CN1081929A

CN1081929A - 分离方法

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Publication number: CN1081929A
Application number: CN 93107082
Authority: CN
Inventors: S·G·卡斯加德; C·H·乌尔里克; K·克劳森; T·L·詹森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-05-14
Filing date: 1993-05-13
Publication date: 1994-02-16
Also published as: WO1993023164A1; BR9306349A; TW304886B; EP0640014A1; JPH07507959A; MX9302724A; SK134294A3; DK64192D0; AU4061393A

Abstract

本发明涉及一种在反应期间，或反应之后，从还含有至少一种其它固体成分的化学反应混合物中分离固体催化剂颗粒的方法。

Description

本发明涉及一种在反应期间或反应之后，从化学反应混合物中分离固体催化剂颗粒的方法，所述反应混合物中还包括至少一种其它固体成份。

从液体中分离沉淀物是一种公知方法，可以利用倾析、过滤或离心分离方式进行分离。但是，如果反应混合物中包括两种或两种以上的不同的固体成分，尚无一种将这些固体成分彼此分开的通用方法。过滤后再采用分拣颗粒的方式机械分离固体成分对多数应用过程来说是不可能办到的。有些情况下，可用像浮选法这样的机械分离方法分离固体成分。其它方法有物理化学法，如提取或分配法，这些方法利用了各成份在如水、酸的水溶液、碱的水溶液或有机溶剂中的溶解度之差。但使用这些方法的必要条件是应当找出使被分离成份处于稳定状态的那些分离条件。

在涉及到利用催化剂的工业方法中，催化剂价格常是涉及该方法整个经济效益的重要因素。所以，如果催化剂可以再利用而催化活性无明显丧失，将获益非浅。当催化剂在反应混合物中与另一种固体成分共存时，催化剂的分离和再利用将受到阻碍，上述另一种固体成分即可是反应期间形成的，如付产物或目的产物，也可存在于反应全过程中，如过量添加的固体原料。

在这类情况下，有时可采用提取其它固体的方法分离催化剂。提取可用能溶解这些固体但不溶催化剂的有机溶剂和/或用酸或碱。但包括酶在内的催化剂的活性对所谓的催化剂毒物的存在非常敏感。这些催化剂毒物如通过与催化剂紧密结合或将催化剂分解的方式发挥作用。强酸和强碱常对催化剂活性产生负作用，特别是暴露在高浓度酸或碱下的酶普遍受到无法恢复的损害。如果准备再循环使用酶而其活性无明显丧失的话，用酸和碱处理酶反应的反应混合物就受到某些限制。如果目的产物本身是不稳定化合物，对反应条件的其它限制当然由这些化合物的性质所决定。

现有技术对上述分离问题未提出令人满意的解决办法。

根据本发明，作为反应后溶解反应混合物中除固体催化剂外的其它固体成分，再过滤分离催化剂的另一种方法，通过反应即将结束时或以连续或非连续的方式，筛分或过滤反应混合物，可以几乎定量地分离催化剂。在该方案的一个特别优选的实施例中，使用的催化剂粒径范围明确，反应混合物的其它固体成分的粒径小于催化剂表观粒径范围的下限值。使反应混合物浆液通过一筛网或过滤器，以此留住催化剂颗粒，而令其余混合物通过，由此分离催化剂。该方法可间歇进行或连续进行。

所属领域技术人员都了解，影响待与催化剂分离的颗粒的大小和形状存在有几种可能性。当这些颗粒是晶体时（这是最常见的），在晶粒形成期间，进行剧烈搅拌比温和搅拌下形成的晶粒更小。其它影响晶体生长的参数有：溶剂或溶剂混合物的选择，温度、温度梯度，反应混合物的pH值。晶体在溶剂中的引晶和老化。影响晶体生长的这些参数对催化剂粒径没有或只有很小的影响，可认为反应期间催化剂粒径不变。工业生产过程常常是在明确规定的条件下进行，所以其产品也具有明确规定的性能，这些性能包括如晶体的粒径。在具体使用本发明方法的时候，有时候只要采用粒径范围适宜的催化剂，就不必要调节待与催化剂分离的那些成分的粒径。

如果在分离过程中，振动过滤板或筛网，或者搅动过滤板上的浆液，都有助于固体成分的分离。分出催化剂后，其余的反应混合物可在一能保留固体成分的过滤器上过滤。滤饼中和滤液中目的产物的相对含量取决于该产品在反应介质中的溶解度。可分别处理滤液和滤饼，某些成分也可以在该方法中与催化剂一起再循环。

本发明最宽的方面是关于从包括至少另外一种固体颗粒成分和一种液体的反应混合物中，分离固体催化剂颗粒的方法，该方法是，使一种固体颗粒成分的表面粒径在其它固体成分的表面粒径范围之外，由此而利用可保留较大颗粒成分但使其余混合物通过的设备过滤或离心分离反应混合物。

本发明首先优选的实施方案中，待与催化剂分离的固体成分的表观粒径小于催化剂表观粒径范围的下限值。

在本发明另一优选实施方案中，待分离的较大颗粒的表观直径与较小颗粒的表观直径之比至少为2。

在本发明再一优选实施方案中，催化剂的表观颗粒直径为25-10000μm，优选50-750μm，最优选50-300μm。

本发明另一实施方案中，固体催化剂是一种固定化酶。

本发明又一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化蛋白酶。

本发明再一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化金属蛋白酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化丝氨酸蛋白酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化嗜热菌蛋白酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化酰胺酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化酯酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化酰基转移酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种能够使青霉素G的6-氨基脱酰基的固定化酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种能够使氨必西林的6-氨基脱酰基的固定化酶。

本发明另一优选实施方案中，固定化酶是一种青霉素G酰基转化酶。

本发明另一优选实施方案中，固定化酶是一种氨必西林水解酶。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化全细胞制剂。

本发明另一优选实施方案中，固体催化剂是一种固定化细胞匀浆制剂。

本发明另一优选实施方案中，在一原料完全溶于反应混合物的方法中生成的固体产物，可在反应期间连续地与催化剂分离开，即，使从只留住催化剂的过滤器流出的滤液进入可留住合成的固体产物的过滤器，再将从后一过滤器流出的滤液循环回到催化剂中。

在另一优选的实施方案中，本发明是关于将一种固定化酶与其余的反应混合物分离的方法，所述的固定化酶用于催化β-内酰胺抗菌素核与对应于支链的该酸或该酸的衍生物的酰化反应。

本发明另一优选实施方案中，本发明是关于将一种固定化酶与其余的反应混合物分离的方法，所述的固定化酶用于催化6-氨基-青霉烷酸中6-氨基的酰化反应。

在另一优选实施方案中，本发明是关于将一种固定化酶与其余的反应混合物分离的方法的，所述固定化酶用于催化7-氨基-头孢烷酸中7-氨基基团的酰化反应。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化剂7-氨基-7-甲氧基头孢烷酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余的反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化7-氨基-3-甲氧基-3-头孢烯-4-羧酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余的反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化7-氨基-去乙酸基头孢烷酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余的反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化3-氯-7-氨基-3-头孢烯-4-羧酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化7-氨基-3-（1，2，3-三唑-4（5）-基硫甲基）-3-头孢烯-4-羧酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化7-氨基-3-[2-（5-甲基-1，3，4-噻重氮基）硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸中7-氨基的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与D-苯基甘氨酸酰化剂的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸衍生物的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸酰胺的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸甲酯的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸乙酯的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸丙酯的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-苯基甘氨酸异丙酯的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与D-4-羟苯基甘氨酸酰化剂的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-4-羟苯基甘氨酸衍生物的酰化反应的固定化酶与其余反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-4-羟苯基甘氨酸酰胺的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-4-羟苯基甘氨酸甲酯的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-4-羟苯基氨酸丙酯的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂D-4-羟苯基甘氨酸异丙酯的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂2-噻吩乙酸的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂2-噻吩乙酸衍生物的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂2-噻吩乙酸酰胺的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂2-噻吩乙酸甲酯的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂2-噻吩乙酸乙酯的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂3-噻吩丙二酸的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化β-内酰胺抗菌素核与酰化剂3-噻吩丙二酸衍生物的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化L-苯丙氨酸甲酯与L-天冬氨酸衍生物（其中氨基是受保护氨基）的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及一种用于催化D，L-苯丙氨酸甲酯与L-天冬氨酸衍生物（其中氨基是受保护氨基）的酰化反应的固定化酶与其它反应混合物分离的方法。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将一种用于催化水解氨基羧酸酰胺与酯生成相应游离酸或其盐的固定化酶与其它反应混合物分离的方法，其中水解反应条件要使生成的产物或部分产物从反应混合物中沉淀出来。

在另一实施方案中，本发明涉及将一种催化富马酸或其盐转化成苹果酸或其盐的反应的固定化酶与得到的固体产物进行分离的方法，其中转化反应条件要使生成的产物或部分产物从反应混合物中沉淀出来。

在从还含有至少一种其它固体颗粒成份的反应混合物中分离出一种多相催化剂，如一种固体颗粒的固定化酶时，特别适于采用本发明的分离方法。上述另一种固体颗粒成分可以是在该催化剂作用下合成出的产物，也可是未反应的原料，如过量加入的一种原料。本说明书中，除另有说明外，产物一词可指目的产物，也可指反应生成的付产物。

当反应开始时，催化剂是反应混合物中唯一的固体成分，而产物微溶于反应混合物的液体部分，这时使固体产物颗粒的表观粒径落在催化剂固体颗粒表观粒径范围之外，利用可留住较大颗粒成分而使其余反应混合物通过的过滤器或离心机过滤或离心分离反应混合物，可将催化剂与反应混合物分离。下文中，反应混合物的液体部分称作“反应液体”或只称作“液体”。反应液体包括使反应得以进行的溶剂（或混合溶剂）以及当原料或产物是固体或液体时，溶解的原料和产物部分。如果制备固体产物的方法中，原料完全溶解，产物颗粒小于催化剂颗粒，可以连续将催化剂与其余的反应混合物分离，即使从只保留催化剂颗粒的过滤器出来的滤液进入保留合成的固体产物的过滤器，再将从该过滤器流出的滤液循环回到催化剂处。这样可影响反应平衡向收率较高方向移动。

当一种或几种原料可微进行使反应溶于的溶剂中时，原料可以固体形式存在于反应混合物中，从而使反应液体被有关的成分饱和。如果反应产物可任意溶于反应液体，处理反应混合物期间，需利用本发明解决的问题是将催化剂与含固体，即未反应的原料的反应液体分离。如果产物也只能微溶于反应液体，将催化剂与其余反应混合物分离后，还须将产物与未反应的原料彼此分离。

颗粒如晶体的真实尺寸可用如带适宜刻度的显微镜测定。颗粒可有许多不同形状。因此，催化剂可是如针状、片状或立方体形状。本发明的重要特征不是颗粒的真实尺寸，而是称作表观直径的表观尺寸。本说明书用“表观尺寸”或“表观直径”反映颗粒在筛网上或过滤器中的行为。即颗粒的表观直径相当于实际上使颗粒刚能通过的洞或孔的直径。在本发明一优选实施方案中，催化剂的粒径减小到可进行分离的程度。这将有助于保证催化剂具有较高活性，并有助于排除扩散问题。

已知许多在催化剂作用下的方法都是很有特效的，且这些反应收率很高，特别在催化剂是一种酶的情况下，更是如此。本发明方法的一个优点是催化剂可以再用。由于将催化剂与其余反应混合物分离的条件相当温和，所以催化剂活性的损失常常很少。本发明方法特别适用于大量原料存在下进行的反应，原料用量之大使其在每单位体积反应混合物中一开始就有一部分是固体。这一事实说明本发明方法有助于达到较大生产能力。

根据本发明方法，所用固体催化剂可是粒状固定化酶制剂，且其密度可高于或低于反应液体。该制剂中，酶可以是被吸附的，被吸收的，以共价键结合的，被离子作用力夹持或结合的。固定化酶的制法已为所属领域所公知。现有技术亦提供了负载固定化催化剂如酶的颗粒的制法，以及根据粒径分布分离不同筛分的固体颗粒的方法。不同情况下所用的具体催化剂取决于所实施的方法。

本发明方法通常在水中进行。优选地，可加入有机溶剂，有机溶剂最好选自与水混溶的溶剂，如甲醇，乙醇，1-丙醇，2-丙醇，1-丁醇，1，4-丁二醇，丙酮，乙腈，N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜。

如前所述，在固体产物形成过程中，温度是影响颗粒大小的参数之一。这是由于晶体的生长速度依赖于温度，或者某些情况下，在不同温度下出现不同的晶体变种。反应液体的冰点是进行本发明方法的绝对的温度下限。如果所用的催化剂是一种固定化酶，则该绝对的温度上限取决于该所用的酶。

本发明作出重要改进的具体领域可例举出：1）半合成的青霉素和头孢菌素的制备，2）酰胺和酯的水解，3）肽的合成。

其制备过程可体现利用本发明方法的优点的β-内酰胺抗菌素（青霉素和头孢菌素）的实例有氨必西林，羟氨苄青霉素，羧噻吩青霉素，头孢氯，头孢三嗪，头孢哌罗，头孢氨苄，头孢羟氨苄，头孢甘酸，和头孢噻吩。

目前，工业上是采用化学方法制备半合成的β-内酰胺的。例如，制备青霉素是使6-APA（通常其羰基是被保护的）与一活化的支链衍生物反应，再水解脱掉保护基团。同样地，制备氨必西林时，可使6-APA（带一适宜的受保护羧酸基团）与D-苯基甘氨酰氯反应，再水解脱掉该羧酸基团的保护基。这些反应一般都包括成本较高的步骤，如采用0℃（有时甚至低于-25℃）的温度，甲硅烷基化试剂和有机溶剂如二氯甲烷，这些试剂和溶剂必须小心对待，因其对健康有害，对环境有害。

利用酶催法生产半合成的β-内酰胺核与D-苯基甘氨酸或D-4-羟苯基甘氨酸的衍生物（如较低级烷基酯）的酰化反应实现的。该法可从如DE2163792，AT243986，NL70-09138，DE2621618，EP339751中了解到。现有技术所介绍的方法都是在D-苯基甘氨酸衍生物浓率低于300mM，β-内酰胺核浓度低于25mM，条件下进行的。

上述原料浓度相当低是这些酶催法生产半合成的β-内酰胺抗菌素的公知方法（没有一种方法已达工业规模）的潜在缺点，因其使生成的β-内酰胺抗菌素较难分离，因而成本较高。此外，报导的收率较低，一般低于85%，这就需要循环使用未反应的β-内酰胺核，由此导致更高的且更贵的单元操作。

在酶催法合成半合成的β-内酰胺抗菌素的方法中，提高原料浓度时遇到的问题之一是，某些原料及反应中生成的产物的溶解度相当小。为了使该方法在更经济的条件下运行，必须在反应开始时加入很多原料，以致于这些原料不能完全溶于反应液体。同样地，生成的产物以固体形式析出，因为单位体积生成的产物量很大，所以也不能完成溶于反应液体。这样就需要先从含固体产物和/或未反应原料的反应混合物中，先分离出催化剂，再进一步处理其余的反应混合物，因为这种处理可能包括在损害酶活性的条件下处理，如在较低pH值（如pH为0.5-2.0）下溶解产物和未反应的原料。

用于在β-内酰胺抗生素核中引入侧链，即用于在青霉素的6-氨基上或头孢菌素的7-氨基上引入酰基的酰化剂可以是相应的酸或其衍生物，如低级烷基（甲基、乙基、丙基或异丙基）酯或其伯、仲或叔酰胺。优选甲酯、乙酯和酰胺。可使用游离形式或盐如盐酸盐或硫酸盐形式的衍生物。

使用的酶可是催化所述反应的任何酶。这些酶通常称作青霉素酰胺酶，青霉素酰基转移酶，或氨必西林水解酶。已知具有这种活性的一些微生物酶可衍生例如醋酸杆菌属，黄（单胞）杆菌属（Xanthomonas），支动杆菌属，精蛋白杆菌属，气单胞菌属（DE专利申请号2163792），假单胞菌属（AT专利号243986），黄杆菌属（Flavobaterium）（NL专利申请号70-09138），Aphanocladium，头孢菌属（DE申请号2621618），Pasteu-rianus醋酸杆菌（DE专利申请号2163792A），turbidans醋酸杆菌，（Takahashi等人，Biochem.J.137（1974），497-503），黑色极毛杆菌（Kir & Byun，Biochem.Biophys.Acta，1040（1990），12-18），citrii黄（单胞）杆菌（EP-A-339751），cit-rophila克鲁菌（Okachi等人，Agr.Biol.Chem.，37（1973），2797-2804），埃希杆菌属大肠杆菌（DE专利申请号2930794）和巨大芽孢杆菌（Chiang&Bennett，J.Bacteriol.，93（1967），302）。

与其余反应混合物分离之后，优选地经过洗涤之后，催化剂可以再使用。可将产物和任选的未反应原料分离后，分别处理或各自再循环使用。

可有效地利用本发明方法制备的肽的实例是N-苄氧基羰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯，下面称作ZAPM。ZAPM是制备甜味剂天冬氨酰苄并氨酸甲酯的关键性中间产物。制备天冬氨酰苯并氨酸甲酯（L-α-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯）时，关键步骤之一是通过酶催化，使天冬氨酸衍生物与盐酸苯丙氨酸甲酯偶联（例如，N-苄氧基羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯氢氯化物偶联生成ZAPM。ZAPM与L-苯丙氨酸甲酯（或D-苯丙氨酸甲酯（如果有的话））形成溶解度很小的另一种化合物。所以合成期间形成常常物。由此使反应平衡向缩合方向移动。

根据现有技术，在缩合步骤中可用一种半精制的可溶性酶制剂（如嗜热菌蛋白酶）作催化剂。为了将酶与反应产物分离，加入有机溶剂，（如丙酮），使反应产物溶解而酶析出沉淀，从而过滤分离出酶。但在该过程中，丧失了从14%直到至少60%的酶的催化活性（Nonaka等，US4212945，Meijer等，“Biocatalysts in Organic Syntheses”（Eds：Tramper，van der Plas and Linko），pp.135-156（1985））。大部分活性的丧失出现在酶的沉淀和分离过程中。

在上述制备ZAPM的方法中，用本发明方法及固定化嗜热菌蛋白酶制剂，简化了分离步骤，将分离过程中酶活性的丧失减少至约1%。

下面通过实例进一步具体说明本发明，但这些实施不应解释成是对保护范围的限制。说明书、实例及权利要求书公开的特征分别地，或任意组合在一起，对实现本发明的各种变换形式都是很重要的。

实例1

制备特别适用于合成β-内酰胺的催化剂

使来源于埃希菌属大肠杆菌的固定化青霉素G酰基转移酶（250g，Euperhit^R-PcA，购自Rhm Pharma）先在300μm筛网，然后在180μm筛网上用水冲洗筛分。将留在180μm上面的材料用作下面例2-5中的酶催化剂。采用Balasingham等人在Biochem.Biophys.Acta，276（1972）250-256所述4-二甲氨苯甲醛法分析表明，催化剂活性为每克湿催化剂115青霉素G酰基转移酶单位（u）。

实例2

酶催法合成氨必西林

使D-苯甘氨酸甲酯（下面称作D-PGM）和6-氨基青霉烷酸（下面称作6-APA）悬浮在50mM的pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液中，D-PGM和6-APA的最后浓度分别是450mM和100mM。将悬浮液升温至35℃，加入10.0g湿的固定化酶（例1制备的），总体积为100ml。反应在35℃，充分搅动下进行，用2MH₂SO₄滴定调节pH，使其保持在6.0。

约0.5hr.后，开始从反应混合物中析出D-苯基甘氨酸（下面称作D-PG）沉淀，约3hr.后，氨必西林达到77mM的最高浓度，相当于6-APA转化率为85%。此时，将反应器物料转移到过滤器单元，该过滤器底部有一100μm孔径的筛网，紧靠筛网上面是一旋转式螺旋浆。固定化酶留在筛网上面，其余浆液通过筛网。滤液中的沉淀物是含有一定氨必西林的D-苯基甘氨酸晶体，液体中特别含有溶解的产物和未反应的原料。生成的氨必西林晶体的粒径小于50μm。滤液（即包括晶体和反应液体的浆液）经过离心分离，用干净的离心液洗掉留在催化剂上的晶体。通过调节来自分离单元的滤液流速和进入分离单元的干净的上清液的流速，可在整个分离期间，使催化剂一直保留在悬浮液中。在催化剂馏份中看不到晶体之后，将罐器完全排空，只留下筛网上的催化剂。

分离后，合成中形成的97%的氨必西林和95%D-PG留在滤液中。氨必西林分离后用已知方法进一步提纯。

用50mM磷酸盐缓冲液（pH6.0）冲洗留在分离单元的催化剂，按上述例1提到的方法分析其活性，如表1所示，合成后催化剂活性无明显损失，所以仍适于再使用。

表1

催化剂用量(g) 活性u/g

使用前 10.00 115.0

使用1次后 9.85 114.5

用HPLC分析反应成份

柱子：RP LC-18，（250×4.6mm;5μm）

洗脱液A：25mM磷酸盐缓冲剂，pH6.5

洗脱液B：乙腈

采用据表2的洗脱液A和B的混合液进行洗脱。

表2

时间min. A%

0→10 99→80

10→20 80

20→21 80→99

21→35 99

流速：1ml/min.

215nm处uv检测

保留时间（min）：D-PG：4.1，6-APA：8.1，氨必西林：13.9，D-PGM：18。

实例3

酶催法合成头孢氨苄

使D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐（1.6526g）和7-氨基去乙酸基头孢烷酸（7-ADCA）（0.4278g）溶在50mM磷酸盐缓冲液（pH：6.5）中，恒温至35℃。加入例1的酶催化剂（2g），用缓冲剂调节反应混合物体积至20ml。反应在充分混合、保持pH值和温度恒定条件下进行。

加入酶催化剂约45min.后，析出沉淀，再过20min后，停止搅动，将反应器内物料转移至例2所述过滤单元，从生成的沉淀和反应液体中分离出催化剂。从特别含头孢氨苄，D-苯基甘氨酸，D-苯基甘氨酸甲酯和7-氨基去乙酸基头孢烷酸的沉淀物和反应液体中分离出头孢氨苄，用已知方法提纯。

分离后，催化剂保留了99%以上的催化活性，故适于再用。催化剂再用前，可进行冲洗。

在与例2所述相同条件下，用HPLC分析反应成份。7-AD-CA和头孢氨苄的保留时间分别是6.3min和13.4min。

实例4

酶催法合成羟氨苄青霉素

在50mM磷酸盐缓冲溶液（pH6.5）中配制D-4-羟苯基甘氨酸酰胺（44.94g，下面称作HPGA）与6-APA（14.30g）的浆液，并在反应容器内恒温至25℃，将容器底部有一100μm孔径的筛网，该筛网紧上方有一旋转螺旋浆。加入40g催化剂（例1制备的）（最后体积：400ml）开始反应，反应中用2MH₂SO₄滴定保持pH恒定。网下面的体积小于15ml，借助泵，滤液（含有反应液体和原料与产物晶体）在整个过程中连续返回到反应器顶部。

10hr.后，羟氨苄青霉素浓度达到最大值，相当于85%转化率。反应混合物特别含有羟氨苄青霉素，D-4-羟苯基甘氨酸（下面称作HPG）和未反应的HPGA的晶体。滤液停止循环回到反应器，进行离心分离。如前2实例所述，用干净上清液冲洗掉催化剂上最后的晶体。

从滤液中回收到95%的羟氨苄青霉素和98%的HPG。用现有技术的公知方法进一步提纯羟氨苄青霉素。

催化剂因保留了99%的催化活性，因而适于再用。

用例2所述同样HPLC（系统分析，只是用于95%的25mM磷酸盐缓冲液（pH6.0）中的5%乙腈isocratic洗脱（1ml/min）化合物。这些条件使目的化合物具有下列保留时间（min）：D-4-羟苯基甘氨酸：2.5，D-HPGA：3.3，6-APA：6.0，羟氨苄青霉素：15.0。

实例5

酶催法水解D-4-羟苯基甘氨酸酰胺（HPGA）

将HPGA（8.35g）与水的混合物调pH为6.0，加入湿催化剂（2.25g），据例1），将总体积调到100ml。在35℃下，用2M硫酸滴定保持pH恒定及充分搅动的条件下，进行水解反应。

3hr.后，HPGA充分水解成游离酸，HPG。由于催化剂和部分沉淀的HPG物料的缘故，反应混合物看上去是一种浆料。

按例2所述，将反应器内物料转移至分离单元，将催化剂与反应混合物分离。分出的滤液包括沉淀的HPG和特别含有盐类及溶解的HPG的上清液。滤液中有生成的总共96%的HPG。用已知方法进一步提纯HPG。

反应器内催化剂用50mM磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）冲洗后，因催化活性无明显损失而可再用（合成及后续分离中，失去不到1%的总活性）。

用例4所述HPLC法调控反应。

实例6

制备嗜热菌蛋白酶催化剂

用嗜热菌蛋白酶（8g，8P-1512）溶于25mM磷酸盐缓冲液（pH：7），使达到约每毫升50mg蛋白质和每毫升约3750u（参见下文）。收获由埃希杆菌属大肠杆菌发酵（如.A.Getauer等，Bioprocess Engineering 2（1987）55-58）而得到的细胞（约40g干物质）并加热到100℃10分钟，以钝化细胞内多数酶活性。将嗜热菌蛋白酶加到固定化的细胞上，如Wumpelmann，M.等人的US4892825（Novo Industri A/S）所述。将负载固定化细胞的材料挤出成形，干燥至约10%水含量。制成的颗粒经过磨碎过筛，用75-150μm粒径的筛分物作为催化剂，用于合成N-苄氧基羰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯。催化剂活性约3000u/g。用酪蛋白消化法测定该活性（在pH7.5，及35℃条件下，1单位（u）水解酪蛋白产生的颜色相当于每分钟1.0μmol的酪氨酸（颜色由Folin-Ciocalteu试剂测定）。

-合成N-苄氧基羰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯

使N-苄氧基羰基-L-天冬氨酸（0.1mol）和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐（0.25mol）溶于水并调pH至6.5，使最后体积为350ml。溶液恒温至40℃，加入上述制备的催化剂（15g）。催化剂使用前先在水中溶胀，使粒径增加到约150-400μm。在40℃下，保持pH恒定在6.5及充分的低剪切搅动，进行反应。缩合产物N-苄氧基羰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯（ZAPM）与未反应的L-苯丙氨酸甲酯生成一种加成化合物，该化合物在水中溶解度很小。因此，随该加成化合物逐渐形成，产物几乎是定量地析出沉淀。20hr.后，使反应混合物冷却至约5℃，移入例2所述分离单元。催化剂与产物和反应液体分离，如例2所述。分离后，反应器内催化剂保留了高于99%的总催化活性，故可再用。ZAPM可用公知的方法进一步加工成天冬氨酰苯丙氨酸甲酯（脱掉天冬氨酸部分的N-保护基团，结晶等）。用HPLC法（Oyama等，J.C.S.PerkinⅡ，（1981）356，）跟踪ZAPM的生成过程。

实例7

在2-萘酚存在下，利用可再循环的固定化酶进行酶催法合成头孢氨苄

据Geblauer，A.等，Bioprocess Engineering2（1987）55-58，使具有有青霉素G酰基转移酶活性的埃希杆菌属大肠杆菌发酵。按Wumpelmann，M.等的US4，892，825（Novo IndustriA/S）进行固定化。含固定化酶的物质挤出成形并干燥至残留水含量约10%（W/W）。干燥的材料磨碎后，用适宜的筛网从磨碎产品中筛出粒径分布100-200μm的筛分物。该筛分物中酶活性约为200青霉素G酰基转移酶单位/g。在水中溶胀后，粒径分布约200-500μm。

加入约4M氢氧化铵，将D-PGA.1/2H₂SO₄（74.7g，0.375mol），7-ADCA（21.4g，0.10mol），和2-萘酚（10.8g，0.075mol，粒径＜100μm）在约300ml水中的混合物（浆液）的pH值调到6.7。加水到400ml后，加入上述制备的固定化的埃希杆菌大肠杆菌青霉素G酰基转移酶（干基50g悬浮在水中，总量100ml），混合物在25℃下搅动。

3hr.后，反应混合物倒入100μm孔筛网，该筛网留住载酶颗粒，同时使其余仍是浆液的反应混合物通过。使通过该筛网的浆液在能留住固体材料的烧结玻璃过滤器上过滤，并用一部分母液冲洗留在100μm筛网上的酶颗粒，以除掉酶颗粒上附着的含合成产物的细小浆料。洗涤液同样通过该烧结玻璃过滤器。用乙酸丁酯（200ml）洗涤收集在玻璃过滤器上的产物，再将该产物悬浮在水（150ml）与乙酸丁酯（150ml）的混合液中。加入3M硫酸将水相pH调到1.5，并继续搅动10min。将水相与乙酸丁酯相分离后，再用乙酸丁酯洗涤（2×20ml）。利用蒸发将水相体积减至75ml，加2-丙醇（75ml）并加4M氢氧化铵调pH至4.7。得到的浆液冷至5℃15min，在烧结玻璃过滤器上收集固体物质，并用水/2-丙醇（1∶1，25ml）洗涤。30℃下真空炉内干燥12hr.后，得到33.6g（理论产率的92.4%）头孢氨苄一水合物的白色粉末（HPLC分析纯度：99.9%）。

使用后，用水冲洗（3×100ml）留在100μm筛网上的酶颗粒，排干水，最后干燥到水含量约10%。重量约50g，酶活性约200青霉素G酰基转移酶单位/g，表明活性实际上无损失。因此，固定化酶适用于如上述方法中再循环利用。

Claims

1、从含有其它固体颗粒成份和液体的反应混合物中分离固体颗粒催化剂的方法，其特征在于使固体颗粒成份之一的表观粒径在其它固体成分的表观粒径范围之外，然后过滤或离心分离该反应混合物，分离使用的设备可留住较大颗粒的成分，而让其余混合物通过。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于，待与催化剂分离的固体成分的表观粒径小于催化剂表观粒径的下限值。

3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于较大颗粒的表观直径与较小颗粒的表观直径之比至少为2。

4、根据权利要求2或3的方法，其特征在于催化剂的表观颗粒直径范围为25-10000μm，优选50-750μm，更优选50-300μm。

5、根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于固体催化剂是一种固定化酶。

6、根据权利要求5的方法，其特征在于固定化酶是蛋白酶，金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，酰胺酶，酯酶或酰基转移酶。

7、根据权利要求5的方法，其特征在于固定化酶能够使青霉素G的6-氨基或氨必西林的6-氨基脱酰基。

8、根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于固体催化剂是一种固定化全细胞或全细胞匀浆制剂。

9、根据权利要求2-8中任一项的方法，其特征在于在原料完全溶于反应混合物的方法中，通过使只能留住催化剂的过滤器流出的滤液进入可留住合成的固体产物的过滤器，再将从中流出的滤液返回到催化剂中，从而使生成的固体产物可在反应期间与催化剂连续分离。

10、根据前述任一权利要求的方法，该方法用于分离固定化酶与其余反应混合物的方法，当开始处理反应混合物时，该反应混合物中含有除催化剂以外的固体物料，所述固定化酶用于催化6-氨基青霉烷酸，7-氨基头孢烷酸，7-氨基-7-甲氧基子孢烷酸，7-氨基-3-甲氧基-3-头孢烯-4-羧酸，7-氨基去乙酸头孢烷酸，3-氯-7-氨基-3-头孢烯-4-羧酸，7-氨基-3-（1，2，3-三唑-4（5）-基硫甲基）-3-头孢烯-4-羧酸或7-氨基-3-[2-（5-甲基-1，3，4-噻重氮基）硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸与D-苯基甘氨酸，D-4-羧苯基甘氨酸，2-噻吩乙酸或3-噻吩乙酸，或者，D-苯基甘氨酸，D-4-羟苯基甘氨酸，2-噻吩乙酸、3-噻吩乙酸的酰胺、甲酸、乙酸、丙酸或异丙酯之间的酰化反应。

11、根据权利要求1-6和8-9中任一项的方法，该方法用于分离固定化酶与在使生成的产物或部分产物从反应混合物中析出沉淀的反应条件下生成的固体酰化反应产物，所述固定化酶用于催化L-苯丙氨酸甲酯或D，L-苯丙氨酸甲酯与N-保护的L-天冬氨酸的酰化反应。

12、根据权利要求1-9中任一项的方法，该方法用于分离固定化酶与在使生成的产物或部分产物从反应混合物中析出沉淀的反应条件下生成的固体产物，所述固定化酶用于催化氨基羧酸的酰胺或酯水解生成相应的游离酸或其盐的反应。

13、根据权利要求1-6和8-9中任一项的方法，该方法用于分离固定化酶与在使生成的产物或部分产物从反应混合物中析出沉淀的反应条件下生成的固体产物，所述固定化酶用于催化富马酸或其盐转化成苹果酸或其盐的反应。