β-内酰胺环和/或酰化剂溶解到所得的混合物中。但是，对于部分的β-内酰胺环和/或酰化剂仍以固体的形式存在来说也是有可能的。随后，可以使该浆液或溶液经历pH的降低或pH的增加或者分别的pH的增加。通过这种方式，得到其中的β-内酰胺环或酰化剂是过饱和的浆液或溶液。
例如通过降低pH直至达到pH小于3、优选小于2、具体地小于1，或者通过增加pH到pH大于6、优选大于7、具体地大于8，可以溶解任何存在的固体β-内酰胺环。事实上，优选地选择β-内酰胺环仅仅刚好完全变成溶液的这样的最终pH，从而得到尽可能浓缩的溶液。事实上，浓缩的溶液通常具有β-内酰胺环的浓度至少为5％(重量)。最终的pH通常小于10并大于0。
随后，通过增加或降低pH到其值介于例如3.0和9.0之间、优选介于4.0和8.5之间、具体地介于4.5和8.0之间，可以从其pH可能已经降低或增加的或者可能还没有降低或增加的溶液中得到过饱和溶液。
例如通过降低pH直至达到pH值小于8.0、优选小于6.5、具体地小于5.0，可以溶解任何存在的固体酰化剂；优选地，选择酰化剂仅仅刚好被完全溶解这样的最终pH，从而得到尽可能浓缩的溶液。事实上，浓缩的溶液具有酰化剂的浓度至少为5％(重量)。最终的pH通常大于1。
通过增加pH到pH值大于例如4.5、优选大于5.5、具体地大于6.0，可以从其pH可能已经任选地降低的混合物中、优选从溶液中得到例如被酰化剂过饱和的混合物。
获得其中的β-内酰胺环和/或酰化剂是过饱和的混合物的另一种方式例如为降低温度，该步骤可以任选地在任何存在的固体β-内酰胺环和/或固体酰化剂首先至少有一部分已经通过升高温度或改变pH来溶解之后。
例如通过升高温度直到例如(实质上)所有的固体物质都呈溶液状，例如达到高于15℃的温度、优选高于20℃、具体地高于25℃，便可以实现溶解。随后，通过降低温度到低于20℃、优选低于15℃、具体地低于10℃，可以从所得的混合物中得到过饱和的浆液或溶液。
由于随后可以达到更高的过饱和因子，因此优选通过改变pH来制备过饱和混合物。事实上，在制备过饱和溶液的过程中，通常可以同时采用改变pH和降低温度。
在本发明方法的一个合适的实施方案中，首先制备出其中的β-内酰胺环和/或酰化剂是过饱和的混合物，随后例如通过加入(固定化)酶来启动酰化反应。在酰化反应的过程中反应物的浓度将会下降，从而到酰化反应结束时过饱和状态会不复存在。在另一个合适的实施方案中，酰化反应开始时使用β-内酰胺环和/或酰化剂的一部分，其中β-内酰胺环和/或酰化剂可能是过饱和的或者可能不是过饱和的，随后通过向反应混合物中加入(例如通过滴定)β-内酰胺环和/或酰化剂的浓缩的混合物来维持或产生过饱和状态，其中的β-内酰胺环和/或酰化剂具有与进行酰化反应时的pH不同的pH或者具有比其温度更高的温度。事实上，例如通过向酰化反应器中计量输入所述β-内酰胺环的浓缩溶液或浆液(具有高的pH或任选地具有低的pH)并且同时输入所述酰化剂的浓缩溶液或浆液(具有低的pH)，则在酰化反应过程中β-内酰胺环和酰化剂都可以以过饱和的状态存在。在该过程中，如果需要的话，例如通过滴定可以使pH在酰化反应的过程中保持恒定。
本发明的方法非常适用于制备头孢克洛。头孢克洛在高pH(＞6.5)下显示出稳定性差，同时在头孢克洛的降解仍相当低的那些pH值下(大约为6.0-6.5)相应的β-内酰胺环(7-氨基-3-氯-cef-3-em-4-羧酸；7-ACCA)的溶解度是很低的。结果，在相当高的pH和相当低的pH下头孢克洛的产量都是很低的，从而在技术上/商业上有吸引力的方法是不可能的。例如通过采用萘酚作配位剂，公认地可以提高在每单位所用7-ACCA和每单位所用酰化剂下头孢克洛的产量；但是，在抗生素的制备中使用这类有毒的辅助性物质是不利的，这是因为必须完全地除去它们，这就必须要有对工艺的经济性带来强烈的负面影响的额外的工艺步骤。令人吃惊的是已经发现本发明的方法可以达到特别高的饱和因子(＞10)，从而可以在相当低的pH下(6.0-6.5)进行酰化反应，与此同时β-内酰胺环的浓度仍是足够高的。因此，现在通过酶促酰化反应而不用辅助性物质来高产量地制备头孢克洛是可能的，从而可以实现技术上/商业上有吸引力的方法。
本发明方法的另一种应用在于例如通过在D-苯基甘氨酰胺(FGA)的协助下酰化6-氨基青霉烷酸(6-APA)来制备氨苄青霉素。由于6-APA和氨苄青霉素在高浓度和高pH下降解得相当迅速，因此在尽可能低的pH下尽可能快速地进行酰化反应是很重要的。例如通过增加6-APA和FGA的混合物的pH到pH值介于7.0和8.0之间、然后立即降低pH到pH值介于6.0和6.5之间、然后再立即启动酶促反应，已经发现在短时间内在每单位所用6-APA和每单位所用酰化剂下可能会实现氨苄青霉素的高产量，其间在溶液中仅仅非常短暂地存在着相当高浓度的6-APA并且在相当低的pH值下保持着氨苄青霉素的降解很低。同时，限制了FGA水解为D-苯基甘氨酸(FG)。
本发明的方法也可以有利地用于在D-苯基甘氨酰胺(FGA)的协助下通过酰化7-氨基去乙酸基头孢菌酸(7-ADCA)来酶促制备头孢氨苄的过程中。酰化反应通常是在相当高的pH值下(例如在7.5与8.5之间)进行的，并且(不需要的)FGA水解为D-苯基甘氨酸(FG)也参与了该酰化反应。通过采用本发明的方法，例如通过首先将FGA和7-ADCA的混合物的pH升高到例如pH值介于8.0和9.0之间、然后再酸化该混合物至pH介于6.5和8.5之间，可以加速该反应并且可以限制酰化剂的水解。
本发明方法的另一个例子为其应用于由6-APA和D-对-羟苯基甘氨酸甲酯(FGHM)酶促制备阿莫西林中以及由7-ADCA和FGHM制备头孢羟氨苄中。FGHM的溶解度是相当低的并且随着pH的增加溶解度下降，而6-APA和7-ADCA的溶解度也是相当低的并且随着pH的降低溶解度也下降。已经发现使例如6-APA或7-ADCA与FGHM的混合物的pH降低到其中的FGHM实质上完全溶解的pH值(例如pH值介于5和6之间)、接下来使pH增加到例如介于6和7.5之间，可以通过因子达到3-5而使FGHM过饱和。因此，可以在有点高的pH下在较高浓度的溶解的β-内酰胺环下进行酰化反应，同时酰化剂的浓度也是相当高的。
另一个实施方案为用碱来溶解7-ADCA到相当高的浓度、pH例如介于8和9之间，然后加入浓缩的FGHM的酸性溶液，在该过程中降低pH。在该实施方案中，可以同时实现7-ADCA和FGHM的过饱和。在已经加入所有的反应物后，可以开始酶促反应。在反应过程中加入(部分)浓缩的FGHM或7-ADCA的溶液(或浆液)也是可能的。
本发明方法的另一个例子为其应用于由四唑-1-乙酸和作为β-内酰胺环的7-氨基头孢菌酸(7-ACA)或7-氨基-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基-硫代甲基)-3-cef-em-4-羧酸(7-ACA-MMTD)来酶促制备头孢唑啉中。由于所述酰化剂不含α-氨基基团，因此可以进行所谓的受热力学控制的与酸之间的偶联反应。对这种受热力学控制的偶联反应来说，最佳的pH优选介于4.0和6.5之间．在该pH下，β-内酰胺环的溶解度是相当低的。看起来当反应混合物的pH值保持在介于4.0和6.5之间时(例如通过用酸滴定)，通过向酶促反应混合物中加入具有相当高pH(例如介于7.0和9.0之间)的β-内酰胺环的浓缩溶液，可以强烈地增加偶联反应中的转化。
本发明的方法可以适用于β-内酰胺抗生素的制备中，所述抗生素例如有头孢氨苄、氨苄青霉素、头孢克洛、阿莫西林、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢噻肟、头孢唑啉、cefprozil、loracarbef以及头孢来星。
原则上可以使用任何的β-内酰胺环，具体地讲为具有通式(1)的β-内酰胺环：其中R0表示氢或具有1-3个碳原子的烷氧基；Y表示CH2、氧、硫或硫的氧化形式；并且Z表示
Figure 9881228000092
其中R1例如表示氢、羟基、卤素、具有1-5个碳原子的烷氧基、具有1-5个碳原子的烷基、具有4-8个碳原子的环烷基、具有6-10个碳原子的芳基或杂芳基，其中所述基团可以或可以不被例如具有1-8个碳原子的烷基、芳基、羧基或烷氧基所取代；并且如果需要的话，所述的羧酸基团可以为酯基。
可以在本发明方法中采用的β-内酰胺环的合适的例子有青霉素的衍生物、例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)，和头孢菌酸(cephalosporicacid)的衍生物、例如在3-位上具有或没有取代基的7-氨基头孢菌酸，如7-氨基头孢菌酸(7-ACA)、7-氨基去乙酸基头孢菌酸(7-ADCA)、7-氨基-3-氯-cef-3-em-4-羧酸(7-ACCA)、7-氨基-3-(1-丙烯基)-cef-3-em-4-羧酸(7-PACA)、7-氨基-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基-硫代甲基)cef-3-em-4-羧酸(7-ACA-MMTD)和7-氨基-3-氯-8-氧代-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
在(酶促)酰化反应中，酰化剂例如可以为呈活化形式的苯基甘氨酸，优选(伯、仲或叔)酰胺或其盐或者低级烷基(1-4个碳原子)酯、例如甲酯；合适的苯基甘氨酸例如为取代的和未取代的苯基甘氨酸，具体地讲为苯基甘氨酸、对-羟苯基甘氨酸、二氢苯基甘氨酸。除了α-取代的以外，可以采用乙酸的衍生物以及对应的酰胺和酯，例如苯乙酸、苯氧乙酸、四唑-1-乙酸、扁桃酸或噻吩基乙酸。
原则上，任何适合在所述偶联反应中作为催化剂的酶都可以用作所述的酶。这样的酶包括总体上称作青霉素酰胺酶或青霉素酰基转移酶的酶。这样的酶例如在下列文献中进行了描述：J．G．Shewale等人《生物化学方法》1989年8月，第146-154页；J．G．Shewale等人《国际生物化学方法》1990年6月，第97-103页。合适的酶的例子是来自醋杆菌属(具体为巴氏醋杆菌)、气单胞菌属、产碱杆菌属(具体为粪产碱杆菌)、Aphanocladium、Bacillus sp．(具体为巨大芽孢杆菌)、头孢属、埃希氏菌属(具体为大肠杆菌)、黄杆菌属、镰孢属(具体为尖孢镰孢和茄病镰孢)、克吕沃尔氏菌属、枝动菌属、精朊杆菌属、变形菌属(具体为雷氏变形菌)、假单胞菌属以及黄单胞菌属(具体为柑橘黄单胞菌)的酶。
优选使用固定化酶，这是因为在这种情况下可以容易地分离和重复使用所述的酶。
在可以通过商业途径得到的固定化酶当中特别合适的酶例如为来自Boehringer Mannheim有限公司的大肠杆菌酶(该酶可以通过商业途径以名称EnzygelR来得到)，来自Recordati的固定化青霉素-G酰基转移酶以及来自Pharma Biotechnology Hannover的固定化青霉素-G酰基转移酶。此外，也可以采用呈结晶形式的酶(CLEC’sTM)。
进行酶促酰化反应的温度通常低于40℃、优选介于-5℃与35℃之间。进行酶促酰化反应的pH通常介于3.0和9.5之间、优选介于4.0和9.0之间。对受动力学控制的偶联反应而言，最佳pH是相当高的，例如介于4.5和9.0之间、优选介于5.5和8.5之间、具体地介于6.0和8.0之间。而受热力学控制的偶联反应的最佳pH通常较低，例如介于3.0和7.0之间、优选介于4.0和6.5之间。
当实质上已经达到最大的转化时，优选几乎完全终止该反应。用于终止反应的合适的实施方案是降低pH，优选将pH值降低到介于4.0和6.3之间、具体地降低到介于4.5和5.7之间。另一种合适的实施方案为在达到最大的转化时降低反应混合物的温度。结合这两个实施方案也是可能的。
一旦当达到最大的转化时已经终止了反应的话，那么反应混合物通常是以包括多种固体的悬浮液的形式存在的，例如有抗生素、D-苯基甘氨酸以及如果可能的话还有固定化酶。为了方法的经济性起见，优选回收固定化酶。例如通过在搅拌的同时在筛子上过滤反应混合物，可以适当地实现这一目标，其中应选择搅拌器的旋转方向以便在搅拌器的中央用泵向上抽吸悬浮液。随后，例如通过改变pH可以回收有价值的组分，如所述的抗生素和FG。
对本发明来说，pH的改变可以通过加入酸来产生。合适的酸例如有无机酸(具体为硫酸、盐酸或硝酸)和羧酸(例如醋酸、草酸和柠檬酸)。pH的增加例如可以通过加入碱来产生。合适的碱例如有无机碱(具体为氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠)和有机碱(例如三乙胺和FGA)。优选商业氢氧化铵。
在水中可以进行所提到的酶促酰化反应和测定、例如过饱和混合物的制备。如果需要的话，反应混合物也可以含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选其量少于30％(体积)。合适的有机溶剂的例子为具有1-7个碳原子的醇，例如一元醇、具体为甲醇或乙醇；二醇、具体为乙二醇；或三醇、具体为甘油。
酰化剂与β-内酰胺环的摩尔比小于2.5，该摩尔比即为加入的酰化剂的总量除以加入的β-内酰胺环的总量，其量是以摩尔数表示的。对所述的摩尔比来说，优选介于0.5和2.0之间、具体地介于0.7和1.8之间。
酶促酰化反应优选是以分批的方式进行的。如果需要的话，该反应也可以连续地进行。
通过下列实施例将进一步说明本发明，但是并未对本发明进行限制。缩写：7-ACCA：    7-氨基-3-氯-cef-3-em-4-羧酸7-ADCA：    7-氨基去乙酸基头孢菌酸6-APA：     6-氨基-青霉烷酸AMPI：      氨苄青霉素CCl：       头孢克洛CEX：       头孢氨苄FG：        D-苯基甘氨酸FGA：       D-苯基甘氨酰胺FGH：       D-对-羟苯基甘氨酸FGHM：      D-对-羟苯基甘氨酸甲酯
AssemblaseTM是来自如WO-A-97/04086所述的大肠杆菌ATCC 1105的固定化大肠杆菌青霉素酰基转移酶。如EP-A-222462所述，可以用明胶和脱乙酰壳多糖作胶凝剂并且用戊二醛作交联剂进行固定化。
大肠杆菌青霉素酰基转移酶的最大活性是通过加入到活化血细胞(globules)的酶的数量来测定的并且总计为3 ASU/克(干重)，其中1 ASU(阿莫西林合成单位)定义为每小时能够由6-APA和FGHM生产出1克阿莫西林三水合物(在20℃下；6.5％的6-APA和6.5％的FGHM)的酶的量。比较实施例1头孢克洛的合成(7-ACCA不是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重100克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有75.4克FGA(0.500摩尔)、4.0克亚硫酸氢钠、700克水、6.6克4N的硫酸和72.1克7-ACCA(0.300摩尔)。当t=10℃、pH为7.5下搅拌该混合物。随后，通过118毫升的水(T=10℃)将混合物转移到酶反应器中。
当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。保持温度为10℃。通过用4NH2SO4滴定保持pH为7.5。当t=48分钟时，该酶反应器含有大约：
215毫摩尔CCl(转化率=72％)
70毫摩尔7-ACCA
175毫摩尔FGA
95毫摩尔FG当t=81分钟时，酶反应器含有大约：
212毫摩尔CCl(转化率=71％)
61毫摩尔7-ACCA
83毫摩尔FGA
182毫摩尔FG此后，CCl的量下降。作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图1中显示出反应过程中溶液中FGA(FGAs)的浓度、总的FGA(FGAt)的浓度、溶液中7-ACCA(ACCAs)的浓度、总的7-ACCA(ACCAt)的浓度以及总的CCL(CCLt)的浓度，其中的浓度(C)是以毫摩尔/千克为单位的。
实施例Ⅰ头孢克洛的合成(7-ACCA是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重300克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有86.6克7-ACCA(0.360摩尔)、67.8克FGA(0.450摩尔)、4.0克亚硫酸氢钠和402克水。当t=10℃、pH为7.4下搅拌该混合物5分钟。
在搅拌的同时，通过加入16.8克浓的氢氧化铵将pH变为8.0。随后，通过在20分钟里计量加入73.8毫升4N的H2SO4，将pH从8.0降低到6.4。接下来，当t=0时，通过140毫升的水(T=10℃)将混合物从制备反应器转移到酶反应器中。
当t=0时当t=10℃下开启酶反应器中的搅拌器。通过用4N H2SO4滴定保持pH为6.4。在7个小时后，已经加入66.0毫升的酸。该酶反应器目前含有：
300毫摩尔CCl(转化率=83％)
55毫摩尔7-ACCA
100毫摩尔FGA
45毫摩尔FG作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图2中显示出反应过程中溶液中FGA(FGAs)的浓度、总的FGA(FGAt)的浓度、溶液中7-ACCA(ACCAs)的浓度、总的7-ACCA(ACCAt)的浓度以及总的CCL(CCLt)的浓度，其中的浓度(C)是以毫摩尔/千克为单位的。
实施例Ⅱ头孢克洛的合成(7-ACCA是过饱和的并且在酶促反应的过程中计量加入7-ACCA)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重150克的AssemblaseTM。
 制备反应器(1.2升)中装有48.1克7-ACCA(0.200摩尔)、75.4克FGA(0.500摩尔)、4.0克亚硫酸氢钠和175克水。当t=10℃、pH为7.43下搅拌该混合物5分钟。
在搅拌的同时，通过加入15.5克浓的氢氧化铵将pH变为9.0。随后，通过在45分钟里计量加入80.6毫升6N的H2SO4，将pH从9.0降低到6.4。接下来，当t=0时，通过40克水(T=10℃)将混合物从制备反应器转移到酶反应器中。
当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。保持温度当t=10℃。在109分钟的时间里以恒定的速率计量加入244克(0.200摩尔)的7-ACCA溶液。通过当t=3℃下将48.1克7-ACCA(0.200摩尔)悬浮在183克水中并且通过加入13.2的浓氨水使pH增加到8.2，已经新近地制备出上述溶液，其中在该步骤中所有的7-ACCA都溶解了。从t=0时开始，通过用6N H2SO4滴定来保持酶反应器中的pH为6.4。当t=350分钟时，该酶反应器含有：
350毫摩尔CCl(转化率=88％)
45毫摩尔7-ACCA
80毫摩尔FGA
65毫摩尔FG当t=400分钟时，头孢克洛的量达到最大值，并且通过加入6N H2SO4使pH降低到5.0。该酶反应器目前含有：
370毫摩尔CCl(转化率=92％)
25毫摩尔7-ACCA
40毫摩尔FGA
85毫摩尔FG作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图3中显示出反应过程中溶液中FGA(FGAs)的浓度、总的FGA(FGAt)的浓度、溶液中7-ACCA(ACCAs)的浓度、总的7-ACCA(ACCAt)的浓度以及总的CCL(CCLt)的浓度，其中的浓度(C)是以毫摩尔/千克为单位的。比较实验B氨苄青霉素的合成(6-APA不是过饱和的)
首先制备出FGA.1/2 H2SO4的溶液。当t=5℃下将301.6克FGA(2.00摩尔)悬浮在650克水中。通过冷却使温度保持当t＜25℃下，在搅拌的同时逐滴加入102.1克96％的H2SO4(1.00摩尔)。
接下来进行酶促缩合反应。在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重300克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有131.6克6-APA(0.600摩尔)、30.2克FGA(0.200摩尔)和400毫升水(T=10℃)。当t=10℃下搅拌该混合物15分钟，随后当t=0时通过100毫升的水(T=10℃)将其转移到酶反应器中。
当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。在283分钟的时间里将423.7克(0.800摩尔)的FGA.1/2H2SO4以恒定的速率加入所述溶液中，其间保持温度为10℃。pH为6.3。从t=328分钟开始，通过用6N H2SO4滴定来保持pH为6.3。
当t=540分钟时，氨苄青霉素的量为最大值并且通过加入6N H2SO4使pH降低到5.6。该酶反应器目前含有：
575毫摩尔AMPI(相对于所用6-APA的量转化率为96％)
15毫摩尔6-APA
50毫摩尔FGA
365毫摩尔FG作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图4中显示出反应过程中出现的溶液中FGA(FGAs)的浓度、总的FGA(FGAt)的浓度、溶液中6-APA(APAs)的浓度、总的6-APA(APAt)的浓度以及总的Ampi(Ampit)的浓度，其中的浓度(C)是以毫摩尔/千克为单位的。
实施例Ⅲ氨苄青霉素的合成(6-APA是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重300克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有550毫升水(T=10℃)、138.8克(0.920摩尔)FGA和131.6克(0.600摩尔)6-APA。在10℃下经过5分钟后，得到pH值为7.4的澄清溶液。随后，用96％的H2SO4(大约16克)使pH变为6.5，在10℃下搅拌5分钟后，当t=0时通过100毫升的水(T=10℃)将该溶液转移到酶反应器中。
当t=0时，温度为10℃、且pH=6.3。在酶反应过程中，通过用6NH2SO4滴定来保持pH为6.3。当t=300分钟时，AMPI的量为最大值并且通过加入6N H2SO4使pH降低到5.6。该酶反应器目前含有：
575毫摩尔AMPI(相对于所用6-APA的量转化率为96％)
15毫摩尔6-APA
40毫摩尔FGA
295毫摩尔FG作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图5中显示出反应过程中出现的溶液中FGA(FGAs)的浓度、总的FGA(FGAt)的浓度、溶液中6-APA(APAs)的浓度、总的6-APA(APAt)的浓度以及总的Ampi(Ampit)的浓度，其中的浓度(C)是以毫摩尔/千克为单位的。比较实施例C头孢氨苄的合成(7-ADCA不是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重75克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有668克水(T=4℃)、4.0克亚硫酸氢钠、130.3克7-ADCA(0.600摩尔)和75.4克FGA(0.500摩尔)。加入7.8克浓的氢氧化铵，随后在T=4℃下搅拌该悬浮液15分钟。pH为7.8。
随后当t=0时通过50毫升的水(T=4℃)，将悬浮液转移到酶反应器中。当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。自始至终保持温度为T=4℃。在大约75分钟后，所有的7-ADCA都已经溶解了；之后，除了固体AssemblaseTM之外，存在着澄清的溶液。在210分钟后，pH已经升高到8.6。该反应器目前含有：
393毫摩尔CEX(转化率=66％；S/H=6.1)
200毫摩尔7-ADCA
64毫摩尔FG
33毫摩尔FGA在图6中显示出作为转化率(以％为单位)的函数的S/H(以毫摩尔CEX/毫摩尔FG为单位)。
实施例Ⅳ头孢氨苄的合成(7-ADCA是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重75克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有600毫升水(T=4℃)、4.0克亚硫酸氢钠、130.3克7-ADCA(0.600摩尔)和90.5克FGA(0.600摩尔)。在T=4℃下搅拌该悬浮液15分钟。pH为7.6。
在搅拌下，采用43.8克浓的氢氧化铵使pH变为8.6。在T=4℃下进行搅拌5分钟。随后，加入21.2克浓硫酸。在T=4℃下搅拌澄清的溶液15分钟。pH为7.4。
随后当t=0时通过50毫升的水(T=4℃)，将悬浮液转移到酶反应器中。当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。自始至终保持温度为T=4℃。当t=90分钟时，pH已经升高到8.05。加入5.5克浓硫酸，这导致pH降低到7.75。在整个酶反应过程中，除了固体AssemblaseTM之外，存在着澄清的溶液。在340分钟后，pH已经升高到8.5。该反应器目前含有：
445毫摩尔CEX(转化率=74％；S/H=7.2)
146毫摩尔7-ADCA
62毫摩尔FG
80毫摩尔FGA在图6中显示出作为转化率(以％为单位)的函数的S/H(以毫摩尔CEX/毫摩尔FG为单位)。
实施例Ⅴ头孢氨苄的合成(7-ADCA是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重75克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有500毫升水(T=4℃)、4.0克亚硫酸氢钠、162.9克7-ADCA(0.750摩尔)和113.1克FGA(0.750摩尔)。在T=4℃下搅拌该悬浮液15分钟。pH为7.6。
在搅拌下，采用55.6克浓的氢氧化铵使pH变为8.7。在T=4℃下进行搅拌5分钟。随后，加入9.6克浓硫酸。在T=4℃下搅拌澄清的溶液15分钟。pH为8.0。
随后当t=0时通过50毫升的水(T=4℃)，将悬浮液转移到酶反应器中。当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。自始至终保持温度为T=4℃。在60分钟后，pH已经升高到8.3。现在通过用浓硫酸滴定来保持pH为8.3。当t=300分钟时，总共已经滴定了23.4克浓硫酸。在该时间点时终止滴定；当t=450分钟时，pH已经升高到8.7。
在整个酶反应过程中，除了固体AssemblaseTM之外，存在着澄清的溶液。当t=450分钟时，该反应器含有：
545毫摩尔CEX(转化率=73％；S/H=8.5)
195毫摩尔7-ADCA
64毫摩尔FG
129毫摩尔FGA在图6中显示出作为转化率(以％为单位)的函数的S/H(以毫摩尔CEX/毫摩尔FG为单位)。比较实验D头孢羟氨苄的合成(7-ADCA和FGHM都不是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重300克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有63.7ml 7-ADCA(0.293摩尔)、107.1克FGHM(0.590摩尔)、4.0克亚硫酸氢钠和440克水。在T=10℃下搅拌该混合物5分钟，其间通过加入7.5克浓的氢氧化铵来保持pH为7.0。
当t=0时通过50毫升的水(T=10℃)，将悬浮液从制备反应器转移到酶反应器中。当t=0时开启酶反应器中的搅拌器。使温度保持在T=10℃；pH在7.0处保持恒定(没有滴定)。在380分钟后，该酶反应器含有：
68毫摩尔头孢羟氨苄(转化率=23％；S/H=0．67)
222毫摩尔7-ADCA
420毫摩尔FGHM
101毫摩尔FGH在图6中显示出作为转化率(以％为单位)的函数的S/H(以毫摩尔CEX/毫摩尔FG为单位)。作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图7中显示出反应过程中出现的总的头孢羟氨苄(头孢羟氨苄t)的浓度、总的FGH(FGHt)的浓度、总的FGHM(FGHMt)的浓度、溶液中FGHM(FGHMs)的浓度、总的7-ADCA(7-ADCAt)的浓度以及溶液中7-ADCA(7-ADCAs)的浓度。
实施例Ⅵ头孢羟氨苄的合成(FGHM和7-ADCA都是过饱和的)
在底部装配有175μm筛眼筛子的酶反应器(1.5升，直径11厘米)中装有净重270克的AssemblaseTM。
制备反应器(1.2升)中装有97.7ml 7-ADCA(0.448摩尔)、4.0克亚硫酸氢钠和250克水(T=10℃)。在T=10℃下搅拌该悬浮液5分钟。随后通过加入40.3克的氨，使pH变为8.1，在该过程中逐渐形成澄清的溶液(T=10℃)。
第二制备反应器中装有98.5克FGHM(0.538摩尔)、60克水(T=10℃)以及105.1克6N的H2SO4溶液。使该溶液成为T=10℃；pH=2.3。
通过20毫升的水(T=10℃)，将来自第一制备反应器的7-ADCA溶液转移到酶反应器中。开启酶反应器中的搅拌器。从t=0时开始，在120分钟的时间里以恒定的速率将来自第二制备反应器的FGHM溶液计量送入所述的酶反应器中。使温度保持在T=10℃。
30分钟后，pH已经从8.1下降到6.8。接下来，通过用浓的氢氧化铵滴定，使pH维持在6.8。当t=120分钟时，已经加入了8.3克浓的氢氧化铵。终止滴定；pH继续为6.8。在420分钟后，该酶反应器含有：
390毫摩尔头孢羟氨苄(转化率=87％；S/H=4.0)
50毫摩尔7-ADCA
44毫摩尔FGHM
97毫摩尔FGH作为以分钟(分钟)为单位的时间(T)的函数，在图8中显示出反应过程中出现的总的头孢羟氨苄(头孢羟氨苄t)的浓度、总的FGH(FGHt)的浓度、总的FGHM(FGHMt)的浓度、溶液中FGHM(FGHMs)的浓度、总的7-ADCA(7-ADCAt)的浓度以及溶液中7-ADCA(7-ADCAs)的浓度。

Claims (16)

1．用于制备β-内酰胺抗生素的方法，其中通过酰化剂在酰化剂/β-内酰胺环的摩尔比小于2.5的条件下使β-内酰胺环进行酶促酰化反应，其特征在于在酰化反应的至少部分时间里所述酰化剂和/或p-内酰胺环在反应混合物中是过饱和的。
2．根据权利要求1的方法，其中在所述酰化反应开始时，所述酰化剂和/或所述β-内酰胺环在所述反应混合物中是过饱和的。
3．根据权利要求1或权利要求2的方法，其中将所述p-内酰胺环和/或所述酰化剂的浓缩的浆液或溶液在所述酰化反应过程中加入到所述反应混合物中，其中的浆液或溶液具有与进行所述酰化反应时的pH不同的pH或具有比进行所述反应时的温度更高的温度。
4．根据权利要求1-3之任一的方法，其中所述的β-内酰胺环在所述反应混合物中是过饱和的。
5．根据权利要求4的方法，其中使得在其中溶解了所述β-内酰胺环的混合物经历pH的降低或pH的增加直至达到pH介于3.0和9.0之间。
6．根据权利要求5的方法，其中实现所述pH的降低或pH的增加直至达到pH介于4.0和8.5之间。
7．根据权利要求1-6之任一的方法，其中所述酰化剂在所述反应混合物中是过饱和的。
8．根据权利要求7的方法，其中使得在其中溶解了所述酰化剂的混合物经历pH的增加。
9．根据权利要求8的方法，其中使所述pH增加到pH值大于5.5。
10．根据权利要求9的方法，其中使所述pH增加到pH值大于6。
11．根据权利要求4-10之任一的方法，其中使含有溶解的β-内酰胺环和/或酰化剂的混合物经历降温。
12．根据权利要求11的方法，其中将所述温度降低到低于15℃的温度。
13．根据权利要求12的方法，其中将所述温度降低到低于10℃的温度。
14．根据权利要求7-13之任一的方法，其中将对-羟苯基甘氨酸甲酯用作酰化剂。
15．根据权利要求1-13之任一的方法，其中将酰胺用作酰化剂。
16．根据权利要求1-15之任一的方法，其中将7-氨基去乙酸基头孢菌酸(7-ADCA)、7-氨基-3-氯-cef-3-em-4-羧酸(7-ACCA)、6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基头孢菌酸(7-ACA)，7-氨基-3-(1-丙烯基)-cef-3-em-4-羧酸(7-PACA)、7-氨基-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基-硫代甲基)-cef-3-em-4-羧酸(7-ACA-MMTD)或7-氨基-3-氯-8-氧代-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸用作β-内酰胺环。
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