JPH07507959A - 分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分離方法 技術分野 本発明は、反応中または反応後のどちらかで、少なくとも１種の他の固体成分を 更に含んでなる化学反応混合物から粒状固体触媒を分離する方法に関する。

発明の背景 液体からの沈殿物の分離は、周知のプロセスであり、このプロセスはデカンテー ション、濾過または遠心分離によって行なうことができる。しかし、反応混合物 が２種またはそれ以上の固体成分を含有する場合、固体成分をお互いから分離す る普遍的な方法は存在しない。濾過に引き続いた粒子の選別による固体成分の機 械的分離は、最も実際的な目的に対してはまったく不可能である。幾つかの場合 において固体成分は、浮選に似た機械的プロセスによりお互いから分離され得る 。他の方法は抽出または分離に似た物理化学的方法であり、この方法は例えば水 中、水性酸中、水性塩基中または有機溶剤中で成分の溶解性の差異を利用する。

これらの方法の適用可能性の必要条件は、分離されるべき成分が安定である条件 を見出し得ることである。

触媒の使用を含む工業的プロセスにおいて、触媒の価格はプロセスの全般的経済 性において極めて重要な因子である。従って、もしも触媒が触媒活性を著るしく 損うことなく再使用できる場合には、それは大きな重要性のある一つの利点であ る。触媒が、例えば副生物または量的生成物の如く反応中に生成されるか、また は全プロセス中に存在する別の固体成分、例えば過剰に添加される固体出発物質 と共に、反応混合物に存在する場合、触媒の単離および再使用か防げられる。

そのような場合において、触媒は時として有機溶剤を用いおよび／または触媒を 除いた（１又は複数の）固体を溶解するであろう酸または塩基を用い、抽出によ って単離できる。しかし、酵素を含めて触媒の活性は、いわゆる触媒毒の存在に 対して非常に鋭敏である。

触媒毒は、例えば触媒に極めて強く結合させることにより、またはそれを分解さ せることにより、それらの活性を表わす。従って、強酸および強塩基は、触媒活 性に不利な作用をしばしば有しそして特に酵素は、酸または塩基の高濃度に暴露 すると不可逆の損傷を一般に受ける。

酵素が、著るしい活性損失なしで再循環されるべき場合に、このことは酵素反応 からの反応混合物のワークアップ（ｗｏｒｋ　ｕｐ）において酸および塩基の使 用に幾つかの制限を課す。ワークアップ条件に関する他の制限は、勿論それ自身 不安定な化合物かもしれない所望生成物の性質によって課され得る。

従来技術は、先に概説した分離問題に対し満足できる解決を示していない。

発明の要約 固体触媒を除いて反応後反応混合物の（ｌまたは複数の）固体成分を溶解し次い で触媒を濾過により分離する代わりに、本発明によれば、反応が完結せしめられ たと考えるか、または所望により連続過程において、反応混合物を篩別するかま たは濾過することにより触媒はほぼ定量的に分離できる。この態様の特に好まし い態様において、十分に規制された粒径範囲の触媒粒子が用いられそして反応混 合物の他の（ｌまたは複数の）固体成分は、触媒の見掛は粒径範囲の下限よりも より小さい粒径を有する。次いで触媒の分離を、反応混合物を構成するスラリー を、触媒粒子を保持しそして混合物の残余を通過せしめるであろうふるいまたは フィルターを通すことによって行う。このことは、回分式または連続式のいずれ かで行うことができる。

当業者は了知しているであろうように、触媒から分離されるべき粒子の大きさと 形状に影響する幾つかの可能性が存在する。従って、粒子が粒子である（このこ とは最もしばしばその事例であろう）場合、それらの形成中反応混合物を激しく 撹拌すると、適度な撹拌よりもより小さな触媒をもたらしがちである。結晶の成 長に影響する他の因子は次の通りである：溶剤または溶剤混合物の選択、温度、 温度勾配、反応混合物のｐＨ値、溶剤中での触媒のシード添加および老化である 。結晶の成長に影響を与える因子は、反応中一定なものとして見なすことができ る触媒の粒径に全く影響を与えないか、または極めて小さな影響だけを有する。

工業的プロセスは、通常十分に規制された条件下で行なわれそして従って、例え ば触媒の粒径を含む十分に規制された特性を有する生成物を生産する。従って、 本発明に係る方法の実際的使用において、幾つかの場合において以下の内容が判 明し得る：すなわち、適当な粒径範囲を有する触媒を用いることにより、触媒か ら分離されるべき（１または複数の）成分の粒径の調節は不必要になる。

固体成分の分離は、もしもフィルタープレートまたはふるいを分離中に振動させ るか、またはフィルタープレート上のスラリーを撹拌すると促進され得る。触媒 が分離された後、反応混合物の残余を、残留する（ｌまたは複数の）固体成分を 保持するであろうフィルター上で濾過することができる。フィルターケークおよ び濾液中に見出される所望生成物の相対量は、反応媒質中の所望生成物の溶解性 に依存する。濾液およびフィルターケークは別個に処理することができ、幾つか の成分は触媒と共にプロセス中で所望により再循環される。

従って、その最も広い面において本発明は少なくとも１種の他の粒状固体成分お よび液体を更に含んでなる反応混合物から粒状固体触媒を分離する方法に関し、 この方法は、複数の固体成分の一種を、（ｌまたは複数の）固体成分の見掛は粒 径範囲外にある見掛は粒径を有するように作成し、しかる後反応混合物を、より 大きな粒子を有する（ｌまたは複数の）成分を保持しそして混合物の残余を通過 せしめるであろう装置を用いて濾過するか、または遠心分離することを特徴とす る。

本発明の第一の好ましい態様において、触媒から分離されるべき（ｌ又は複数の ）固体成分は、触媒の見掛は粒径範囲の下限よりもより小さい見掛は粒径を有す る。

本発明の更に好ましい態様において、分離されるべきより大きな粒子の見掛は直 径とより小さな粒子の直径の比は、少なくとも２である。

本発明の更に好ましい態様において、触媒の見掛は粒子直径は、２５〜１０．０ ００μｍの範囲内、好ましくは５０〜７５０μｍ１より好ましくは５０〜３００ μｍの範囲内にある。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化酵素である。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化プロテアーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は金属プロテアーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒はセリンプロテアーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化サーモリシンである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化アミダーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化エステラーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化アシラーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒はペニシリンＧの６−アミノ基を 脱アシル化することのできる固定化酵素である。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒はアンビシリの６−アミノ基を脱 アシル化することのできる固定化プロテアーゼである。

本発明の更に好ましい態様において、固定化酵素はペニシリンＧアシラーゼであ る。

本発明の更に好ましい態様において、固定化触媒はアンピシリンヒドロラーゼで ある。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化全細胞調製品である。

本発明の更に好ましい態様において、固体触媒は固定化細胞ホモジネート調製品 である。

本発明の更に好ましい態様において、（ｌまたは複数の）出発物質が反応混合物 中に完全に溶解されるプロセスにおいて生成された固体生成物は、濾液を触媒の みを保持するフィルターから合成された固体生成物を保持するフィルターまで導 くことにより、次いで濾液をこのフィルターから触媒まで再循環させることによ り反応中において触媒から連続的に分離される。

更に好ましい態様において、本発明は側鎖に対応する酸を有するβ−ラクタム抗 生物質核またはこの酸の誘導体のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵 素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は６−アミノ−ペニシラン酸の６−アミノ基 のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離 する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミノ−セファロスポラン酸内の７− アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余 から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミツーツーメトキシセファロスポラ ン酸内の７−アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応 混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミノ−３−メトキシ−３−セフェム −４−カルボン酸内の７−アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定 化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミツージスアセトキシセファロスボ ラン酸内の７−アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反 応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は３−クロロ−７−アミノ−３−セフェム− ４−カルボン酸内の７−アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化 酵素を反応混合物の残余から分離するニルグリシンエチルエステルを有するβ− ラクタム抗生物質の核の方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミノ−３−（１，２゜３−トリアゾ ール−４（５）イルチオメチル）−３−セフェム−４−カルボン酸内の７−アミ ノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から 分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明は７−アミノ−３−（２−（５−メチル−１ ，３，４−チアジアゾリル）チオメチル〕−セフェムー４−カルボン酸内の７− アミノ基のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余 から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシンを 有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる固定化 酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシンの 誘導体を有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられ る固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシンア ミドを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる 固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシンメ チルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用 いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フエ更に好ましい態 様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−アシル化を触媒するために用い られる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシジプ ロビルエステルのβ−ラクタム抗生物質の核ノアシル化を触媒するために用いら れる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−フェニルグリシン　 イソプロピルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒する ために用いられる固定化酵素を反応混合物め残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤とｌ　’−Ｄ−４−ヒドロキシ フェニルグリシンを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するため に用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシンの誘導体を有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒する ために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシンアミドを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するた めに用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシン　メチルエステルを存するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を 触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から′分離する方法に 関する。

ヒドロキシフェニルグリシン　メチルエステルｆＷＴるβ−ラクタム抗生物質の 核のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分 離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシン　プロピルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化 を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に 関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシン　イソプロピルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシ ル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方 法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤としてＤ−４−ヒドロキシフェ ニルグリシン　イソプロピルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシ ル化を触媒するために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方 法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸を有 するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる固定化酵 素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸の誘 導体を存するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる 固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸アミ ドを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる固 定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸メチ ルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用い られる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸メチ ルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用い られる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として２−チオフェン酢酸エチ ルエステルを有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用い られる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として３−チオフェンマロン酸 を有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いられる固定 化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアシル化剤として３−チオフェンマロン酸 の誘導体を有するβ−ラクタム抗生物質の核のアシル化を触媒するために用いら れる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアミノ基が保護されているし一アスパラギ ン酸を用いたし一フェニルアラニン　メチルエステルのアシル化を触媒するため に用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

更に好ましい態様において、本発明はアミノ基が保護されているし一アスパラギ ン酸を用いたり、　Ｌ−フェニルアラニン　メチルエステルのアシル化を触媒す るために用いられる固定化酵素を反応混合物の残余から分離する方法に関する。

本発明の好ましい態様によれば、本発明は、形成される生成物またはその一部が 、反応混合物から沈殿するようなそのような条件下で加水分解が行なわれる場合 、対応する遊離酸またはその塩を与えるためアミノカルボン酸のアミドまたはエ ステルの加水分解を触媒するために用いられる固定化酵素を、反応混合物から分 離する方法に関する。

本発明の好ましい態様によれば、本発明は、形成される生成物またはその一部が 、反応混合物から沈殿するようなそのような条件下で反応が行なわれる場合、フ マル酸またはその塩のリンゴ酸またはその塩への転換を・触媒するために用いら れる固定化酵素を、得られた固体生成物から分離する方法に関する。

発明の詳細な記載 本発明に係る分離方法は、不均一触媒、例えば固体の、粒状の固定化酵素を反応 混合物から分離すべき場合に特に有用であり、該混合物は更に少なくとも１種の 他の粒状固体成分を含有する。この他の粒状固体成分が、触媒の影響下合成され た生成物であるか、またはその固体成分が未処理の出発物質、例えば過剰に添加 される出発物質のいずれであってよい。

触媒が反応の当初においては反応へ混合物中に存在する唯一の固体成分でありそ して生成物が反応混合物の液体部分中に難溶性である場合、触媒は、複数の固体 粒子を、複数の固体成分の見掛は粒径範囲外にある見掛は粒径を有するように作 成し、しかる後反応混合物を、より大きな粒子を有する成分を保持しそして混合 物の残余を通過せしめるであろうフィルターまたは遠心機を用いて濾過するか、 または遠心分離することによって反応混合物から分離され得る。

以下において、反応混合物の液体部分は、「反応液体」または単に「液体Ｊを明 示する。従って、反応液体はその中で反応が行なわれる溶剤（または溶剤混合物 ）並びに出発物質および生成物が固体または液体であってよい該出発物質および 生成物の溶解せしめられた部分を含んでなる。出発物質が完全に溶解されそして 生成物の粒子が触媒の粒子よりもより小さい場合のプロセスにおいて、反応混合 物の残余からの触媒の分離は、触媒のみを保持するフィルターから合成された固 体生成物を保持するフィルターまで濾液を導びくことにより次いでこのフィルタ ーから触媒まで濾液を再循環させることにより連続的方法て行うことができる。

このようにして、反応の平衡はより高収率に向って影響せしめられる。

１種またはそれ以上の出発物質は反応が行なわれる溶剤中で難溶性であってよい 。この場合、（１または複数の）出発物質は反応混合物中で固体形で存在するこ とができ次いで反応液体は、（ｌまたは複数の）成分に関して飽和されるであろ う。もしも反応から得られる生成物が反応液体中に十分に可溶である場合、処理 中の本発明によって解決されねばならない課題は、固体の、未反応出発物質を含 有する反応液体から触媒を分離することである。もしも、また生成物が反応液体 中で難溶性である場合、生成物および未反応出発物質は、触媒が反応混合物の残 余から分離された後お互いに分離されねばならないであろう。

粒子様触媒の真の寸法は、例えば適当なスケールを備えた顕微鏡を用いて測定で きる。粒子は多くの異なる形状で生じる。従って、触媒は例えば針状様、板状様 又は立方体であってよい。本発明における重要な特徴は、粒子の真の寸法ではな く、むしろ例えば見掛は直径の如く見掛は寸法である。本明細書において、指称 「見掛は寸法」または「見掛は直径」は粒子がふるいまたはフィルター上でいか に挙動するかを表わすために用いられる。従って、粒子の見掛は寸法は実際の使 用において、粒子をして孔または細孔を丁度通過せしめるであろう鎖孔または孔 の直径に対応する。本発明の好ましい態様において、触媒の粒径は、分離手順が 許容せしめると同じ程度に減少せしめられる。

このことは、触媒の高活性を確保するのに役立ちそして拡散の問題を排除するの に役立つ。

以下の内容は周知である：すなわち、触媒の存在下で行なわれる多くのプロセス は極めて特異的でありそして該多くのプロセスは、もしも触媒が酵素である場合 、特に高収率で行なわれる。本発明の利点の一つは、触媒が再使用され得ると言 うことである。反応混合物の残余から触媒を分離するために用いられる極めて温 和な条件のために、触媒活性の損失は通常極めて小さい。高い処理量に対する寄 与が、次の事実によって与えられる：すなわち、本発明方法はそ存在するそのよ うな多量の出発物質を用いて行なわれる反応を用いた使用に対し適切に適合して いる。

本発明方法に従って用いられるべき固体触媒は、粒状固定化酵素調製品の形態で 存在してもよく、そして反応液体の密度よりもより高いかまたはより低い密度を 有してもよい。この調製品において、酵素は吸着され、吸収され、共有結合され 、補促されまたはイオン力によって結合される。酵素を固定化する方法は業界に おいて公知である。公知の技術はまた、触媒例えば固定化酵素を担持するため並 びにそれらの粒径分布に従って粒状固体の種々の分画を単離するための粒子を製 造する方法を提供する。各々の場合において用いられるべき特異的触媒は、行な われるべきプロセスに依存する。

本発明方法は、一般に水中で行なわれる。所望により、有機溶剤を添加できる。

有機溶剤は、好ましくは水混和性溶剤、例えばメタノール、エタノール、ｌ−プ ロパツール、２−プロパツール、■−ブタノール、１．４−ブタンジオール、ア セト：ノ、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジメチルスル ホキシドから選ばれる。

先に述べた如く、固体生成物が形成される場合、温度は粒子のサイズに影響する 因子の一つである。そのことは妥当である：何故ならば、結晶の成長速度は温度 に依存するするか、または幾つかの場合において異なる結晶態種が異なる温度で 発生するからである。反応液体の凝固点は、本発明方法を行うことに対する絶対 低温度限界を形成する。もしも、使用される触媒が固定化酵素である場合、本発 明方法を行うことに対する絶対高温度限界は、通常酵素に依存するであろう。

本発明が必須の改善点に到る特異的領域の例は次の如くである：ｌ）半合成ペニ シリンおよびセファロスポリンの調製、２）アミドおよびエステルの加水分解お よび３）ペプチドの合成。

本発明を用い好都合に調製できるβ−ラクタム抗生物質（ペニシリンおよびセフ ァロスポリン）の例は、アンピシリン、アモキシリン、チカルシリン、セファク ロール、セファトリジン、セフアバロール、セファレキシン、セファドロキシル 、セファログリシンおよびセファロチンである。

現在、半合成β−ラクタムは産業において化学的方法によって製造される。ペニ シリンは、例えば通常保護されたそのカルボキシル基を有する６−ＡＰＡを、活 性化側鎖誘導体と反応させ、引き続き加水分解により保護基を除去することによ って製造される。従って、適当に保護されたカルボン酸基をＤ−フェニルグリシ ルクロリドと反応させ、引き続きカルボン酸基を保護する基を加水分解的除去に よりアンピシリンを製造することができる。これらの反応は、典型的に費用のか かる工程を含み、その工程は例えば０℃未満の温度（幾つかの場合には一２５℃ 未満）の使用、シリル化剤並びに塩化メチレンの如き有機溶剤であり、これらは 注意深く取り扱わなければならない：何故なら、それらは健康を害しそして環境 に対して有害であるからである。

Ｄ−フェニルグリシンまたはＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンの誘導体（例 えば低級アルキルエステル）を用いてβ−ラクタム核のアシル化による半合成β −ラクタム抗生物質の酵素的調製は、例えば西ドイツ特許出願第２．１６３．７ ９２号、オーストリア特許第２４３、９８６号、オランダ特許出願第７０−９１ ３８号、西ドイツ特許出願第２、６２１．６１８号から、公知である。従来技術 において記載されるプロセスは、典型的にはＤ−フェニルグリシン誘導体の３０ ０　＋ｎＭ未満の濃度およびβ−ラクタム核の２５＋ｎＭ未満の濃度で行なわれ た。

出発物質のこの相当な低濃度は、半合成β−ラクタム抗生物質のこれらの公知の 方法（いずれも工業的規模で未だ用いられていない）の潜在的欠点である：何故 ならばその相当の低濃度のため形成されたβ−ラクタム抗生物質の単離をより困 難なものとしそして従ってより費用のかかるものとしている。更に、報告された 収率は、低いものであり、典型的には８５％未満でありそして未反応β−ラクタ ム核を循環させるプロセスが要求され、これはより多くのそして費用のかかる単 位操作に仕向けている。

半合成β−ラクタム抗生物質の酵素的合成において出発物質の濃度を増加させる ことによって直面する問題の一つは、含まれる出発物質および反応中に形成され る生成物の幾つかの溶解性が相当に低いということである。従って、経済的によ り好ましい条件下でプロセスを行うため、出発物質が反応液体中で完全に溶解さ れ得ないほど多量出発物質が反応当初において存在することが、必要であるかも しれない。また、形成される生成物は固体形で分離してもよい：何故なら、単位 当たり生成される多量は、反応液体中で完全に溶解されてはいけないからである 。次いで、反応混合物の残余を更に処理する前に固体生成物および／または未反 応出発物質を含有する反応混合物から、触媒を分離するための必要性が生じる： 何故なら、処理は酵素活性に有害な条件、例えば低ｐＨ値で（例えば、０．５〜 ２．０のｐＨ値で）生成物および未反応出発物質の溶解を含んでもよい。

β−ラクタム抗生物質核内に側鎖を導入するため、すなわちペニシリンの６−ア ミノ基内にアシル基を導入するため、またはセファロスポリンの７−アミノ基内 にアシル基を導入するために用いられるアシル化剤は、対応する酸またはその誘 導体、例えば低級アルキル（メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピル）エ ステルまたはその第一、第二もしくは第三アミドであることができる。メチルエ ステル、エチルエステルおよびアミドが好ましい。誘導体は、遊離形または塩の 形、例えばＩＣ！塩又は）１．ｓｏ、塩の形で用いてもよい。

使用されるべき酵素は、対象の反応を触媒する酵素であってよい。

そのような酵素は、ペニシリン　アミダーゼ、ペニシリン　アシラーゼ、または アンピシリン　ヒドロラーゼと通常称されている。こアファノクラジウム（Ａｐ ｈａｎｏｃｌａｄｉｕｗ＋）　、セファロスポリン（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ ｕｍ）　（西ドイツ特許出願Ｎｏ、２，６２１．６１８）　、アセトバク特許出 願Ｎｏ、　２．１６３．７９２　Ａ）　、アセトバクター　タービダンス（Ａｃ ｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｒｂｉｄａｎｓ）　（高欄等、ＢｉｏｃｈｅＩｎ、Ｊ 、　１３７　（１９７４）、　４９７−１８）、キサントモナス　シトリ−（Ｘ ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｉｉ）（ヨーロッパ特許公開Ｎｏ、３３９．７ ５１）　、クルベラ　シトロフイラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ） （オカチ等、Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　３７　（１９７３）、　２７９ ７−２８０４）、ニジヤリチア　コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） 　（西ドイツ特許出願Ｎｏ。

２、９３０．７９４）、およびバシラス　メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍ ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（シアング及びベネット、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　 ９３　（１９６７）、　３０２）から由来する。

反応混合物の残余から分離された後、触媒は所望により洗浄手順を経た後再使用 できる。生成物および随意の未反応出発物質は、分離できそして別個に処理でき 、またはそれぞれ再循環できる。

本発明方法を用い好都合に製造され得るペプチドの例は、以下に指称されるＺＡ ＰＭにおけるＮ−ベンジルオキシカルボニル−し−アスパルチル−し−フェニル アラニン　メチルエステルである。ＺＡＰＭは、甘味剤アスパルテームの製造に おける重要な中間体である。アスパルテーム（Ｌ−α−アスパルチル−し−フェ ニルアラニン　メチルエステル）の製造において、重要な工程の一つは、アスパ ラギン酸誘導体とフェニルアラニン　メチルエステル塩酸塩をカップリングする ことを（例えば、ＺＡＰＭを形成するため、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−し −アスパラギン酸とＬ−フェニルアラン　メチルエステル塩酸塩をカップリング すること）を触媒する酵素を含む。ＺＡＰＭは、Ｌ−フェニルアラン　メチルエ ステル（またはもし存在する場合り−フェニルアラニン　メチルエステル）との 極めて難溶性付加化合物を形成しそして従って合成中に沈殿する。これにより反 応の平衡は縮合の方向に移行する。

従来技術によれば、半一精製可溶性酵素調製品（例えば、サーモリシン）は、縮 合工程において触媒として使用できる。反応生成物から酵素を分離するため、反 応生成物を溶解し次いで有機溶剤（例えばアセトン）を添加することにより沈殿 させ次いで、例えば濾過により除去する。しかし、酵素の触媒活性の１４％がら 少なくとも６０％までが、プロセス中に損失する（ノナ力等、米国特許第４．２ １２．９４５号およびメイヤー等、ｒＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇ ａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｊ（編者ニドラムパー、フロンデル　プラス　 アンド　リンフ）、１３５〜１５６頁（１９８５））。活性の主な損失は、酵素 の沈殿中におこる。

ＺＡＰＭを製造するための前記プロセスにおいて固定化サーモリシン調製品を用 いた本発明に係るプロセスを用いることにより、分離工程が簡略化されそして分 離工程における酵素活性の損失は約１％まで減少する。

本発明を更に次の実施例により説明するがしがし、この実施例は保護の範囲を制 限するものではない。以下の記載および以下の実施例および請求の範囲で開示さ れる特徴は、双方別個におよびそれらの任意の組合せにおいて、その異った形態 で本発明を実現するために重要であろう。

例１ 特にβ−ラクタムの合成に適当な触媒の調製Ｅ、コリー由来の固定化ペニシリン 　Ｇ　アシラーゼを３００μｍの篩で篩別し次いで水を用いたフラッシングによ り１８０ａｍの篩で篩別した。１８０μｍの篩上に保持された物質を、以下に示 す例２〜５において酵素触媒として用いた。パラシングハム等（Ｂｉｏｃｈｉｍ 。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　２７６　（１９７２）　２５０〜２５６）によっ て記載される如き４−ジメチルアミノベンズアルデヒド法により分析した場合、 触媒の活性は、湿触媒１ｇに対し１１５ペニシリン　Ｇ　アシラーゼ単位（Ｕ） であった。

例２ アンピシリンの酵素的合成 り−フェニルグリシン　メチルエステル（以下において、Ｄ−ＰＧＭと指称され る）および６−アミノペニシラン酸（以下において、６−ＡＰＡと指称される） を、６．０のｐＨ値を有する５０＋ｎＭのホスフェート緩衝液に懸濁させ、Ｄ− ＰＧＭおよび６−ＡＰＡの最終濃度をそれぞれ４５０ＩＩＭおよび１００　ｍＭ とした。懸濁液の温度を、３５℃に至らしめ次いで（例１に係る）湿固定化酵素 １０．０ｇを加え、全容量を１００　ｍｌとした。

反応を３５℃で十分に撹拌しながら進行させ、ｐＨ値を２ＭのＨ，ＳＯ，で滴定 することにより６．０に保持した。

約０．５時間後、Ｄ−フェニルグリシン（以下において、Ｄ−ＰＧと指称する） が反応混合物から沈殿を開始し次いで約３時間後、アンピシリン濃度は最大７７ ｍＭに遠し、これは６−ＡＰＡの８５％の転化に相当する。この時点で、反応容 器の内容物を底部として１００μｍ孔寸法篩および篩の直上に設けられた回転プ ロペラを有するフィルター装置に移した。固定化酵素を篩により保持し、同時に スラリー保持部分で通過させた。この濾液中の沈殿物は、幾分かのアンピシリン を含むＤ−フェニルグリシンから成りそして液体は、特に溶解せしめられた生成 物および未反応出発物質を含有していた。

形成されたアンピシリン結晶は、５０μｍ未満の粒径を有していた。

濾液（すなわち、結晶および反応液を含んでなるスラリー）を遠心分離し次いで 澄明な遠心分離物を用い触媒上に留まっている結晶を洗い流した。分離装置から の濾液の流れ並びに分離装置への澄明な上澄みの流れを調節することにより、゛ 触媒を分離中に常に懸濁状態に保持した。結晶は触媒フラクション中に見出すこ とができる場合、タンク内の液体を完全に排出し、篩上に触媒を残した。

合成中に形成された９７％のアンピシリンおよび９７％のＤ−ＰＧが濾液内に存 在していた。アンピシリンを単離し次いで更に公知方法により精製した。

分離装置内に保持された結晶を、５０ｍＭのホスフェート緩衝液（ｐＨ値：６． Ｏ）で洗い次いで例１で述べた方法に従ってその活性を分析した。表１に示す如 く、合成後触媒活性の著るしい損失はなく、そして従って触媒は再使用に対して 適当であった。

表１ カラム　：　ＲＰ　ＬＣ−１８，（２５０ｘ４．６ｉｍ　；　５　Ｂｍ）溶離液 Ａ　：　２５＋ｎＭホスフェート緩衝液、ｐＨ値６．５溶離液Ｂニアセトニトリ ル 溶離は、表２に従がい溶離液Ａおよび溶離液Ｂの混合物を用いて行った 表２ 流速：１ｗ＋Ｉ／分 ２１５　ｎｍてのＵＶ検出 保持時間（分）　：　Ｄ−ＰＧ　：　４．１．６−ＡＰＡ　：　８．１．アンピ シリン：１３．９゜Ｄ−ＰＧＭ　：　１８ 例３ セファレキシンの酵素的合成 り−フェニルグリシン　メチルエステル、ＨＣｌ塩（１，６５２６ｇ）および７ −アミツデスアセトキシセフアロスボラン酸（７−ＡＤＣＡ）　（０，４２７８ ｇ）を、５０ｍＭのホスフェート緩衝液（ｐＨ値：６．５）中に溶解し次いて３ ５℃に温度調節した。例１に係る酵素触媒（２ｇ）を添加し、次いで反応混合物 の容量を緩衝液を用いて２０ｗ＋１に調節した。効率的な混合、ｐＨ値および温 度を一定に保ちながら反応を進行せしめた。

酵素触媒の添加後４５分に、沈殿物が形成されそして更に２０分後視拌を停止し 次いで反応容器の内容物を例２で記載したフィルター装置に移し、次いで触媒を 形成された沈殿物および反応液体から分離した。沈殿物および含有している反応 液体、特にセファレキシン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン　メ チルエステルおよび７−アミツージスアセトキシセファロスボラン酸から、セフ ァレキシンを単離し次いで公知方法により精製した。

９９％以上の触媒活性が分離工程後に触媒中に保持されそして従って触媒は再使 用に対して適当であった。すすぎ工程を、触媒を再使用する前に導入してもよい 。

例２で記載した条件を同様の条件を用いＨＰＬＣにより反応を行った。

７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンの保持時間は、それぞれ６．３分および１３ ．４分であった。

例４ アモキシリンの酵素的合成 り−４−ヒドロキシフェニルグリシンアミド（４４，９４ｇ、以下においてＨＰ ＧＡと指称する）および６−ＡＰＡ　（１４，３０ｇ）のスラリーを、５０ｍＭ のホスフ、、−ト緩衝液ＣｐＨ値：６．５）中で調製し、次いで底部として１０ ０μｍ孔径の篩およびこの篩の直上に設けられた回転プロペラを備えた反応容器 中で２５℃に温度調節した。反応を、（例１に係る）４０ｇの触媒（最終容量： 　４００　ｍｌ）を添加することにより開始し、次いでｐＨ値を２ＭのＨｍＳＯ ｔで滴定することにより反応中一定に保持した。篩の下の容量は１５ｍ１未満で ありそしてポンプの助成により、（反応液並びに出発物質および生成物の結晶を 含有する）濾液を、全プロセス中反応容器の頂部まで連続的に戻した。

１０時間後、アモキシリンの濃度は８５％転換に相当する最大に達しそして反応 混合物は、特にアモキシリン、Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（以下にお いて）ＩＰＧと称する）および未反応ＨＰＧＡを含有していた。濾液の反応容器 への再循環を停止し次いで代りに濾液を遠心機に導いた。先の２つの実施例にお いて述べた如く、澄明な上澄みを用い触媒から最終的な結晶を洗い出した。

生成された９５％のアモキシリンおよび生成された９８％のＨＰＧを濾液から回 収した。アモキシリンを、公知方法を用い更に精製した。

用いた触媒は再使用に対し適当であった：何故なら、９９％以上のその触媒活性 が保持されていたからである。

例２で記載したと同様の１（ＰＬＣ系を用いて反応を行った：但し、９５％の２ ５０１Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ値：６．０）に溶解した５％のアセトニト リルを、化合物のアイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶離口１１／分） に対して用いた。これらの条件は、対象の化合物に対し次の保持時間（分）を与 えた：　２．５．　Ｄ−ＨＰＧＡ　：　３．３．６−ＡＰＡ　：　６．０および アモキシリン：１５．０゜ 例５ Ｄ−４−ヒドロキシフェニルアミド（ＨＰＧＡ）の酵素的加水分解ｐＨ６，０に 調節された、水中のＨＰＧＡ　（８，３５ｇ　）の混合物に湿触媒（２，２５ｇ 、例１に係る）を加え、全量を１００　ｍｌに調節した。２Ｍの硫酸を用いて滴 定することにより、ｐｉ（値を６．０の一定に保ちながら、加水分解を３５℃で 進行せしめ、同時に効率的な撹拌を維持した。

３時間後、ＨＰＧＡを遊離酸、１（ＰＧにまで十分に加水分解した。触媒および 部分沈殿ＨＰＧの含量のため、反応混合物はスラリーとして表われた。

反応容器の内容物を分離装置に移し次いで触媒を例２で記載した如く反応混合物 から分離した。この分離からの濾液は、沈殿）ＩＰＧ並びに、特に塩および溶解 せしめられたＨＰＧを含有する上澄みを合計で９６％の形成せしめられたＨＰＧ が濾液中に見出された。ＨＰＧを公知方法により更に精製した。

反応容器中の触媒を、５０ｍＭのホスフェート緩衝液（ｐｉ（値：６．Ｏ）を用 いて洗浄し次いで触媒活性の著るしい損失なしで再使用した（全活性の１％未満 が合成およびその後の分離中に失われた）。

例４で記載したＨＰＬＣ法を反応を監視するため用いた。

例６ サーモリシン（ｔｈｅｒイｏｌｙｓｉｎ）触媒の調製サーモリシン（８ｇ１シグ マＰ−１５１２）を、２５ｍＭのホスフェート緩衝液（ｐ１１値ニア）に溶解し 、ｍ１当たり５０ｍｇのタンパク質およびｍｌ当たり３７５０Ｕ　（下記参照） とした。Ｅ、コリー発酵由来の細胞（例えば、Ａ、ゲブアウエル等、Ｂｉｏｐｒ ｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｇ　（１９８７）　５５〜５８）を集め （約４０ｇの乾物）次いで１００℃に１０分加熱し、細胞中の大部分の酵素活性 を失活させた。サーモリシンを、ランペルマン等の米国特許第４，８９２．８２ ５）　（ノボ　ノルディスク　インダストリーＡ／Ｓに付与）に記載される如く 固定化された細胞に加えた。固定化された細胞を有する物質をしぼり出しそして 約１０％の含水率まで乾燥した。得られた粒子を粉砕し次いで粉砕された物質を 篩別した。

７５〜１５０μｍの粒径分画を、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスバル チルーし一フェニルアラニン　メチルエステルの合成において触媒として用いた 。触媒の活性は、ｇ当たり約３０００　Ｕであった。

活性をカゼイン消化法を用いて測定した（１単位（Ｕ）は、３５℃で７．５のｐ Ｈ値で毎分１．０μ＋ｎｏｌｅのチロシンに相当する色（フォリン−チロカルテ ラ（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）試薬による色）を生成するためにカゼイ ンを加水分解するであろう）。

Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−し−アスパルチル−し−フェニルアラニン　メ チルエステルの合成 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−し−アスパルチル酸（０，１モル）およびＬ− フェニルアラニン　メチルエステル塩酸塩（０，２５モル）を、水に溶解し次い で６．５のｐＨ値および最終容量３５０　ｍｌに調節した。

溶液を４０℃で温度調節し次いで上記の如くして得られた触媒（１５ｇ）を添加 した。触媒を使用前に水中で膨潤させ、これにより粒径は約１５０〜４００μｍ に増加した。反応を４０℃で進行させ、この間ｐＨ値を６．５に保ちつづけそし て効率的なせん断撹拌を維持した。縮合成物、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル− し−アスノくルチル−Ｌ−フェニルアラニン　メチルエステル（ＺＡＰＭ）は、 水中では非常に溶解性の劣る未反応し一フェニルアラニン　メチルエステルと付 加化合物を形成する。従って、生成物が徐々に形成されるとき、該生成物はこの 付加化合物として殆ど定量的に沈殿した。２０時間後、反応混合物を約５℃に冷 却し次いで例２で記載した分離装置に移した。触媒を生成物および例２で記載し た如き反応液体から分離した。反応容器内の触媒は、再使用できる；何故なら該 触媒活性の９９％以上が分離工程後に維持されているからである。ＺＡＰＭは自 体公知の方法（アスノくルチック（ａｓｐａｒｔｉｃ）部分のＮ−保護基の除去 、結晶化等）によりアスパルタ−（ａｓｐａｒｔａ＋ｎｅ）に更に加工できる。

オヤマ等（Ｊ、　Ｃ，Ｓ。

ＰｅｒｋｉｎＩｌ、　（１９８１）　３５６）のＨＰＬＣ法を用いＺＡＰＭの形 成を続かしめた。

例７ ペニシリン　Ｇ　アシラーゼ活性を有するＥ、コリーを、ベノくウェル、Ａ等（ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　！　（１９８７）　５５〜５ ８）に従って発酵させた。固定化を、ラムペルマン１Ｍ９等（米国特許第４、８ ９２．８２５号（ノボ　インダストリーＡ／Ｓに付与））に従って行った。固定 化酵素を含有する物質を押出し次いで残留含水率が約ｌＯ％（ｗ　／　ｗ　）に なるまで乾燥した。乾燥物質を粉砕次いで１００〜２００μｍの粒径分布を有す る分画を、適当な篩を用いることにより粉砕生成物から得た。この分画における 酵素活性はｇ当たり約２００ペニシリン　Ｇ　アシラーゼ単位であることが見出 された。水中で膨潤させた後、粒径分布は約２００〜５００μｍであった。

約３００　ｍｌの水中におけるＤ−ＰＧＡ　弓／２　ＨｔＳＯｔ（７４，７ｇ、 　０．３７５モル）、７−ＡＤＣＡ　（２１，４ｇ、　０．１０モル）、および ２−ナフトール（１０，８ｇ、０．０７５モル、粒径＜１００μｍ）の混合物（ スラリー）のｐＨ値を、４Ｍの水酸化アンモニウムを加えることにより６．７に 調節した。水を加えて４００１１１とし、引き続き前記の如く調製したＥ、コリ ー　ペニシリン　Ｇ　アシラーゼ（乾燥基準で５０ｇを水に懸濁させて合計１０ ０１）を加え、次いで混合物を２５℃で撹拌した。

３時間後、反応混合物を１００μｍ孔の篩上に生石し、これは酵素を有する粒子 を保持し、一方未だスラリーの反応混合物の残部は通過した。篩を通過するスラ リーを焼結ガラスフィルター上で濾過されこのフィルターは固体物質を保持しそ して幾分の母液を用い１００μｍ篩上に残っている固体物質を洗い酵素粒子を、 合成せしめられた生成物を含有する如何なる付着している微細スラリーから遊離 化せしめた。また、洗浄を焼結ガラスフィルターを通して濾過した。

ガラスフィルター上に集められた生成物を酢酸ブチル（２００ｍｌ）で洗い次い で水（１５０ｗ＋１）および酢酸ブチル（１５０ｍｌ）の混合物中に懸濁させた 。水相のｐＨ値を、３Ｍの硫酸を添加して１．５に調節し次いで撹拌を１０分間 継続した。次いで水相を酢酸ブチル相から分離しそして更に酢酸ブチル（２Ｘ　 ２０＋ｏｌ）で洗った。水相の容量を蒸発により７５ｍ１まで減少させ、２−プ ロパツール（７５ｍｌ）を添加し次いでｐＨ値を４Ｍの水酸化アンモニウムを添 加することにより４．７に調節した。得られたスラリーを５℃に１５分間冷却し 、しかる後固体物質を焼結ガラスフィルター上に集めそして水／２−プロパツー ル（ｌ：１．２５ｍ１）で洗った。３０℃の真空濾内で１２時間撹拌後、３３． ６ｇ　（理論値の９２．４％）のセファレキシン−水和物を、白色粉末（）ＩＰ ＬＣによる純度＋９９．９％）として得た。

使用後、１００μｍ篩上に残っていた酵素粒子を水（３Ｘ　１００　ｍｌ）で洗 い、排液し、次いで最終的に約ｌθ％の含水率まで乾燥した。重量は約５０ｇで あり、そして酵素活性はｇ当たり約２００ペニシリンＧ　アシラーゼ単位である ことが見出され、実際的に活性の損失は生じていなかったことが示された。従っ て、固定化酵素は、例えば前記の如きプロセスにおいて再循環させるために適当 である。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　３７１０６ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，Ｎ Ｚ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　クラウセン、キム デンマーク国、デーコー−２９９０ニポー。

レードレルスバイ　８５ （７２）発明者　イエンセン、トーマス　リスベルウデンマーク国、デーコー− ２２００コペンハーゲン　エン、４．チー、ホー０．ペテルファベルス　ガゼ　 １３

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．もう一つの粒状固体成分および液体を更に含んでなる反応混合物から粒状固 体触媒を分離する方法であって、複数の固体成分の一種を、（１または複数の） 固体成分の見掛け粒径範囲外にある見掛け粒径を有するように作成し、しかる後 反応混合物を、より大きな粒子を有する（１または複数の）成分を保持しそして 混合物の残余を通過せしめるであろう装置を用いて濾過するかまたは遠心分離す ることを特徴とする、前記方法。
2. ２．触媒から分離されるべき（１または複数の）成分が、触媒の見掛け粒径範囲 の下限値よりもより小さい見掛け粒径を有することを特徴とする、請求の範囲第 １項記載の方法。
3. ３．より大きな粒子の見掛け直径とより小さな粒子の見掛け直径との比が少なく とも２であることを特徴とする、請求の範囲第１又は２項記載の方法。
4. ４．触媒の見掛け寸法が、２５〜１０，０００μｍ、好ましくは５０〜７５０μ ｍ、より好ましくは５０〜３００μｍの範囲内にあることを特徴とする、請求の 範囲第２又は３項記載の方法。
5. ５．固体触媒が固定化酸素である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載 の方法。
6. ６．固定化酵素が、プロテアーゼ、金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、サ ーモリシン、アミダーゼ、エステラーゼまたはアシラーゼである、請求の範囲第 ５項記載の方法。
7. ７．固定化酵素が、ペニシリンＧの６−アミノ基またはアンピシリンの６−アミ ノ基を脱アシル化することができることを特徴とする、請求の範囲第５項記載の 方法。
8. ８．固体触媒が、固定化全細胞または細胞ホモゲネート調製品であることを特徴 とする、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．（１またはそれ以上の）出発物質を、反応混合物中で完全に溶解するプロセ スにおいて生成された固体生成物を、濾液を触媒のみを保持するフィルターから 合成された固体生成物を保持するフィルターまで導びき次いで濾液をこのフィル ターから触媒に再循環することにより、反応中の触媒から連続的に分離するため の請求の範囲第２〜８項のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．触媒以外の固体物質が、処理が開始されるとき触媒が反応混合物中に存在 する場合、６−アミノペニシラン酸、７−アミノセファロスポラン酸、７−アミ ノ−７−メトキシセファロスポラン酸、７−アミノ−３−メトキシ−３−セフェ ム−４−カルボン酸、７−アミノデス−アセトキシセファロスポラン酸、３−ク ロロ−７−アミノ−３−セフェム−４−カルボン酸、７−アミノ−３−（１，２ ，３−トリアゾール−４（５）−イルチオメチル）−３−セフェム−４−カルボ ン酸または７−アミノ−３−〔２−（５−メチル−１，３，４−チアジアゾリル ）チオメチル〕−３−セフェム−４−カルボン酸を、Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ −４−ヒドロキシフェニルグリシン、２−チオフェン酢酸もしくは３−チオフェ ンマロン酸、またはＤ−フェニルグリシン、Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシ ン、２−チオフェン酢酸もしくは３−チオフェンマロン酸のエチルエステル、プ ロピルエステルまたはイソプロピルエステルを用いてアシル化するために触媒す るために用いた固定化酵素を、反応混合物の残余から分離するための請求の範囲 第１〜９項のいずれか１項に記載の方法。
11. １１．反応を、形成される生成物またはその一部が反応混合物から沈殿するよう なそのような条件で行なう場合、Ｌ−フェニルアラニン　メチルエステルまたは Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン　メチルエステルを、Ｎ−保護Ｌ−アスパラギン酸を 用いたアシル化を触媒するために用いられる固定化酵素を、得られた固体アシル 化生成物から分離するための、請求の範囲第１〜６項および第８または９項のい ずれか１項に記載の方法。
12. １２．反応を、形成される生成物またはその一部が反応混合物から沈殿するよう なそのような条件で行なう場合、対応する遊離酸またはその塩を与えるためのア ミノカルボン酸のアミドまたはエステルの加水分解を触媒するために用いられる 固定化酵素を、得られた固体生成物から分離するための、請求の範囲第１〜９項 のいずれか１項に記載の方法。
13. １３．反応を、形成される生成物またはその一部が反応混合物から沈殿するよう なそのような条件で行なう場合、フマル酸またはその一部のリンゴ酸またはその 塩への変換を触媒するために用いられる固定化酸素を得られた固体生成物から分 離するための、請求の範囲第１〜６項および第８または９項のいずれか１項に記 載の方法。