SK134294A3 - Method of separation of particle solid catalyst - Google Patents

Description

Spôsob separácie »

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu separácie časticového tuhého katalyzátora z chemickej reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú tuhú zložku, a to buď počas reakcie alebo po reakcii.

DoterajSí stav techniky

Separácia precipitátu z kvapaliny je dobre známy proces, ktorý možno vykonať dekantáciou, filtráciou alebo odstreďovaním. Avšak, ak reakčná zmes obsahuje dve alebo viac rôznych tuhých zložiek, neexistuje žiadny univerzálny spôsob odseparovania tuhých zložiek od seba. Filtrácia s následnou mechanickou separáciou tuhých zložiek triedením častíc neprichádza do úvahy z praktických dôvodov, v niektorých prípadoch možno tuhé zložky odseparovať od seba mechanickými postupmi, ako je flotácia. Inými spôsobmi sú fyzikálnochemické spôsoby, ako je extrakcia alebo delenie, ktoré využívajú rozdiel v rozpustnosti zložiek, napr. vo vode, vo vodnom roztoku kyseliny, zásady alebo v organických rozpúšťadlách. Predpokladom použiteľnosti týchto spôsobov je to, aby sa dali nájsť podmienky, za ktorých sú zložky, ktoré sa majú odseparovať, stabilné.

V priemyselnom procese, ktorý zahrnuje použitie katalyzátora, je cena tohto katalyzátora často veľmi dôležitým parametrom v celkovej ekonomike tohto procesu. Preto je veľmi dôležitou výhodou, ak možno katalyzátor opäť použiť bez podstatnej straty katalytickej aktivity. Ak je katalyzátor prítomný v reakčnej zmesi spolu s inou tuhou zložkou, ktorá sa buď tvorí počas reakcie, ako je vedľajší produkt alebo požadovaný produkt, alebo je prítomná počas celého procesu, napr. tuhý východiskový materiál pridaný v prebytku, izolácia a opätovné použitie tohto katalyzátora sú sťažené.

V takých prípadoch niekedy možno katalyzátor izolovať extrakciou druhej(ých) tuhej(ých) látky(ok) organickými rozpúšťadlami a/alebo kyselinami alebo zásadami, ktoré rozpúšťajú tuhú(é) látku(ky), avšak nie katalyzátor. Avšak aktivita katalyzátorov, vrátane enzýmov, je veľmi citlivá na pri2 tomnosť takzvaných kaťalyzátorových jedov. Katalyzátorové jedy uplatňujú svoju aktivitu napr. tým, že sa veľmi silne viažu na katalyzátor, alebo ho rozkladajú. Teda silné kyseliny a zásady majú často nepriaznivý vplyv na aktivitu katalyzátorov a najmä enzýmy vo všeobecnosti podliehajú nereverzibilnému poškodeniu, ak sú vystavené vysokým koncentráciám kyselín alebo zásad. To prináša určité obmedzenia pre použitie kyselín a zásad pri spracovaní reakčných zmesí z enzymatických reakcií, ak sa má enzým recyklovať bez podstatnej straty aktivity. Ďalšie obmedzenia podmienok spracovania môže samozrejme priniesť povaha požadovaného produktu, ktorý sám osebe môže byť nestálou zlúčeninou.

Doterajší stav techniky neprináša uspokojivé riešenie vyššie popísaných problémov.

Podstata vynálezu

Alternatívne k rozpúšťaniu tuhej(ýcb) zložky(iek) reakčnej zmesi po reakcii, okrem tuhého katalyzátora, a odseparovaniu katalyzátora filtráciou možno katalyzátor podľa tohto vynálezu odseparovať takmer kvantitatívne triedením na site alebo filtráciou po tom, čo sa reakcia považuje za skončenú, alebo prípadne kontinuálnym spôsobom. Pri zvlášť výhodnom spôsobe uskutočnenia sa použijú častice katalyzátora s dobre definovaným rozsahom veľkosti častíc a druhá(é) tuhá(é) zložka(y) reakčnej zmesi má(jú) veľkosť častíc menšiu, než je spodná hranica rozsahu zdanlivej veľkosti častíc katalyzátora. Odseparovanie katalyzátora sa potom vykoná ponechaním suspenzie, ktorá tvorí reakčnú zmes, prejsť sitom alebo filtrom, ktoré zachytia častice katalyzátora a prepustia zvyšok zmesi. Toto možno vykonať buď dávkovým alebo kontinuálnym spôsobom.

Ako odborník bude vedieť, existuje niekoľko možností ovplyvniť veľkosť a tvar častíc, ktoré sa majú odseparovať od katalyzátora. Napríklad, ak sú časticami kryštály, čo bude najčastejší prípad, prudké miešanie reakčnej zmesi počas ich tvorby bude viesť k vytváraniu menších kryštálov než mierne miešanie. Inými parametrami, ktoré ovplyvňujú rast kryštálov, sú: výber rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel, teplota, teplotný gradient, pH hodnota reakčnej zmesi, nukleácia a zrenie kryštálov v rozpúšťadle. Parametre, ktoré ovplyvňujú rast kryštálóv, nemajú žiadny vplyv, ^lebo majú len veľmi malý vplyv na veľkosť častíc katalyzátora, ktorú možno považovať počas reakcie za konštantnú. Priemyselné procesy obyčajne prebiehajú za dobre definovaných podmienok, a preto poskytujú produkty s dobre definovanými vlastnosťami, vrátane napr. veľkosti častíc kryštálov. Preto pri praktickom použití spôsobu podľa tohto vynálezu sa v niektorých prípadoch môže ukázať, že pri použití katalyzátora s vhodným rozsahom veľkosti častíc bude nevyhnutné upraviť veľkosť častíc zložky(iek), ktorá(é) sa má(jú) odseparovať od kata lyzátora.

Separáciu tuhých zložiek možno uľahčiť, ak filtračná * doska alebo sito počas separácie vibruje, alebo ak sa suspenzia na filtračnej doske mieša. Po odseparovaní katalyzátora možno zvyšok reakčnej zmesi prefiltrovať na filtri, ktorý zachytí zvyšnú(é) tuhú(é) zložku(y). Relatívne množstvá požadovaného produktu, ktoré zostanú vo filtračnom koláči a vo filtráte, závisia od rozpustnosti požadovaného produktu v reakčnom médiu. Filtrát a filtračný koláč možno spracovať oddelene, pričom niektoré zložky môžu prípadne recirkulovať v procese spolu s katalyzátorom.

Teda z najširšieho hľadiska sa tento vynález týka spôsobu odseparovania časticového tuhého katalyzátora od reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú časticovú tuhú zložku a kvapalinu, tým, že sa jedna z časticových tuhých zložiek použije s takou zdanlivou veľkosťou častíc, ktorá je mimo rozsahu zdanlivej veľkosti častíc druhej(ých) tuhej(ých) zložky(iek), načo sa reakčná zmes filtruje alebo odstred'uje použijúc zariadenie, ktoré zachytí zložku (y) s väčšími časticami a zvyšok zmesi nechá prejsť.

V prvom výhodnom uskutočnení vynálezu má(jú) tuhá(é) zložka(y), ktorá(é) sa má(jú) odseparovať od katalyzátora, zdanlivú veľkosť častíc menšiu, než je spodná hranica rozsahu zdanlivej veľkosti častíc katalyzátora.

v ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je pomer medzi zdanlivým priemerom väčších častíc a zdanlivým priemerom menších častíc, ktoré sa majú odseparovať, najmenej 2.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je zdanlivý priemer častíc katalyzátora v rozsahu od 25 do 10,000 m, s výhodou od 50 do 750 m, výhodnejšie od 50 do 300 m.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná proteáza.

v ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná metaloproteáza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná serínová proteáza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný termolyzín.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná amidáza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná esteráza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná acyláza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým, ktorý je schopný deacylovať 6-aminoskupinu penicilínu G.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým, ktorý je schopný deacylovaú 6-aminoskupinu ampicilínu.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je imobilizovaným enzýmom penicilín-G-acyláza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je imobilizovaným enzýmom ampicilínhydroláza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný preparát celistvých buniek.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný preparát bunkového homogenátu.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu sa tuhý produkt, tvoriaci sa v procese, v ktorom je(sú) východiskový(é) materiál(y) celkom rozpustený(é) v reakčnej zmesi, separuje kontinuálne od katalyzátora počas reakcie vedením filtrátu z filtra, ktorý zachytáva len katalyzátor, k filtru, ktorý zachytáva syntetizovaný tuhý produkt, a recirkuláciou filtrátu z tohto filtra ku katalyzátoru.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyseli5 nou, zodpovedajúcou bočŕiému reťazcu, alebo derivátom tejto kyseliny, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 6-aminoskupiny v kyseline

6-aminopenicilánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-aminocefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-7-metoxycefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3-metoxy-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-aminodezacetoxycefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 3-chlór-7-amino-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3-(1,2,3-triazol-4(5)-yltiometyl)-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3- [2- (5-metyl-i,3,4-tiadiazolyl)tiometyl] -3-cefem-4-karboxylovej , od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-fenylglycínom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-fenylglycínamidom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylestérom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra propylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra izopropylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-4-hydroxyfenylglycínom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvýš7 ku reakčnej zmesi. '

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-4-hydroxyfenylglycínamidom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra propylestérom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra izopropylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyselinou 2-tiofénoctovou ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra amidom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi. *

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylesterom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyselinou 3-tiofénmalónovou ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom kyseliny 3-tiofénmalónovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie metylesteru L-fenylalanínu derivátom kyseliny L-aspartovej, v ktorej je chránená aminoskupina, od zvyšku reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie metylesteru D,L-fenylalanínu derivátom kyseliny L-aspartovej, v ktorej je chránená aminoskupina, od zvyšku reakčnej zmesi.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu hydrolýzy amidu alebo esteru aminokarboxylovej kyseliny, aby vznikla príslušná voľná kyselina alebo jej soľ, od zvyšku reakčnej zmesi, keď sa hydrolýza uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu konverzie kyseliny fumarovej alebo jej soli na kyselinu jablčnú alebo jej soľ, od získaného tuhého produktu, keď sa reakcia uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.

Podrobný popíš vynálezu

Spôsob separácie podľa tohto vynálezu je zvlášť užitočný, keď sa má odseparovať heterogénny katalyzátor, napr. tuhý časticový imobilizovaný enzým, od reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú časticovú tuhú zložku. Touto inou časticovou tuhou zložkou môže byť buď produkt, syntetizovaný pod vplyvom katalyzátora, alebo to môže byt nezreagovaný východiskový materiál, napr. východiskový materiál pridaný v prebytku. V tomto popise bude slovo produkt znamenať, ak nebude špecifikované ináč, buď požadovaný produkt alebo vedľajší produkt, ktorý je výsledkom reakcie.

Ak je katalyzátor jedinou tuhou zložkou, prítomnou v reakčnej zmesi na začiatku reakcie a tento produkt je málo rozpustný v kvapalnej časti reakčnej zmesi, katalyzátor možno odseparovať od reakčnej zmesi tak, že častice tuhého produktu budú mať zdanlivú veľkosť častíc mimo rozsahu zdanlivej veľkosti častíc častíc tuhého katalyzátora, načo sa reakčná zmes filtruje alebo odstreďuje s použitím filtra alebo centrifúgy, ktoré zachytia zložku s väčšími časticami a nechajú prejsť zvyšok reakčnej zmesi. V ďalšom budeme označovať kvapalnú časť reakčnej zmesi ako reakčnú kvapalinu alebo jednoducho kvapalinu. Reakčná kvapalina teda obsahuje rozpúšťadlo (alebo zmes rozpúšťadiel), v ktorom sa reakcia uskutočňuje a rozpustenú časť východiskových materiálov a produktov, či už to budú tuhé látky alebo kvapaliny. Ak sa vyrába tuhý produkt v procese, pri ktorom sú východiskové materiály úplne rozpustené a častice produktu sú menšie než častice katalyzátora, odseparovanie katalyzátora od zvyšku reakčnej zmesi možno vykonať kontinuálnym spôsobom zavádzaním filtrátu z filtra, ktorý zachytáva len katalyzátor, k filtru, ktorý zachytáva syntetizovaný tuhý produkt, a recirkuláciou filtrátu z tohto filtra ku katalyzátoru. Týmto spôsobom sa rovnováha reakcie posúva smerom k vyššiemu výťažku.

Jeden alebo viac východiskových materiálov môžu byt ob10 medzene rozpustné v rozpúšťadle, v ktorom prebieha reakcia.

V tomto prípade môže(u) byť východiskový(é) materiál(y) prítomný(é) v reakčnej zmesi v tuhej forme a reakčná kvapalina sa nasýti s ohľadom na príslušnú(é) zložku(y). Ak je produkt reakcie rozpustný v reakčnej kvapaline neobmedzene, problémom, ktorý treba riešiť týmto vynálezom počas ďalšieho spracovania, je odseparovanie katalyzátora od reakčnej kvapaliny, ktorá obsahuje tuhú látku, nezreagovaný východiskový materiál. Ak je produkt tiež obmedzene rozpustný v reakčnej kvapaline, produkt a nezreagovaný východiskový materiál sa musia od seba odseparovať po odseparovaní katalyzátora od zvyšku reakčnej zmesi.

Skutočný rozmer častíc, ako sú kryštály, možno stanoviť napr. s použitím mikroskopu, vybaveného vhodným meradlom. Častice sa vyskytujú v mnohých rôznych tvaroch. Kryštály môžu byť napr. ihličkové, platničkové alebo kubické. V tomto kontexte nie je dôležitým znakom skutočný rozmer častíc, ale skôr zdanlivý rozmer, označovaný napr. ako zdanlivý priemer.

V tomto popise sa používa označenie zdanlivý rozmer alebo zdanlivý priemer, aby odrážalo chovanie častice na site alebo filtri. Teda zdanlivý priemer častice zodpovedá priemeru otvoru alebo póru, ktorý pri praktickom použití práve dovolí, aby častica cezeň prešla. Pri výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa používa tak malá veľkosť častíc katalyzátora, ako to len spôsob separácie dovoľuje. To pomáha zaistiť vysokú aktivitu katalyzátora a pomáha eliminovať problémy s difúziou.

Je dobre známe, že mnohé procesy, ktoré sa uskutočňujú pod vplyvom katalyzátora, sú veľmi špecifické a že prebiehajú s vysokým výťažkom, najmä, ak je katalyzátorom enzým. Jednou z výhod tohto spôsobu je, že katalyzátor možno opätovne použiť. Vďaka veľmi miernym podmienkam, použitým pri separácii katalyzátora zo zvyšku reakčnej zmesi, je obyčajne strata katalytickej aktivity veľmi malá. Príspevok k vysokému výkonu prináša skutočnosť, že tento spôsob je veľmi vhodný na použitie pri reakciách prebiehajúcich s takými veľkými množstvami východiskového materiálu na jednotkový objem reakčnej zmesi, že jeho časť môže byť pôvodne v tuhej forme.

Tuhý katalyzátor, ktorý sa má použiť podľa tohto vynálezu, sa môže vyskytovať vo forme časticového preparátu imo11 bilizovaného enzýmu,'a môže mať hustotu vyššiu, alebo nižšiu, než je hustota reakčnej kvapaliny. V tomto preparáte môže byť enzým adsorbovaný, absorbovaný, kovalentne viazaný, uzavretý alebo viazaný iónovými silami. Spôsoby imobilizácie enzýmov sú známe v doterajšom stave techniky. Doterajší stav techniky tiež poskytuje spôsoby prípravy častíc, ktoré majú byť nosičmi imobilizovaných katalyzátorov, napr. enzýmov, a spôsoby izolácie rôznych frakcií časticových tuhých látok podľa ich distribúcie veľkosti častíc. Špecifický katalyzátor, ktorý sa má použiť, závisí v každom prípade od procesu, ktorý má prebiehať.

Proces podľa tohto vynálezu vo všeobecnosti prebieha vo vode. Možno tiež pridať organické rozpúšťadlá. Organické rozpúšťadlá sa s výhodou vyberú z rozpúšťadiel miešateľných s vodou, ako sú metanol, etanol, l-propanol, 2-propanol, l-butanol, 1,4-butándiol, acetón, acetonitril, Ν,Ν-dimetylformamid a dimetylsulfoxid.

Ako bolo uvedené vyššie, teplota je jedným z parametrov, ktoré ovplyvňujú veľkosť častíc, keď sa tvorí tuhý produkt. Príčinou môže byť to, že rýchlosť rastu kryštálov závisí od teploty, alebo v niektorých prípadoch to, že pri rôznych teplotách vznikajú rôzne kryštalografické modifikácie. Bod tuhnutia reakčnej kvapaliny tvorí absolútnu spodnú teplotnú hranicu pre uskutočnenie spôsobu podľa tohto vynálezu. Ak je použitým katalyzátorom imobilizovaný enzým, absolútna horná teplotná hranica bude obyčajne závisieť od enzýmu .

Príkladmi špecifických oblastí, v ktorých tento vynález vedie k podstatným zlepšeniam, sú: l) príprava semisyntetických penicilínov a cefalosporínov, 2) hydrolýza amidov a esterov a 3) syntéza peptidov.

Príkladmi -laktámových antibiotík (penicilínov a cefalosporínov) , ktoré možno s výhodou pripraviť s použitím spôsobu podľa tohto vynálezu, sú ampicilín, amoxicilín, tikarcilín, cefaclor, cefatrizín, cefaparol, cefalexín, cefadroxil, cefaloglycín a cefalotín.

V súčasnosti sa semisyntetické -laktámy priemyselne pripravujú chemickými metódami. Napríklad penicilíny sa pripravujú reakciou 6-APA, obyčajne s chránenou karboxylovou skupinou, s aktivovaným derivátom bočného reťazca s násled12 ným odstránením chrániacich skupín hydrolýzou.. Napríklad ampicilín možno pripraviť reakciou 6-APA, s vhodne chránenou skupinou karboxylovej kyseliny, s D-fenylglycylchloridom s následným hydrolytickým odstránením skupiny, ktorá chráni skupinu karboxylovej kyseliny. Tieto reakcie obyčajne zahrnujú nákladné kroky, ako je použitie teplôt pod 0 C (v niektorých prípadoch dokonca pod -25 C), silylačné reagenty a organické rozpúšťadlá, ako je metylénchlorid, s ktorými treba zaobchádzať opatrne, pretože sú škodlivé zdraviu a životnému prostrediu.

Enzymatická výroba semisyntetických -laktámových antibiotík acyláciou -laktámového jadra derivátom (ako je nižší alkylester) D-fenylglycínu alebo D-4-hydroxyfenylglycínu je známa napr. z DE patentovej prihlášky č. 2,163,792, AT patentu £. 243,986, NL patentovej prihlášky č. 70-09138, DE patentovej prihlášky č. 2,621,618 a EP zverejnenej patentovej prihlášky č. 339,751. Spôsoby, popísané v doterajšom stave techniky, sa obyčajne uskutočňovali pri koncentráciách nižších než 300 mM derivátu D-fenylglycínu a nižších než 25 mM -laktámového jadra.

Táto značne nízka koncentrácia východiskových materiálov je potenciálnou nevýhodou týchto známych spôsobov enzymatickej výroby semisyntetických -laktámových antibiotík (žiadny sa doteraz nepoužil v priemyselnom meradle), pretože sťažuje, a teda zdražuje, izoláciu vytvorených -laktámových antibiotík. Naviac, publikované výťažky sú malé, obyčajne pod 85 %, a vyžaduje sa spôsob recyklovania nezreagovaného -laktámového jadra, čo vedie k viacerým a drahým jednotkovým operáciám.

Jedným z problémov, ktoré vznikajú zvýšením koncentrácie východiskových materiálov pri enzymatickej syntéze semisyntetických -laktámových antibiotík, je to, že rozpustnosť niektorých zo zúčastnených východiskových materiálov a z produktov, vytvorených počas reakcie, je značne nízka. Preto, aby sa proces uskutočňoval za ekonomicky výhodnejších podmienok, môže byť nevyhnutným mať na začiatku reakcie tak veľa východiskového materiálu, že sa nemôže úplne rozpustiť v reakčnej kvapaline. Taktiež vytvorený produkt sa môže oddeľovať v tuhej forme, pretože veľké vyrobené množstvo na jednotku objemu sa nemusí úplne rozpustiť v reakčnej kvapa13 line. Tak vzniká potreba odseparovať katalyzátor z reakčnej zmesi, ktorá obsahuje tuhé produkty a/alebo nezreagované východiskové materiály, predtým, než sa zvyšok reakčnej zmesi ďalej spracuje, pretože spracovanie môže zahrnovať podmienky, ktoré poškodzujú enzýmovú aktivitu, napr. je to rozpustenie produktov a nezreagovaných východiskových materiálov pri nízkej pH-hodnote (napr. pri pH 0.5 - 2.0).

Acylačným činidlom, použitým na zavedenie bočného reťazca do -laktámového antibiotického jadra, t.j. na zavedenie acylovej skupiny do 6-aminoskupiny penicilínov alebo do 7-aminoskupiny cefalosporínov, môže byť zodpovedajúca kyselina alebo jej derivát, napr. nižší alkyl(metyl, etyl, propyl alebo izopropyl)ester, alebo jej primárny, sekundárny alebo terciárny amid. Výhodné sú metylester, etylester a amid. Derivát možno použiť vo voľnej forme alebo vo forme soli, napr. soli HCI alebo soli H2SO4.

Enzýmom, ktorý sa má použiť, môže byť ľubovoľný enzým, ktorý katalyzuje príslušnú reakciu. Také enzýmy sa obyčajne nazývajú penicilínovými amidázami, penicilínovými acylázami alebo ampicilínovými hydrolázami. Mnohé mikrobiálne enzýmy, o ktorých je známe, že majú túto aktivitu, sa získavajú napríklad z baktérií rodu Acetobacter. Xanthomonas. Mycoplana. Protaminobacter. Aeromonas (DE patentová prihláška č. 2,163,792), Pseudomonas (AT patent č. 243,986), Flavobacterium (NL patentová prihláška č. 70-09138), Aphanocladium. Cephalosporium (DE patentová prihláška č. 2,621,618), Acetobacter pasteurianus (DE patentová prihláška č. 2,163,792 A), Acetobacter turbidans (Takahashi a spol., Biochem.j. 137 (1974), 497 - 503), Pseudomonas melanooenum (Kim & Byun, Biochim.Biophys.Acta 1040 (1990), 12 - 18), Xanthomonas citrii (EP zverejnená patentová prihláška č. 339,751), Kluwera citrophila (Okachi a spol., Agr.Biol.Chem. 37 (1973), 2797 - 2804), Eschericia coli (DE patentová prihláška č. 2930794) a Bacillus meqaterium (Chiang & Bennett, J.Bacteriol. SI (1967), 302).

Po odseparovaní od zvyšku reakčnej zmesi možno katalyzátor opäť použiť, prípadne po premytí. Produkty a prípadne nezreagovaný východiskový materiál možno odseparovať a spracovať oddelene, alebo recyklovať.

Príkladom peptidu, ktorý možno s výhodou pripraviť s použitím spôsobu podľa tohto vynálezu, je metylester N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu, ďalej označovaný ako ZAPM. ZAPM je kľúčovým intermediátom pri výrobe sladidla aspartámu. Pri výrobe aspartámu (metylesteru L- -aspartyl-L-fenylalanínu) jeden z kritických krokov zahrnuje enzýmom katalyzované viazanie derivátu kyseliny aspartovej s hydrochloridom metylesteru fenylalanínu (napr. väzbu kyseliny N-benzyloxykarbonyl-L-aspartovej s hydrochloridom metylesteru L-fenylalanínu), aby vznikol ZAPM. ZAPM tvorí velmi obmedzene rozpustnú adičnú zlúčeninu s metylesterom L-fenylalanínu (alebo .metylesterom D-fenylalanínu, ak je prítomný), a preto precipituje počas syntézy. Rovnováha reakcie je tým posunutá smerom ku kondenzácii.

Podľa doterajšieho stavu techniky možno použiť čiastočne vyčistený, rozpustný enzýmový preparát (napr. termolyzín) ako katalyzátor v kondenzačnom kroku. Aby sa odseparoval enzým od reakčného produktu, reakčný produkt sa rozpustí a enzým sa vyzráža pridaním organického rozpúšťadla (napríklad acetónu) a odstráni, napríklad filtráciou. Avšak od 14 % až do 60 % katalytickej aktivity enzýmu sa počas tohto procesu stratí (Nonaka a spol., US patent č. 4,212,945, a Meijer a spol. v Biocatalysis in Organic Syntheses (Editori: Tramper, van der Plaš a Linko), str. 135 - 156 (1985)). K najväčšej strate aktivity dochádza počas precipitácie a izolácie enzýmu.

Použitie spôsobu podľa tohto vynálezu s imobilizovaným preparátom termolyzínu vo vyššie uvedenom procese prípravy ZAPM zjednodušuje separačný krok a znižuje stratu aktivity enzýmu v separačnom kroku na asi 1 %.

Tento vynález bude ďalej demonštrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemožno chápať ako obmedzujúce pre rozsah ochrany. Znaky uvedené v predchádzajúcom popise a v nasledujúcich príkladoch a nárokoch môžu byť, či už osve alebo v ich ľubovoľnej kombinácii, podstatnými pre uskutočnenie vynálezu v jeho rôznych formách.

Príklad 1

Príprava katalyzátora, vhodného o,i. na syntézu -laktámov

Imobilizovaná penicilín-G-acyláza z E.coli (250 g, Eupergit^R-PcA, získaná od Rôhm Pharma) sa pretriedila cez

300 m a potom cez l'80 m sito prepláchnutím vodou. Materiál, zachytený na 180 m site, sa použil ako enzýmový katalyzátor v ďalej uvedených príkladoch 2-5. Pri teste 4-dimetylaminobenzaldehydovou metódou, ako ju popísali Balasingham a spol., Biochim. Biophys. Acta 276 (1972), 250 - 256, aktivita katalyzátora bola 115 penicilín-G-acylázových jednotiek (U) na g mokrého katalyzátora.

Prfolád 2

Enzvmatická syntéza ampicilínu

Metylester D-fenylglycínu (v ďalšom označovaný ako D-PGM) a kyselina 6-aminopenicilánová (v ďalšom označovaná ako 6-APA) sa suspendovali v 50 mM fosfátového pufra s pH hodnotou 6.0, pričom konečné koncentrácie D-PGM a 6-APA boli 450 mM a 100 mM. Teplota suspenzie sa nastavila na 35 C a pridalo sa 10.0 g mokrého imobilizovaného enzýmu (podľa príkladu 1), pričom celkový objem bol 100 ml. Reakcia sa nechala prebiehať za účinného miešania pri 35 C, pričom pH hodnota sa udržovala na 6.0 titráciou s 2 M H₂SO₄.

Po približne 0.5 hodine začal z reakčnej zmesi precipitovať D-fenylglycín (v ďalšom označovaný ako D-PG) a asi po 3 hodinách koncentrácia ampicilínu dosiahla maximum 77 mM, čo zodpovedá 85 %-nej konverzii 6-APA. V tomto momente sa obsah nádoby preniesol do filtračnej jednotky, ktorá mala ako dno sito s veľkosťou ôk 100 m a rotujúcu vrtuľu, umiestnenú tesne nad týmto sitom. Imobilizovaný enzým sa zachytil na site, zatiaľ čo zvyšná časť suspenzie ním prešla. Precipitát v tomto filtráte pozostával z kryštálov D-fenylglycínu, obsahujúcich trochu anpicilínu, a kvapalina obsahovala o.i. rozpustený produkt a nezreagované východiskové materiály. Vytvorené kryštály ampicilínu mali veľkosť častíc menšiu než 50 m. Filtrát (t.j. suspenzia s obsahom kryštálov a reakčnej kvapaliny) sa odstredil a čistý centrifugát sa použil na vymytie kryštálov, ktoré zostali na katalyzátore. Nastavením toku filtrátu zo separačnej jednotky a toku čistej kvapaliny nad usadeninou k separačnej jednotke sa katalyzátor udržoval v suspenzii po celú dobu počas separácie. Akonáhle nebolo vidieť v katalyzátorovej frakcii žiadne kryštály, nádoba sa úplne vyprázdnila, pričom na site zostal len katalyzátor.

Po separácii bólo vo filtráte 97 % ampiqilínu a 95 % D-PG, vytvorených počas syntézy. Ampicilín sa izoloval a ďalej čistil známymi postupmi.

Katalyzátor, zachytený v separačnej jednotke, sa premyl 50 mM fosfátovým pufrom (pH hodnota: 6.0) a jeho aktivita sa potom testovala podľa spôsobu, uvedeného v príklade 1. Ako je naznačené v tabuľke 1, po syntéze nedošlo k signifikantnej strate aktivity katalyzátora a katalyzátor bol teda vhodný na opätovné použitie.

Tabuľka 1

	Množstvo katalyzátora, g	Aktivita, U/g
Pred použitím	10.00	115.0
Po jednom použití	9.85	114.5

HPLC analýza reakčných zložiek

Stĺpec RP LC-18, (250 x 4.6 mm; 5 m)

Eluent A 25 mM fosfátový pufer, pH hodnota 6.5

Eluent B acetonitril.

Vypieranie sa uskutočnilo so zmesami eluentov A a B podľa tabuľky 2.

Tabuľka 2

Čas, minúty	% A
0 -> 10	99 -> 80
10 -> 20	80
20 -> 21	80 -> 99
21 -> 35	99

Prietok : 1 ml/min.

UV detekcia pri 215 nm

Doba zadržania v minútach : D-PG : 4.1, 6-APA : 8.1, ampicilín : 13.9, D-PGM : 18.

Príklad 3

Enzvmatická syntéza fcefalexínu

Metylester D-fenylglycínu, HCl-soľ, (1.6526 g) a kyselina 7-aminodezacetoxycefalosporánová (7-ADCA) (0.4278 g) sa rozpustili v 50 mM fosfátového pufra (pH hodnota: 6.5) a temperovali sa na 35 C. Pridal sa enzýmový katalyzátor podľa príkladu 1 (2 g) a objem reakčnej zmesi sa doplnil do 20 ml pufrom. Reakcia sa ponechala prebiehať za účinného miešania, pričom sa pH hodnota a teplota udržovali konštantnými .

Približne 45 minút po pridaní enzýmového katalyzátora sa vytvoril precipitát a po ďalších 20 minútach sa miešanie zastavilo a obsah reakčnej nádoby sa preniesol do filtračnej jednotky, popísanej v príklade 2, a katalyzátor sa odseparoval od vytvoreného precipitátu a reakčnej kvapaliny. Z precipitátu a reakčnej kvapaliny, ktoré obsahovali o.i. cefalexín, D-fenylglycín, metylester D-fenylglycínu a kyselinu 7-aminodezacetoxycefalosporánovú, sa izoloval cefalexín a vyčistil sa známymi postupmi.

Po separačnom kroku sa u katalyzátora zachovalo viac než 99 % katalytickej aktivity a katalyzátor bol teda vhodný na opätovné použitie. Pred opätovným použitím katalyzátora je možné vložiť premývací krok.

Reakcia sa sledovala pomocou HPLC za tých istých podmienok, aké boli popísané v príklade 2. Zistili sa doby zadržania pre 7-ADCA 6.3 min. a pre cefalexín 13.4 min.

Príklad 4

Enzvmatická syntéza amoxicilinu

Pripravila sa suspenzia D-4-hydroxyfenylglycínamidu (44.9 g, v ďalšom označovaný ako HPGA) a 6-APA (14 .30 g) v 50 mM fosfátovom pufri (pH hodnota: 6.5) a temperovala sa pri 25 C v reakčnej nádobe, vybavenej sitom s veľkosťou ôk 100 m ako spodkom nádoby, a rotujúcou vrtuľou, umiestnenou bezprostredne nad sitom. Reakcia sa odštartovala pridaním 40 g katalyzátora (podľa príkladu 1) (konečný objem: 400 ml) a pH hodnota sa udržovala počas reakcie konštantnou titráciou 2 M H₂SO₄. Objem pod sitom bol menej než 15 ml a pomocou čerpadla sa filtrát (obsahujúci reakčnú kvapalinu, kryštály východiskových materiálov a produktov) kontinuálne vracal do vrchnej časti reakčnej nádoby počas celého procesu.

Po 10 hodinách 'koncentrácia amoxicilínu dosiahla maximum, zodpovedajúce 85 %-nej konverzii a reakčná zmes obsahovala o.i. kryštály amoxicilínu, D-4-hydroxyfenylglycín (v ďalšom označovaný ako HPG) a nezreagovanú HPGA. Recirkulácia filtrátu do reakčnej nádoby sa zastavila a namiesto toho sa filtrát zaviedol do centrifúgy. Tak, ako bolo popísané v predchádzajúcich dvoch príkladoch, sa čistá kvapalina nad usadeninou použila na vymytie posledných kryštálov z katalyzátora.

Z filtrátu sa získalo 95 % vyrobeného amoxicilínu a 98 % HPG. Amoxicilín sa ďalej čistil postupmi, známymi z doterajšieho stavu techniky.

Katalyzátor bol vhodný na opätovné použitie, pretože sa zachovalo viac než 99 % jeho katalytickej aktivity.

Reakcia sa sledovala tým istým HPLC systémom, ako bol popísaný v príklade 2, s výnimkou toho, že sa na izokratickú elúciu (1 ml/min.) zlúčenín použilo 5 % acetonitrilu v 95 % 25 mM fosfátového pufra (pH hodnota: 6.0). Tieto podmienky poskytli pre relevantné zlúčeniny nasledujúce doby zadržania (v minútach): D-4-hydroxyfenylglycín: 2.5, D-HPGA: 3.3, 6-APA: 6.0 a amoxicilín: 15.0.

Príklad 5

Enzvmatická hvdrolýza D-4-hydroxyfenvlqlycinamidu (HPGA)

K zmesi HPGA (8.35 g) vo vode, nastavenej na pH hodnotu 6.0, sa pridal mokrý katalyzátor (2.25 g, podľa príkladu 1), pričom sa celkový objem doplnil do 100 ml. Hydrolýza sa nechala prebiehať pri 35 C za udržovania konštantnej pH hodnoty 6.0 titráciou 2 M kyselinou sírovou, pričom sa účinne miešalo.

Po 3 hodinách bola HPGA úplne hydrolyzovaná na voľnú kyselinu, HPG. Kvôli katalyzátoru a obsahu čiastočne precipitovanému HPG vznikla reakčná zmes ako suspenzia.

Obsah reakčnej nádoby sa preniesol do separačnej jednotky a katalyzátor sa odseparoval od reakčnej zmesi, ako bolo popísané v príklade 2. Filtrát z tejto separácie obsahoval precipitovaný HPG a kvapalinu nad usadeninou, ktorá obsahovala o.i. soli a rozpustený HPG. Celkove sa vo filtráte zistilo 96 % vytvoreného HPG. HPG sa ďalej čistil známymi postupmi.

Katalyzátor v réakčnej nádobe sa premyl 50 mM fosfátovým pufrom (pH hodnota: 6.0) a opätovne sa použil bez signifikantnej straty katalytickej aktivity (počas syntézy a následnej separácie sa stratilo menej než 1 % celkovej aktivity) .

Na monitorovanie reakcie sa použila HPLC metóda, popísaná v príklade 4.

Príklad 6

Príprava termolvzínového katalyzátora

Termolyzín (8 g, Sigma P-1512) sa rozpustil v 25 mM fosfátovom pufri (pH hodnota: 7) na približne 50 mg proteínu na ml a približne 3750 U (pozri ďalej) na ml. Bunky z E.coli fermentácie (napr. Gebauer A. a spol., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55 - 58) sa zozbierali (pribi. 40 g suchej látky) a zahrievali sa na 100 C 10 minút, aby sa inaktivovala väčšia časť enzýmovej aktivity v bunkách. Termolyzín sa pridal k bunkám, ktoré boli imobilizované, ako to popísal Wúmpelmann, M. a spol., US patent č. 4,892,825 (Novo Industri A/S). Materiál, nesúci imobilizované bunky, sa extrúdoval a vysušil na obsah vody približne 10 %. Výsledné častice sa pomleli a pomletý materiál sa preosial. Frakcia s veľkosťou častíc 75 - 150 m sa použila ako katalyzátor v syntéze metylesteru N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu. Aktivita katalyzátora bola približne 3000 U na g. Aktivita sa merala metódou vyluhovania kazeínu (1 jednotka (U) zhydrolyzuje kazeín, aby vytvoril farebný ekvivalent 1.0 mólu tyrozínu za minútu pri pH hodnote 7.5 pri 35 C (farba činidlom Folin-Ciocalteu)) .

Syntéza_metylesteru N-benzyloxykarbonyl-L-aspartvl-L-fenvlalanínu

Kyselina N-benzyloxykarbonyl-L-aspartová (0.1 mólu) a hydrochlorid metylesteru L-fenylalanínu (0.25 mólu) sa rozpustili vo vode a nastavili na pH hodnotu 6.5 a konečný objem 350 ml. Roztok sa temperoval pri 40 C a pridal sa katalyzátor, pripravený, ako bolo popísané vyššie (15 g). Katalyzátor pred použitím napúčiaval vo vode, čím sa veľkosť častíc zväčšila na asi 150 - 400 m. Reakcia sa nechala prebiehať pri 40 C, pričom sa za miešania udržiavala konštánt20 ná hodnota pH 6.5. Kondenzačný produkt, metylester N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu (ZAPM), tvorí adičnú zlúčeninu s nezreagovaným metylesterom L-fenylalanínu, ktorá je veľmi slabo rozpustná vo vode. V dôsledku toho produkt precipitoval takmer kvantitatívne, ako sa postupne tvorila táto adičná zlúčenina. Po 20 hodinách sa reakčná zmes ochladila na približne 5 C a preniesla sa do separačnej jednotky, popísanej v príklade 2. Katalyzátor sa odseparoval od produktu a reakčnej kvapaliny, ako je popísané v príklade 2. Katalyzátor v reakčnej nádobe možno opätovne použiť, pretože po separačnom kroku sa zachovalo viac než 99 % celkovej katalytickej aktivity. ZAPM možno ďalej spracovať na aspartám spôsobmi, známymi ako takými (odstránením N-chrániacej skupiny aspartovej časti, kryštalizáciou, atď.) . Ma sledovanie tvorby ZAPM sa použila HPLC metóda Oyamu a spol., J.C.S. Perkin II (1981), 356.

Príklad 7

Enzvmatická syntéza cefalexínu v prítomnosti 2-naftolu s použitím imobilizovaného enzýmu, ktorý možno recyklovať

E. coli s penicilín-G-acylázovou aktivitou sa fermentovala podľa Gebauera A. a spol., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55 - 58. Imobilizácia sa vykonala podľa Wumpelmanna M. a spol, US patent č. 4,892,825 (Novo Industri A/S). Látka obsahujúca imobilizovaný enzým sa extrúdovala a vysušila až do zvyškového obsahu vody približne 10 % hmotnostných. Vysušený materiál sa pomlel a frakcia s distribúciou veľkosti častíc 100 - 200 m sa z pomletého produktu získala použitím príslušných sít. V tejto frakcii sa zistila enzýmová aktivita približne 200 penicilín-G-acylázových jednotiek/g. Po napučaní vo vode bola distribúcia veľkosti častíc približne 200 - 500 m.

pH hodnota zmesi (suspenzie) D-PGA.1/2H₂SO₄ (74.7 g, 0.375 mol), 7-ADCA (21.4 g, 0.10 mol) a 2-naftolu (10.8 g, 0.075 mol, veľkosť častíc < 100 m) v približne 300 ml vody sa nastavila na 6.7 pridaním 4 M hydroxidu amónneho. Pridala sa voda do 400 ml a následne imobilizovaná E. coli penicilín-G-acyláza, pripravená, ako bolo popísané vyššie (50 g na suchej báze, suspendované vo vode do celkových 100 ml) a zmes sa miešala pri 25 C.

Po 3 hodinách Sa reakčná zmes vyliala na sito s otvormi 100 m, ktoré zachytilo častice nesúce enzým, zatiaľ čo zvyšná časť reakčnej zmesi, stále ešte suspenzia, cezeň prešla. Suspenzia, prechádzajúca cez sito, sa filtrovala na sintrovanom sklenenom filtri, ktorý zachytil tuhý materiál a časť kryštalizačného lúhu sa použila na premytie tuhého materiálu, ktorý zostal na 100 m site, aby sa enzýmové častice uvoľnili od všetkej priľnutej jemnej suspenzie, obsahujúcej syntetizovaný produkt. Aj výplach sa filtroval cez sintrovaný sklenený filter. Produkt, pozberaný na sklenenom filtri, sa premyl butylacetátom a suspendoval v zmesi vody (150 ml) a butylacetátu (150 ml). pH hodnota vodnej fázy sa nastavila na 1.5 pridaním 3 M kyseliny sírovej a miešanie pokračovalo 10 minút. Vodná fáza sa potom odseparovala od butylacetátovej fázy a premyla ďalším butylacetátom (2 x 20 ml). Objem vodnej fázy sa zmenšil na 75 ml odparovaním, pridal sa 2-propanol (75 ml) a pH hodnota sa nastavila na 4.7 pridaním 4 M hydroxidu amónneho. Získaná suspenzia sa ochladila na 5 C na 15 minút, načo sa tuhý materiál pozberal na sintrovanom sklenenom filtri a premyl sa vodou/2-propanolom (1:1, 25 ml) . Po sušení vo vákuovej peci pri 30 C počas 12 hodín sa získalo 33.6 g (92.4 % teoretického výťažku) monohydrátu cefalexínu vo forme bieleho prášku (čistota pomocou HPLC: 99.9 %).

Po použití sa enzýmové častice, ktoré zostali na 100 m site, premyli vodou (3 x 100 ml), vypustili a napokon vysušili do obsahu vody približne 10 %. Hmotnosť bola približne 50 g, a zistila sa enzýmová aktivita približne 200 penicilín-G-acylázových jednotiek/g, čo znamená, že nedošlo prakticky k žiadnej strate aktivity. Teda imobilizovaný enzým bol vhodný na recyklovanie, napr. v procese, aký bol popísaný vyššie.

Claims (13)

1. Spôsob separácie Časticového tuhého katalyzátora z reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje inú časticovú tuhú zložku a kvapalinu, vyznačujúci sa tým, že jedna z časticových tuhých zložiek bude mať zdanlivú veľkosť častíc, ktorá je mimo rozsahu zdanlivej veľkosti častíc druhej(ých) tuhej(ých) zložky(iek), načo sa reakčná zmes filtruje alebo odstreďuje s použitím zariadenia, ktoré zachytí zložku(y) s väčšími časticami a nechá prejsť zvyšok zmesi.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tuhá(é) zložka(y), ktorá(é) sa má(jú) odseparovať od katalyzátora, má(jú) zdanlivú veľkosť častíc menšiu, než je spodná hranica rozsahu zdanlivej veľkosti častíc katalyzátora.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že pomer medzi zdanlivým priemerom väčších častíc a zdanlivým priemerom menších častíc je najmenej 2.

4. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že zdanlivý priemer častíc katalyzátora je v oblasti od 25 do 10,OOOetum, s výhodou od 50 do 750 «u^m, výhodnejšie od 50 do 300du,m.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov l až 4, vyznačujúci sa tým, že tuhým katalyzátorom je imobilizovaný enzým.

6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že imobilizovaným enzýmom je proteáza, metaloproteáza, serínová proteáza, termolyzín, amidáza, esteráza alebo acyláza.

7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že imobilizovaný enzým je schopný deacylovať 6-aminoskupinu penicilínu G alebo 6-aminoskupinu ampicilínu. ^{8 * *}

8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov l až 4, vyznačujúci sa tým, že tuhým katalyzátorom je imobilizovaný preparát celistvých buniek alebo bunkového homogenátu.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z čujúci sa tým, že tuhý produkt, v ktorom je(sú) východiskový(é) rozpustený(é) v reakčnej zmesi, sa separuje od katalyzátora kontinuálne počas reakcie vedením filtrátu z filtra, ktorý zachytáva len katalyzátor, k filtru, ktorý zachytáva syntetizovaný tuhý produkt, a recirkuláciou filtrátu z tohto filtra ku katalyzátoru.

nárokov 2 až 8, vyznátvoriaci sa v procese, materiál(y) celkom

10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov separácie imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie kyseliny 6-aminopenicilánovej, kyseliny 7-aminocefalosporánovej, kyseliny 7-amino-7-metoxycefalosporánovej , kyseliny 7-amino-3-metoxy-3-cefem-4-karboxylovej, kyseliny 7-aminodezacetoxycefalosporánovej, kyseliny 3-chlór-7-amino-3-cefem-4-karboxylovej, kyseliny 7-amino-3-(1,2,3-triazol-4(5)-yltiometyl)-3-cefem-4-karboxylovej alebo kyseliny 7-amino-3-[2-(5-metyl-l,3,4-tiadiazolyl)tiometyl]-3-cefem-4-karboxylovej D-fenylglyc£nom, D-4-hydroxyfenylglycínom, kyselinou 2-tiofénoctovou alebo kyselinou 3-tiofénmalónovou alebo amidom, metylesterom, etylesterom, propylesterom alebo izopropylesterom D-fenylglycínu, D-4-hydroxyfenylglycínu, kyseliny 2-tiofénoctovej alebo kyseliny 3-tiofénmalónovej od zvyšku reakčnej zmesi, ak je v reakčnej zmesi prítomný tuhý materiál, iný než katalyzátor, keď sa začne spracovanie.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6 a 8 až 9 na separáciu imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie metylesteru L-fenylalanínu alebo metylesteru D,L-fenylalanínu N-chránenou kyselinou L-aspartovou, od získaného tuhého produktu acylácie, ak sa reakcia uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.

12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov i až 9 na separáciu imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu hydrolýzy amidu alebo estéru aminokarboxylovej kyseliny, aby sa získala zodpovedajúca voľná kyselina alebo jej soľ, od získaného tuhého produktu, keď sa reakcia uskutočňuje za takých podmienok, že vytvoréný produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.

13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov l až 6 a 8 až 9 na separáciu imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu konverzie kyseliny fumarovej alebo jej soli na kyselinu jablčnú alebo jej soľ, od získaného tuhého produktu, keď sa reakcia uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.