SK134294A3

SK134294A3 - Method of separation of particle solid catalyst

Info

Publication number: SK134294A3
Application number: SK1342-94A
Authority: SK
Inventors: Svend G Kaasgaard; Camilla H Ulrich; Kim Clausen; Thomas L Jensen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1992-05-14
Filing date: 1993-05-13
Publication date: 1995-07-11
Also published as: JPH07507959A; CN1081929A; BR9306349A; EP0640014A1; AU4061393A; WO1993023164A1; MX9302724A; DK64192D0; TW304886B

Abstract

The present invention relates to a method of separating a particulate solid catalyst from a chemical reaction mixture which further comprises at least one other solid component, either during the reaction or after the reaction.

Description

Spôsob separácie »Separation method »

Oblasť technikyTechnical field

Tento vynález sa týka spôsobu separácie časticového tuhého katalyzátora z chemickej reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú tuhú zložku, a to buď počas reakcie alebo po reakcii.The present invention relates to a process for separating a particulate solid catalyst from a chemical reaction mixture further comprising at least one other solid component, either during or after the reaction.

DoterajSí stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Separácia precipitátu z kvapaliny je dobre známy proces, ktorý možno vykonať dekantáciou, filtráciou alebo odstreďovaním. Avšak, ak reakčná zmes obsahuje dve alebo viac rôznych tuhých zložiek, neexistuje žiadny univerzálny spôsob odseparovania tuhých zložiek od seba. Filtrácia s následnou mechanickou separáciou tuhých zložiek triedením častíc neprichádza do úvahy z praktických dôvodov, v niektorých prípadoch možno tuhé zložky odseparovať od seba mechanickými postupmi, ako je flotácia. Inými spôsobmi sú fyzikálnochemické spôsoby, ako je extrakcia alebo delenie, ktoré využívajú rozdiel v rozpustnosti zložiek, napr. vo vode, vo vodnom roztoku kyseliny, zásady alebo v organických rozpúšťadlách. Predpokladom použiteľnosti týchto spôsobov je to, aby sa dali nájsť podmienky, za ktorých sú zložky, ktoré sa majú odseparovať, stabilné.Separation of the precipitate from the liquid is a well known process that can be performed by decanting, filtering or centrifuging. However, if the reaction mixture contains two or more different solids, there is no universal way of separating the solids from each other. Filtration followed by mechanical separation of the solids by particle sorting is out of the question for practical reasons; in some cases, the solids can be separated by mechanical means such as flotation. Other methods are physicochemical methods, such as extraction or separation, which utilize the difference in solubility of the components, e.g. in water, in an aqueous acid, base or in organic solvents. A prerequisite for the applicability of these methods is that conditions can be found under which the components to be separated are stable.

V priemyselnom procese, ktorý zahrnuje použitie katalyzátora, je cena tohto katalyzátora často veľmi dôležitým parametrom v celkovej ekonomike tohto procesu. Preto je veľmi dôležitou výhodou, ak možno katalyzátor opäť použiť bez podstatnej straty katalytickej aktivity. Ak je katalyzátor prítomný v reakčnej zmesi spolu s inou tuhou zložkou, ktorá sa buď tvorí počas reakcie, ako je vedľajší produkt alebo požadovaný produkt, alebo je prítomná počas celého procesu, napr. tuhý východiskový materiál pridaný v prebytku, izolácia a opätovné použitie tohto katalyzátora sú sťažené.In an industrial process involving the use of a catalyst, the cost of the catalyst is often a very important parameter in the overall economy of the process. Therefore, it is a very important advantage if the catalyst can be reused without substantially losing its catalytic activity. If the catalyst is present in the reaction mixture together with another solid component that is either formed during the reaction, such as a by-product or desired product, or is present throughout the process, e.g. the solid starting material added in excess, the isolation and reuse of the catalyst are difficult.

V takých prípadoch niekedy možno katalyzátor izolovať extrakciou druhej(ých) tuhej(ých) látky(ok) organickými rozpúšťadlami a/alebo kyselinami alebo zásadami, ktoré rozpúšťajú tuhú(é) látku(ky), avšak nie katalyzátor. Avšak aktivita katalyzátorov, vrátane enzýmov, je veľmi citlivá na pri2 tomnosť takzvaných kaťalyzátorových jedov. Katalyzátorové jedy uplatňujú svoju aktivitu napr. tým, že sa veľmi silne viažu na katalyzátor, alebo ho rozkladajú. Teda silné kyseliny a zásady majú často nepriaznivý vplyv na aktivitu katalyzátorov a najmä enzýmy vo všeobecnosti podliehajú nereverzibilnému poškodeniu, ak sú vystavené vysokým koncentráciám kyselín alebo zásad. To prináša určité obmedzenia pre použitie kyselín a zásad pri spracovaní reakčných zmesí z enzymatických reakcií, ak sa má enzým recyklovať bez podstatnej straty aktivity. Ďalšie obmedzenia podmienok spracovania môže samozrejme priniesť povaha požadovaného produktu, ktorý sám osebe môže byť nestálou zlúčeninou.In such cases, the catalyst can sometimes be isolated by extracting the second solid (s) with organic solvents and / or acids or bases that dissolve the solid (s) but not the catalyst. However, the activity of catalysts, including enzymes, is very sensitive to the presence of so-called catalyst poisons. Catalyst poisons exert their activity e.g. by binding very strongly to or decomposing the catalyst. Thus, strong acids and bases often have an adverse effect on the activity of catalysts, and in particular enzymes are generally subject to irreversible damage when exposed to high concentrations of acids or bases. This imposes certain limitations on the use of acids and bases in the processing of reaction mixtures from enzymatic reactions if the enzyme is to be recycled without substantially losing activity. Obviously, the nature of the desired product, which may itself be an unstable compound, may bring about further limitations of the processing conditions.

Doterajší stav techniky neprináša uspokojivé riešenie vyššie popísaných problémov.The prior art does not provide a satisfactory solution to the problems described above.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Alternatívne k rozpúšťaniu tuhej(ýcb) zložky(iek) reakčnej zmesi po reakcii, okrem tuhého katalyzátora, a odseparovaniu katalyzátora filtráciou možno katalyzátor podľa tohto vynálezu odseparovať takmer kvantitatívne triedením na site alebo filtráciou po tom, čo sa reakcia považuje za skončenú, alebo prípadne kontinuálnym spôsobom. Pri zvlášť výhodnom spôsobe uskutočnenia sa použijú častice katalyzátora s dobre definovaným rozsahom veľkosti častíc a druhá(é) tuhá(é) zložka(y) reakčnej zmesi má(jú) veľkosť častíc menšiu, než je spodná hranica rozsahu zdanlivej veľkosti častíc katalyzátora. Odseparovanie katalyzátora sa potom vykoná ponechaním suspenzie, ktorá tvorí reakčnú zmes, prejsť sitom alebo filtrom, ktoré zachytia častice katalyzátora a prepustia zvyšok zmesi. Toto možno vykonať buď dávkovým alebo kontinuálnym spôsobom.Alternatively to dissolving the solid component (s) of the reaction mixture after the reaction, in addition to the solid catalyst, and separating the catalyst by filtration, the catalyst of the invention may be separated almost quantitatively by screening or filtration after the reaction is deemed complete or way. In a particularly preferred embodiment, catalyst particles with a well-defined particle size range are used and the second solid component (s) of the reaction mixture has a particle size smaller than the lower limit of the apparent particle size range of the catalyst. Separation of the catalyst is then effected by leaving the slurry which forms the reaction mixture through a sieve or filter to trap the catalyst particles and pass the remainder of the mixture. This can be done in a batch or continuous manner.

Ako odborník bude vedieť, existuje niekoľko možností ovplyvniť veľkosť a tvar častíc, ktoré sa majú odseparovať od katalyzátora. Napríklad, ak sú časticami kryštály, čo bude najčastejší prípad, prudké miešanie reakčnej zmesi počas ich tvorby bude viesť k vytváraniu menších kryštálov než mierne miešanie. Inými parametrami, ktoré ovplyvňujú rast kryštálov, sú: výber rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel, teplota, teplotný gradient, pH hodnota reakčnej zmesi, nukleácia a zrenie kryštálov v rozpúšťadle. Parametre, ktoré ovplyvňujú rast kryštálóv, nemajú žiadny vplyv, ^lebo majú len veľmi malý vplyv na veľkosť častíc katalyzátora, ktorú možno považovať počas reakcie za konštantnú. Priemyselné procesy obyčajne prebiehajú za dobre definovaných podmienok, a preto poskytujú produkty s dobre definovanými vlastnosťami, vrátane napr. veľkosti častíc kryštálov. Preto pri praktickom použití spôsobu podľa tohto vynálezu sa v niektorých prípadoch môže ukázať, že pri použití katalyzátora s vhodným rozsahom veľkosti častíc bude nevyhnutné upraviť veľkosť častíc zložky(iek), ktorá(é) sa má(jú) odseparovať od kata lyzátora.As one skilled in the art will know, there are several possibilities to influence the size and shape of the particles to be separated from the catalyst. For example, if the particles are crystals, as will most often be the case, vigorous stirring of the reaction mixture during formation will result in the formation of smaller crystals than moderate mixing. Other parameters that influence crystal growth are: choice of solvent or solvent mixture, temperature, temperature gradient, pH of the reaction mixture, nucleation and maturation of crystals in the solvent. The parameters that influence crystal growth have no effect, since they have very little effect on the particle size of the catalyst, which can be considered constant during the reaction. Industrial processes usually run under well defined conditions and therefore provide products with well defined properties, including e.g. the particle size of the crystals. Therefore, in the practical application of the process of the present invention, it may prove in some cases that when using a catalyst with a suitable particle size range, it will be necessary to adjust the particle size of the component (s) to be separated from the catalyst.

Separáciu tuhých zložiek možno uľahčiť, ak filtračná * doska alebo sito počas separácie vibruje, alebo ak sa suspenzia na filtračnej doske mieša. Po odseparovaní katalyzátora možno zvyšok reakčnej zmesi prefiltrovať na filtri, ktorý zachytí zvyšnú(é) tuhú(é) zložku(y). Relatívne množstvá požadovaného produktu, ktoré zostanú vo filtračnom koláči a vo filtráte, závisia od rozpustnosti požadovaného produktu v reakčnom médiu. Filtrát a filtračný koláč možno spracovať oddelene, pričom niektoré zložky môžu prípadne recirkulovať v procese spolu s katalyzátorom.Separation of the solids can be facilitated if the filter plate or sieve vibrates during separation, or if the suspension on the filter plate is stirred. After separation of the catalyst, the remainder of the reaction mixture can be filtered on a filter which retains the remaining solid component (s). The relative amounts of the desired product remaining in the filter cake and filtrate depend on the solubility of the desired product in the reaction medium. The filtrate and filter cake may be processed separately, whereby some components may optionally be recirculated in the process along with the catalyst.

Teda z najširšieho hľadiska sa tento vynález týka spôsobu odseparovania časticového tuhého katalyzátora od reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú časticovú tuhú zložku a kvapalinu, tým, že sa jedna z časticových tuhých zložiek použije s takou zdanlivou veľkosťou častíc, ktorá je mimo rozsahu zdanlivej veľkosti častíc druhej(ých) tuhej(ých) zložky(iek), načo sa reakčná zmes filtruje alebo odstred'uje použijúc zariadenie, ktoré zachytí zložku (y) s väčšími časticami a zvyšok zmesi nechá prejsť.Thus, in the broadest sense, the present invention relates to a method of separating a particulate solid catalyst from a reaction mixture further comprising at least one other particulate solid component and a liquid by using one of the particulate solid components with an apparent particle size outside the apparent particle size range. the particle size of the second solid component (s), whereupon the reaction mixture is filtered or centrifuged using a device which captures the component (s) with larger particles and passes the remainder of the mixture.

V prvom výhodnom uskutočnení vynálezu má(jú) tuhá(é) zložka(y), ktorá(é) sa má(jú) odseparovať od katalyzátora, zdanlivú veľkosť častíc menšiu, než je spodná hranica rozsahu zdanlivej veľkosti častíc katalyzátora.In a first preferred embodiment of the invention, the solid component (s) to be separated from the catalyst has an apparent particle size less than the lower limit of the apparent particle size range of the catalyst.

v ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je pomer medzi zdanlivým priemerom väčších častíc a zdanlivým priemerom menších častíc, ktoré sa majú odseparovať, najmenej 2.In a further preferred embodiment of the invention, the ratio between the apparent diameter of the larger particles and the apparent diameter of the smaller particles to be separated is at least 2.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je zdanlivý priemer častíc katalyzátora v rozsahu od 25 do 10,000 m, s výhodou od 50 do 750 m, výhodnejšie od 50 do 300 m.In a further preferred embodiment of the invention, the apparent diameter of the catalyst particles is in the range of from 25 to 10,000 m, preferably from 50 to 750 m, more preferably from 50 to 300 m.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized enzyme.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná proteáza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized protease.

v ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná metaloproteáza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized metalloprotease.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná serínová proteáza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized serine protease.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný termolyzín.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is immobilized thermolysin.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná amidáza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized amidase.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná esteráza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized esterase.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaná acyláza.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized acylase.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým, ktorý je schopný deacylovať 6-aminoskupinu penicilínu G.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized enzyme capable of deacylating the 6-amino group of penicillin G.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný enzým, ktorý je schopný deacylovaú 6-aminoskupinu ampicilínu.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized enzyme which is capable of deacylated the 6-amino group of ampicillin.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je imobilizovaným enzýmom penicilín-G-acyláza.In another preferred embodiment of the invention, the immobilized enzyme is penicillin-G-acylase.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je imobilizovaným enzýmom ampicilínhydroláza.In another preferred embodiment of the invention, the immobilized enzyme is ampicillin hydrolase.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný preparát celistvých buniek.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized whole cell preparation.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je tuhým katalyzátorom imobilizovaný preparát bunkového homogenátu.In another preferred embodiment of the invention, the solid catalyst is an immobilized cell homogenate preparation.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu sa tuhý produkt, tvoriaci sa v procese, v ktorom je(sú) východiskový(é) materiál(y) celkom rozpustený(é) v reakčnej zmesi, separuje kontinuálne od katalyzátora počas reakcie vedením filtrátu z filtra, ktorý zachytáva len katalyzátor, k filtru, ktorý zachytáva syntetizovaný tuhý produkt, a recirkuláciou filtrátu z tohto filtra ku katalyzátoru.In another preferred embodiment of the invention, the solid product formed in the process in which the starting material (s) is completely dissolved in the reaction mixture is separated continuously from the catalyst during the reaction by passing the filtrate from the filter which retains only a catalyst, to a filter that captures the synthesized solid product, and recirculating the filtrate from the filter to the catalyst.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyseli5 nou, zodpovedajúcou bočŕiému reťazcu, alebo derivátom tejto kyseliny, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a lactam antibiotic nucleus with an acid corresponding to the side chain, or a derivative thereof, from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 6-aminoskupiny v kyselineIn another preferred embodiment, the present invention relates to a method for separating an immobilized enzyme used to catalyze acylation of a 6-amino group in an acid

6-aminopenicilánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.6-aminopenicillan, from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-aminocefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-aminocephalosporanoic acid from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-7-metoxycefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-amino-7-methoxycephalosporanoic acid from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3-metoxy-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-amino-3-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-aminodezacetoxycefalosporánovej, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-aminodezacetoxycephalosporanoic acid from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 3-chlór-7-amino-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 3-chloro-7-amino-3-cephem-4-carboxylic acid from the remainder of the reaction mixture.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3-(1,2,3-triazol-4(5)-yltiometyl)-3-cefem-4-karboxylovej, od zvyšku reakčnej zmesi.in another preferred embodiment, the present invention relates to a method for separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-amino-3- (1,2,3-triazol-4 (5) -ylthiomethyl) -3-cefem-4 -carboxylic acid, from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie 7-aminoskupiny v kyseline 7-amino-3- [2- (5-metyl-i,3,4-tiadiazolyl)tiometyl] -3-cefem-4-karboxylovej , od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method for separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a 7-amino group in 7-amino-3- [2- (5-methyl-1,3,4-thiadiazolyl) thiomethyl] -3-cephem -4-carboxylic acid, from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-fenylglycínom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with D-phenylglycine as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a lactam antibiotic nucleus with a D-phenylglycine derivative as an acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-fenylglycínamidom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.in another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with D-phenylglycine amide as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylestérom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic nucleus with a methyl ester of D-phenylglycine as an acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic core with ethyl D-phenylglycine as the acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra propylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with propyl D-phenylglycine as the acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra izopropylesterom D-fenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic core with isopropyl ester of D-phenylglycine as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-4-hydroxyfenylglycínom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with D-4-hydroxyphenylglycine as an acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvýš7 ku reakčnej zmesi. 'In another preferred embodiment, the present invention relates to a method for separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of a lactam antibiotic nucleus with a D-4-hydroxyphenylglycine derivative as an acylating agent from an increase to a reaction mixture. '

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra D-4-hydroxyfenylglycínamidom ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with D-4-hydroxyphenylglycine amide as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic core with D-4-hydroxyphenylglycine methyl ester as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic nucleus with ethyl D-4-hydroxyphenylglycine as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra propylestérom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with propyl ester of D-4-hydroxyphenylglycine as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra izopropylesterom D-4-hydroxyfenylglycínu ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic core with D-4-hydroxyphenylglycine isopropyl ester as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyselinou 2-tiofénoctovou ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic core with 2-thiopheneacetic acid as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic nucleus with a 2-thiopheneacetic acid derivative as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra amidom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi. *In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the -lactam antibiotic core with 2-thiopheneacetic acid amide as acylating agent from the remainder of the reaction mixture. *

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra metylesterom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic nucleus with 2-thiopheneacetic acid methyl ester as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra etylesterom kyseliny 2-tiofénoctovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the lactam antibiotic core with ethyl 2-thiopheneacetic acid as the acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra kyselinou 3-tiofénmalónovou ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic nucleus with 3-thiophenemalonic acid as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie -laktámového antibiotického jadra derivátom kyseliny 3-tiofénmalónovej ako acylačným činidlom, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating the immobilized enzyme used to catalyze acylation of the lactam antibiotic nucleus with a 3-thiophenemalonic acid derivative as acylating agent from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie metylesteru L-fenylalanínu derivátom kyseliny L-aspartovej, v ktorej je chránená aminoskupina, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of L-phenylalanine methyl ester with an amino-protected L-aspartic acid derivative from the remainder of the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu acylácie metylesteru D,L-fenylalanínu derivátom kyseliny L-aspartovej, v ktorej je chránená aminoskupina, od zvyšku reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of the methyl ester D, L-phenylalanine with an amino-protected L-aspartic acid derivative from the remainder of the reaction mixture.

v ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu hydrolýzy amidu alebo esteru aminokarboxylovej kyseliny, aby vznikla príslušná voľná kyselina alebo jej soľ, od zvyšku reakčnej zmesi, keď sa hydrolýza uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.in another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the hydrolysis of an aminocarboxylic acid amide or ester to form the corresponding free acid or salt thereof from the remainder of the reaction mixture when the hydrolysis is carried out under conditions such that the product or its formed a portion precipitates from the reaction mixture.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu odseparovania imobilizovaného enzýmu, použitého na katalýzu konverzie kyseliny fumarovej alebo jej soli na kyselinu jablčnú alebo jej soľ, od získaného tuhého produktu, keď sa reakcia uskutočňuje za takých podmienok, že vytvorený produkt alebo jeho časť precipituje z reakčnej zmesi.In another preferred embodiment, the present invention relates to a method of separating an immobilized enzyme used to catalyze the conversion of fumaric acid or a salt thereof into malic acid or a salt thereof from the solid product obtained when the reaction is carried out under conditions such that the product or part formed precipitates from of the reaction mixture.

Podrobný popíš vynálezuDetailed description of the invention

Spôsob separácie podľa tohto vynálezu je zvlášť užitočný, keď sa má odseparovať heterogénny katalyzátor, napr. tuhý časticový imobilizovaný enzým, od reakčnej zmesi, ktorá ďalej obsahuje najmenej jednu inú časticovú tuhú zložku. Touto inou časticovou tuhou zložkou môže byť buď produkt, syntetizovaný pod vplyvom katalyzátora, alebo to môže byt nezreagovaný východiskový materiál, napr. východiskový materiál pridaný v prebytku. V tomto popise bude slovo produkt znamenať, ak nebude špecifikované ináč, buď požadovaný produkt alebo vedľajší produkt, ktorý je výsledkom reakcie.The separation process of the present invention is particularly useful when a heterogeneous catalyst, e.g. a solid particulate immobilized enzyme, from a reaction mixture further comprising at least one other particulate solid component. The other particulate solid component may be either a product synthesized under the influence of a catalyst or it may be an unreacted starting material, e.g. starting material added in excess. In this specification, unless otherwise specified, the word product will mean either the desired product or the by-product resulting from the reaction.

Ak je katalyzátor jedinou tuhou zložkou, prítomnou v reakčnej zmesi na začiatku reakcie a tento produkt je málo rozpustný v kvapalnej časti reakčnej zmesi, katalyzátor možno odseparovať od reakčnej zmesi tak, že častice tuhého produktu budú mať zdanlivú veľkosť častíc mimo rozsahu zdanlivej veľkosti častíc častíc tuhého katalyzátora, načo sa reakčná zmes filtruje alebo odstreďuje s použitím filtra alebo centrifúgy, ktoré zachytia zložku s väčšími časticami a nechajú prejsť zvyšok reakčnej zmesi. V ďalšom budeme označovať kvapalnú časť reakčnej zmesi ako reakčnú kvapalinu alebo jednoducho kvapalinu. Reakčná kvapalina teda obsahuje rozpúšťadlo (alebo zmes rozpúšťadiel), v ktorom sa reakcia uskutočňuje a rozpustenú časť východiskových materiálov a produktov, či už to budú tuhé látky alebo kvapaliny. Ak sa vyrába tuhý produkt v procese, pri ktorom sú východiskové materiály úplne rozpustené a častice produktu sú menšie než častice katalyzátora, odseparovanie katalyzátora od zvyšku reakčnej zmesi možno vykonať kontinuálnym spôsobom zavádzaním filtrátu z filtra, ktorý zachytáva len katalyzátor, k filtru, ktorý zachytáva syntetizovaný tuhý produkt, a recirkuláciou filtrátu z tohto filtra ku katalyzátoru. Týmto spôsobom sa rovnováha reakcie posúva smerom k vyššiemu výťažku.If the catalyst is the only solid component present in the reaction mixture at the start of the reaction and the product is poorly soluble in the liquid portion of the reaction mixture, the catalyst can be separated from the reaction mixture such that the solid product particles have an apparent particle size outside the apparent particle size range. catalyst, whereupon the reaction mixture is filtered or centrifuged using a filter or centrifuge to capture the larger particle component and allow the remainder of the reaction mixture to pass. Hereinafter, the liquid portion of the reaction mixture will be referred to as the reaction liquid or simply liquid. Thus, the reaction liquid comprises a solvent (or mixture of solvents) in which the reaction is carried out and a dissolved portion of the starting materials and products, whether solids or liquids. If a solid product is produced in a process in which the starting materials are completely dissolved and the product particles are smaller than the catalyst particles, separation of the catalyst from the remainder of the reaction mixture can be accomplished by continuously passing the filtrate from the catalyst-only filter to the synthesized-filter. solid product, and recirculating the filtrate from the filter to the catalyst. In this way, the equilibrium of the reaction is shifted towards a higher yield.

Jeden alebo viac východiskových materiálov môžu byt ob10 medzene rozpustné v rozpúšťadle, v ktorom prebieha reakcia.The one or more starting materials may generally be sparingly soluble in the reaction solvent.

V tomto prípade môže(u) byť východiskový(é) materiál(y) prítomný(é) v reakčnej zmesi v tuhej forme a reakčná kvapalina sa nasýti s ohľadom na príslušnú(é) zložku(y). Ak je produkt reakcie rozpustný v reakčnej kvapaline neobmedzene, problémom, ktorý treba riešiť týmto vynálezom počas ďalšieho spracovania, je odseparovanie katalyzátora od reakčnej kvapaliny, ktorá obsahuje tuhú látku, nezreagovaný východiskový materiál. Ak je produkt tiež obmedzene rozpustný v reakčnej kvapaline, produkt a nezreagovaný východiskový materiál sa musia od seba odseparovať po odseparovaní katalyzátora od zvyšku reakčnej zmesi.In this case, the starting material (s) can be present in the reaction mixture in solid form and the reaction liquid is saturated with respect to the respective component (s). If the reaction product is soluble in the reaction liquid indefinitely, the problem to be solved by the present invention during further processing is the separation of the catalyst from the reaction liquid containing the solid, unreacted starting material. If the product is also sparingly soluble in the reaction liquid, the product and unreacted starting material must separate from each other after the catalyst is separated from the remainder of the reaction mixture.

Skutočný rozmer častíc, ako sú kryštály, možno stanoviť napr. s použitím mikroskopu, vybaveného vhodným meradlom. Častice sa vyskytujú v mnohých rôznych tvaroch. Kryštály môžu byť napr. ihličkové, platničkové alebo kubické. V tomto kontexte nie je dôležitým znakom skutočný rozmer častíc, ale skôr zdanlivý rozmer, označovaný napr. ako zdanlivý priemer.The actual particle size, such as crystals, can be determined e.g. using a microscope equipped with a suitable gauge. The particles come in many different shapes. The crystals may be e.g. pin, plate or cubic. In this context, the important feature is not the actual particle size, but rather the apparent dimension, e.g. as the apparent diameter.

V tomto popise sa používa označenie zdanlivý rozmer alebo zdanlivý priemer, aby odrážalo chovanie častice na site alebo filtri. Teda zdanlivý priemer častice zodpovedá priemeru otvoru alebo póru, ktorý pri praktickom použití práve dovolí, aby častica cezeň prešla. Pri výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa používa tak malá veľkosť častíc katalyzátora, ako to len spôsob separácie dovoľuje. To pomáha zaistiť vysokú aktivitu katalyzátora a pomáha eliminovať problémy s difúziou.In this specification, the apparent size or apparent diameter is used to reflect the behavior of the particle on the screen or filter. Thus, the apparent diameter of the particle corresponds to the diameter of the aperture or pore, which in practice allows the particle to pass therethrough. In a preferred embodiment of the invention, the particle size of the catalyst is as small as the separation method permits. This helps to ensure high catalyst activity and helps to eliminate diffusion problems.

Je dobre známe, že mnohé procesy, ktoré sa uskutočňujú pod vplyvom katalyzátora, sú veľmi špecifické a že prebiehajú s vysokým výťažkom, najmä, ak je katalyzátorom enzým. Jednou z výhod tohto spôsobu je, že katalyzátor možno opätovne použiť. Vďaka veľmi miernym podmienkam, použitým pri separácii katalyzátora zo zvyšku reakčnej zmesi, je obyčajne strata katalytickej aktivity veľmi malá. Príspevok k vysokému výkonu prináša skutočnosť, že tento spôsob je veľmi vhodný na použitie pri reakciách prebiehajúcich s takými veľkými množstvami východiskového materiálu na jednotkový objem reakčnej zmesi, že jeho časť môže byť pôvodne v tuhej forme.It is well known that many processes that are carried out under the influence of a catalyst are very specific and that they proceed in high yield, especially when the catalyst is an enzyme. One advantage of this process is that the catalyst can be reused. Due to the very mild conditions used to separate the catalyst from the remainder of the reaction mixture, the loss of catalytic activity is usually very low. The contribution to the high throughput is that this process is very suitable for use in reactions taking place with such large amounts of starting material per unit volume of the reaction mixture that a portion thereof may initially be in solid form.

Tuhý katalyzátor, ktorý sa má použiť podľa tohto vynálezu, sa môže vyskytovať vo forme časticového preparátu imo11 bilizovaného enzýmu,'a môže mať hustotu vyššiu, alebo nižšiu, než je hustota reakčnej kvapaliny. V tomto preparáte môže byť enzým adsorbovaný, absorbovaný, kovalentne viazaný, uzavretý alebo viazaný iónovými silami. Spôsoby imobilizácie enzýmov sú známe v doterajšom stave techniky. Doterajší stav techniky tiež poskytuje spôsoby prípravy častíc, ktoré majú byť nosičmi imobilizovaných katalyzátorov, napr. enzýmov, a spôsoby izolácie rôznych frakcií časticových tuhých látok podľa ich distribúcie veľkosti častíc. Špecifický katalyzátor, ktorý sa má použiť, závisí v každom prípade od procesu, ktorý má prebiehať.The solid catalyst to be used according to the invention may be in the form of a particulate preparation of the immobilized enzyme, and may have a density higher or lower than the density of the reaction liquid. In this preparation, the enzyme may be adsorbed, absorbed, covalently bound, closed, or bound by ionic forces. Methods for immobilizing enzymes are known in the art. The prior art also provides methods for preparing particles to be carriers of immobilized catalysts, e.g. enzymes, and methods for isolating the various fractions of particulate solids according to their particle size distribution. The specific catalyst to be used depends in each case on the process to be carried out.

Proces podľa tohto vynálezu vo všeobecnosti prebieha vo vode. Možno tiež pridať organické rozpúšťadlá. Organické rozpúšťadlá sa s výhodou vyberú z rozpúšťadiel miešateľných s vodou, ako sú metanol, etanol, l-propanol, 2-propanol, l-butanol, 1,4-butándiol, acetón, acetonitril, Ν,Ν-dimetylformamid a dimetylsulfoxid.The process according to the invention generally takes place in water. Organic solvents may also be added. The organic solvents are preferably selected from water-miscible solvents such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 1,4-butanediol, acetone, acetonitrile, Ν, Ν-dimethylformamide and dimethylsulfoxide.

Ako bolo uvedené vyššie, teplota je jedným z parametrov, ktoré ovplyvňujú veľkosť častíc, keď sa tvorí tuhý produkt. Príčinou môže byť to, že rýchlosť rastu kryštálov závisí od teploty, alebo v niektorých prípadoch to, že pri rôznych teplotách vznikajú rôzne kryštalografické modifikácie. Bod tuhnutia reakčnej kvapaliny tvorí absolútnu spodnú teplotnú hranicu pre uskutočnenie spôsobu podľa tohto vynálezu. Ak je použitým katalyzátorom imobilizovaný enzým, absolútna horná teplotná hranica bude obyčajne závisieť od enzýmu .As mentioned above, temperature is one of the parameters that influence particle size when a solid product is formed. This may be because the rate of crystal growth is temperature-dependent, or in some cases different crystallographic modifications may occur at different temperatures. The freezing point of the reaction liquid forms the absolute lower temperature limit for carrying out the process of the invention. If the enzyme used is immobilized enzyme, the absolute upper temperature limit will usually depend on the enzyme.

Príkladmi špecifických oblastí, v ktorých tento vynález vedie k podstatným zlepšeniam, sú: l) príprava semisyntetických penicilínov a cefalosporínov, 2) hydrolýza amidov a esterov a 3) syntéza peptidov.Examples of specific areas in which this invention leads to substantial improvements are: l) preparation of semisynthetic penicillins and cephalosporins, 2) hydrolysis of amides and esters, and 3) synthesis of peptides.

Príkladmi -laktámových antibiotík (penicilínov a cefalosporínov) , ktoré možno s výhodou pripraviť s použitím spôsobu podľa tohto vynálezu, sú ampicilín, amoxicilín, tikarcilín, cefaclor, cefatrizín, cefaparol, cefalexín, cefadroxil, cefaloglycín a cefalotín.Examples of lactam antibiotics (penicillins and cephalosporins) that can be advantageously prepared using the method of the invention are ampicillin, amoxicillin, ticarcillin, cefaclor, cefatrizine, cefaparol, cefalexin, cefadroxil, cephaloglycine and cephalotin.

V súčasnosti sa semisyntetické -laktámy priemyselne pripravujú chemickými metódami. Napríklad penicilíny sa pripravujú reakciou 6-APA, obyčajne s chránenou karboxylovou skupinou, s aktivovaným derivátom bočného reťazca s násled12 ným odstránením chrániacich skupín hydrolýzou.. Napríklad ampicilín možno pripraviť reakciou 6-APA, s vhodne chránenou skupinou karboxylovej kyseliny, s D-fenylglycylchloridom s následným hydrolytickým odstránením skupiny, ktorá chráni skupinu karboxylovej kyseliny. Tieto reakcie obyčajne zahrnujú nákladné kroky, ako je použitie teplôt pod 0 C (v niektorých prípadoch dokonca pod -25 C), silylačné reagenty a organické rozpúšťadlá, ako je metylénchlorid, s ktorými treba zaobchádzať opatrne, pretože sú škodlivé zdraviu a životnému prostrediu.At present, semisynthetic lactams are industrially prepared by chemical methods. For example, penicillins are prepared by reacting 6-APA, usually with a carboxy-protected group, with an activated side chain derivative followed by deprotection by hydrolysis. For example, ampicillin can be prepared by reacting 6-APA, with a suitably protected carboxylic acid group, with D-phenylglycyl chloride with followed by hydrolytic removal of the carboxylic acid protecting group. These reactions usually involve costly steps such as the use of temperatures below 0 ° C (in some cases even below -25 ° C), silylating reagents and organic solvents such as methylene chloride, which should be handled with care as they are harmful to health and the environment.

Enzymatická výroba semisyntetických -laktámových antibiotík acyláciou -laktámového jadra derivátom (ako je nižší alkylester) D-fenylglycínu alebo D-4-hydroxyfenylglycínu je známa napr. z DE patentovej prihlášky č. 2,163,792, AT patentu £. 243,986, NL patentovej prihlášky č. 70-09138, DE patentovej prihlášky č. 2,621,618 a EP zverejnenej patentovej prihlášky č. 339,751. Spôsoby, popísané v doterajšom stave techniky, sa obyčajne uskutočňovali pri koncentráciách nižších než 300 mM derivátu D-fenylglycínu a nižších než 25 mM -laktámového jadra.The enzymatic production of semi-synthetic lactam antibiotics by acylating the lactam nucleus with a derivative (such as a lower alkyl ester) of D-phenylglycine or D-4-hydroxyphenylglycine is known e.g. from DE patent application no. 2,163,792, the AT patent £. 243,986, NL patent application no. 70-09138, DE patent application no. No. 2,621,618 and EP published patent application no. 339,751. The methods described in the prior art are usually carried out at concentrations of less than 300 mM D-phenylglycine derivative and less than 25 mM lactam core.

Táto značne nízka koncentrácia východiskových materiálov je potenciálnou nevýhodou týchto známych spôsobov enzymatickej výroby semisyntetických -laktámových antibiotík (žiadny sa doteraz nepoužil v priemyselnom meradle), pretože sťažuje, a teda zdražuje, izoláciu vytvorených -laktámových antibiotík. Naviac, publikované výťažky sú malé, obyčajne pod 85 %, a vyžaduje sa spôsob recyklovania nezreagovaného -laktámového jadra, čo vedie k viacerým a drahým jednotkovým operáciám.This relatively low concentration of starting materials is a potential disadvantage of these known methods of enzymatic production of semisynthetic-lactam antibiotics (none of which have been used hitherto on an industrial scale) because it makes it difficult and thus more expensive to isolate the formed lactam antibiotics. In addition, the published yields are small, usually below 85%, and a method of recycling unreacted lactam nucleus is required, resulting in multiple and expensive unit operations.

Jedným z problémov, ktoré vznikajú zvýšením koncentrácie východiskových materiálov pri enzymatickej syntéze semisyntetických -laktámových antibiotík, je to, že rozpustnosť niektorých zo zúčastnených východiskových materiálov a z produktov, vytvorených počas reakcie, je značne nízka. Preto, aby sa proces uskutočňoval za ekonomicky výhodnejších podmienok, môže byť nevyhnutným mať na začiatku reakcie tak veľa východiskového materiálu, že sa nemôže úplne rozpustiť v reakčnej kvapaline. Taktiež vytvorený produkt sa môže oddeľovať v tuhej forme, pretože veľké vyrobené množstvo na jednotku objemu sa nemusí úplne rozpustiť v reakčnej kvapa13 line. Tak vzniká potreba odseparovať katalyzátor z reakčnej zmesi, ktorá obsahuje tuhé produkty a/alebo nezreagované východiskové materiály, predtým, než sa zvyšok reakčnej zmesi ďalej spracuje, pretože spracovanie môže zahrnovať podmienky, ktoré poškodzujú enzýmovú aktivitu, napr. je to rozpustenie produktov a nezreagovaných východiskových materiálov pri nízkej pH-hodnote (napr. pri pH 0.5 - 2.0).One of the problems that arises from increasing the concentration of starting materials in the enzymatic synthesis of semisynthetic-lactam antibiotics is that the solubility of some of the starting materials involved and of the products formed during the reaction is considerably low. Therefore, in order to carry out the process under more economical conditions, it may be necessary to have so much starting material at the start of the reaction that it cannot completely dissolve in the reaction liquid. Also, the product formed can be separated in solid form, since the large amount produced per unit volume may not completely dissolve in the reaction liquid. Thus, there is a need to separate the catalyst from the reaction mixture, which contains solid products and / or unreacted starting materials, before the remainder of the reaction mixture is further processed, since the treatment may include conditions that impair enzyme activity, e.g. it is the dissolution of the products and unreacted starting materials at a low pH-value (e.g. at a pH of 0.5-2.0).

Acylačným činidlom, použitým na zavedenie bočného reťazca do -laktámového antibiotického jadra, t.j. na zavedenie acylovej skupiny do 6-aminoskupiny penicilínov alebo do 7-aminoskupiny cefalosporínov, môže byť zodpovedajúca kyselina alebo jej derivát, napr. nižší alkyl(metyl, etyl, propyl alebo izopropyl)ester, alebo jej primárny, sekundárny alebo terciárny amid. Výhodné sú metylester, etylester a amid. Derivát možno použiť vo voľnej forme alebo vo forme soli, napr. soli HCI alebo soli H2SO4.The acylating agent used to introduce the side chain into the lactam antibiotic core, i. for introducing an acyl group into the 6-amino group of penicillins or the 7-amino group of cephalosporins, the corresponding acid or derivative thereof, e.g. a lower alkyl (methyl, ethyl, propyl or isopropyl) ester, or a primary, secondary or tertiary amide thereof. Methyl ester, ethyl ester and amide are preferred. The derivative may be used in free form or in salt form, e.g. HCl salt or H2SO4 salt.

Enzýmom, ktorý sa má použiť, môže byť ľubovoľný enzým, ktorý katalyzuje príslušnú reakciu. Také enzýmy sa obyčajne nazývajú penicilínovými amidázami, penicilínovými acylázami alebo ampicilínovými hydrolázami. Mnohé mikrobiálne enzýmy, o ktorých je známe, že majú túto aktivitu, sa získavajú napríklad z baktérií rodu Acetobacter. Xanthomonas. Mycoplana. Protaminobacter. Aeromonas (DE patentová prihláška č. 2,163,792), Pseudomonas (AT patent č. 243,986), Flavobacterium (NL patentová prihláška č. 70-09138), Aphanocladium. Cephalosporium (DE patentová prihláška č. 2,621,618), Acetobacter pasteurianus (DE patentová prihláška č. 2,163,792 A), Acetobacter turbidans (Takahashi a spol., Biochem.j. 137 (1974), 497 - 503), Pseudomonas melanooenum (Kim & Byun, Biochim.Biophys.Acta 1040 (1990), 12 - 18), Xanthomonas citrii (EP zverejnená patentová prihláška č. 339,751), Kluwera citrophila (Okachi a spol., Agr.Biol.Chem. 37 (1973), 2797 - 2804), Eschericia coli (DE patentová prihláška č. 2930794) a Bacillus meqaterium (Chiang & Bennett, J.Bacteriol. SI (1967), 302).The enzyme to be used may be any enzyme that catalyzes the reaction. Such enzymes are commonly called penicillin amidases, penicillin acylases or ampicillin hydrolase. Many microbial enzymes known to have this activity are obtained, for example, from bacteria of the genus Acetobacter. Xanthomonas. Mycoplana. Protaminobacter. Aeromonas (DE Patent Application No. 2,163,792), Pseudomonas (AT Patent No. 243,986), Flavobacterium (NL Patent Application No. 70-09138), Aphanocladium. Cephalosporium (DE Patent Application No. 2,621,618), Acetobacter pasteurianus (DE Patent Application No. 2,163,792 A), Acetobacter turbidans (Takahashi et al., Biochem. 137 (1974), 497-503), Pseudomonas melanooenum (Kim & Byun.) Biochim.Biophys.Acta 1040 (1990), 12-18, Xanthomonas citrii (EP Patent Application Publication No. 339,751), Kluwer citrophila (Okachi et al., Agr.Biol.Chem. 37 (1973), 2797-2804) , Eschericia coli (DE Patent Application No. 2930794) and Bacillus meqaterium (Chiang & Bennett, J. Bacteriol. SI (1967), 302).

Po odseparovaní od zvyšku reakčnej zmesi možno katalyzátor opäť použiť, prípadne po premytí. Produkty a prípadne nezreagovaný východiskový materiál možno odseparovať a spracovať oddelene, alebo recyklovať.After separation from the remainder of the reaction mixture, the catalyst can be reused, optionally after washing. The products and any unreacted starting material can be separated and processed separately or recycled.

Príkladom peptidu, ktorý možno s výhodou pripraviť s použitím spôsobu podľa tohto vynálezu, je metylester N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu, ďalej označovaný ako ZAPM. ZAPM je kľúčovým intermediátom pri výrobe sladidla aspartámu. Pri výrobe aspartámu (metylesteru L- -aspartyl-L-fenylalanínu) jeden z kritických krokov zahrnuje enzýmom katalyzované viazanie derivátu kyseliny aspartovej s hydrochloridom metylesteru fenylalanínu (napr. väzbu kyseliny N-benzyloxykarbonyl-L-aspartovej s hydrochloridom metylesteru L-fenylalanínu), aby vznikol ZAPM. ZAPM tvorí velmi obmedzene rozpustnú adičnú zlúčeninu s metylesterom L-fenylalanínu (alebo .metylesterom D-fenylalanínu, ak je prítomný), a preto precipituje počas syntézy. Rovnováha reakcie je tým posunutá smerom ku kondenzácii.An example of a peptide that can be conveniently prepared using the method of the invention is N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, hereinafter referred to as ZAPM. ZAPM is a key intermediate in the production of the sweetener aspartame. In the production of aspartame (L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester), one of the critical steps involves enzyme-catalyzed binding of an aspartic acid derivative with phenylalanine methyl ester hydrochloride (e.g., N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid bond with L-phenylalanine methyl ester hydrochloride) was created by ZAPM. ZAPM forms a very sparingly soluble addition compound with L-phenylalanine methyl ester (or D-phenylalanine methyl ester, if present) and therefore precipitates during the synthesis. The reaction equilibrium is thereby shifted towards condensation.

Podľa doterajšieho stavu techniky možno použiť čiastočne vyčistený, rozpustný enzýmový preparát (napr. termolyzín) ako katalyzátor v kondenzačnom kroku. Aby sa odseparoval enzým od reakčného produktu, reakčný produkt sa rozpustí a enzým sa vyzráža pridaním organického rozpúšťadla (napríklad acetónu) a odstráni, napríklad filtráciou. Avšak od 14 % až do 60 % katalytickej aktivity enzýmu sa počas tohto procesu stratí (Nonaka a spol., US patent č. 4,212,945, a Meijer a spol. v Biocatalysis in Organic Syntheses (Editori: Tramper, van der Plaš a Linko), str. 135 - 156 (1985)). K najväčšej strate aktivity dochádza počas precipitácie a izolácie enzýmu.According to the prior art, a partially purified, soluble enzyme preparation (e.g. thermolysin) can be used as a catalyst in the condensation step. In order to separate the enzyme from the reaction product, the reaction product is dissolved and the enzyme is precipitated by the addition of an organic solvent (e.g. acetone) and removed, for example by filtration. However, from 14% to 60% of the catalytic activity of the enzyme is lost during this process (Nonaka et al., US Patent No. 4,212,945, and Meijer et al. In Biocatalysis in Organic Syntheses (Editors: Tramper, van der Plas and Linko), pp. 135-156 (1985)). The greatest loss of activity occurs during the precipitation and isolation of the enzyme.

Použitie spôsobu podľa tohto vynálezu s imobilizovaným preparátom termolyzínu vo vyššie uvedenom procese prípravy ZAPM zjednodušuje separačný krok a znižuje stratu aktivity enzýmu v separačnom kroku na asi 1 %.The use of the method of the invention with the immobilized thermolysin preparation in the above ZAPM preparation process simplifies the separation step and reduces the loss of enzyme activity in the separation step to about 1%.

Tento vynález bude ďalej demonštrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemožno chápať ako obmedzujúce pre rozsah ochrany. Znaky uvedené v predchádzajúcom popise a v nasledujúcich príkladoch a nárokoch môžu byť, či už osve alebo v ich ľubovoľnej kombinácii, podstatnými pre uskutočnenie vynálezu v jeho rôznych formách.The present invention will be further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of protection. The features set forth in the foregoing description and in the following examples and claims may be essential, whether in the form of an enlightenment or any combination thereof, to practice the invention in its various forms.

Príklad 1Example 1

Príprava katalyzátora, vhodného o,i. na syntézu -laktámovPreparation of a catalyst, suitable o, i. for the synthesis of lactams

Imobilizovaná penicilín-G-acyláza z E.coli (250 g, Eupergit^R-PcA, získaná od Rôhm Pharma) sa pretriedila cezImmobilized E.coli penicillin-G-acylase (250 g, Eupergit ^R -PcA, obtained from Röhm Pharma) was screened through

300 m a potom cez l'80 m sito prepláchnutím vodou. Materiál, zachytený na 180 m site, sa použil ako enzýmový katalyzátor v ďalej uvedených príkladoch 2-5. Pri teste 4-dimetylaminobenzaldehydovou metódou, ako ju popísali Balasingham a spol., Biochim. Biophys. Acta 276 (1972), 250 - 256, aktivita katalyzátora bola 115 penicilín-G-acylázových jednotiek (U) na g mokrého katalyzátora.300 m and then through 180 m sieve by rinsing with water. The material captured on a 180 m sieve was used as an enzyme catalyst in Examples 2-5 below. In the 4-dimethylaminobenzaldehyde assay as described by Balasingham et al., Biochim. Biophys. Acta 276 (1972), 250-256, catalyst activity was 115 penicillin-G-acylase units (U) per g wet catalyst.

Prfolád 2Prfolád 2

Enzvmatická syntéza ampicilínuEnzymatic synthesis of ampicillin

Metylester D-fenylglycínu (v ďalšom označovaný ako D-PGM) a kyselina 6-aminopenicilánová (v ďalšom označovaná ako 6-APA) sa suspendovali v 50 mM fosfátového pufra s pH hodnotou 6.0, pričom konečné koncentrácie D-PGM a 6-APA boli 450 mM a 100 mM. Teplota suspenzie sa nastavila na 35 C a pridalo sa 10.0 g mokrého imobilizovaného enzýmu (podľa príkladu 1), pričom celkový objem bol 100 ml. Reakcia sa nechala prebiehať za účinného miešania pri 35 C, pričom pH hodnota sa udržovala na 6.0 titráciou s 2 M H₂SO₄.D-phenylglycine methyl ester (hereinafter referred to as D-PGM) and 6-aminopenicillanic acid (hereinafter referred to as 6-APA) were suspended in 50 mM phosphate buffer at pH 6.0, with final concentrations of D-PGM and 6-APA being 450 mM and 100 mM. The suspension temperature was adjusted to 35 ° C and 10.0 g wet immobilized enzyme (according to Example 1) was added, with a total volume of 100 ml. The reaction was allowed to proceed with efficient stirring at 35 ° C while maintaining the pH at 6.0 by titration with 2 MH ₂ SO ₄ .

Po približne 0.5 hodine začal z reakčnej zmesi precipitovať D-fenylglycín (v ďalšom označovaný ako D-PG) a asi po 3 hodinách koncentrácia ampicilínu dosiahla maximum 77 mM, čo zodpovedá 85 %-nej konverzii 6-APA. V tomto momente sa obsah nádoby preniesol do filtračnej jednotky, ktorá mala ako dno sito s veľkosťou ôk 100 m a rotujúcu vrtuľu, umiestnenú tesne nad týmto sitom. Imobilizovaný enzým sa zachytil na site, zatiaľ čo zvyšná časť suspenzie ním prešla. Precipitát v tomto filtráte pozostával z kryštálov D-fenylglycínu, obsahujúcich trochu anpicilínu, a kvapalina obsahovala o.i. rozpustený produkt a nezreagované východiskové materiály. Vytvorené kryštály ampicilínu mali veľkosť častíc menšiu než 50 m. Filtrát (t.j. suspenzia s obsahom kryštálov a reakčnej kvapaliny) sa odstredil a čistý centrifugát sa použil na vymytie kryštálov, ktoré zostali na katalyzátore. Nastavením toku filtrátu zo separačnej jednotky a toku čistej kvapaliny nad usadeninou k separačnej jednotke sa katalyzátor udržoval v suspenzii po celú dobu počas separácie. Akonáhle nebolo vidieť v katalyzátorovej frakcii žiadne kryštály, nádoba sa úplne vyprázdnila, pričom na site zostal len katalyzátor.After about 0.5 hours, D-phenylglycine (hereafter referred to as D-PG) started to precipitate from the reaction mixture, and after about 3 hours the ampicillin concentration reached a maximum of 77 mM, corresponding to an 85% conversion of 6-APA. At this point, the contents of the vessel were transferred to a filter unit having a 100 m mesh screen and a rotating propeller located just above the screen as the bottom. The immobilized enzyme was captured on a sieve while the remainder of the suspension passed through it. The precipitate in this filtrate consisted of D-phenylglycine crystals containing some anpicillin, and the liquid contained o.i. dissolved product and unreacted starting materials. The ampicillin crystals formed had a particle size of less than 50 m. The filtrate (i.e., the suspension containing crystals and reaction liquid) was centrifuged and the clean centrifugate was used to wash the crystals remaining on the catalyst. By adjusting the filtrate flow from the separation unit and the flow of pure supernatant to the separation unit, the catalyst was kept in suspension at all times during the separation. Once no crystals were seen in the catalyst fraction, the vessel was completely emptied leaving only the catalyst on the screen.

Po separácii bólo vo filtráte 97 % ampiqilínu a 95 % D-PG, vytvorených počas syntézy. Ampicilín sa izoloval a ďalej čistil známymi postupmi.After separation, the filtrate was 97% ampiqiline and 95% D-PG formed during the synthesis. Ampicillin was isolated and further purified by known procedures.

Katalyzátor, zachytený v separačnej jednotke, sa premyl 50 mM fosfátovým pufrom (pH hodnota: 6.0) a jeho aktivita sa potom testovala podľa spôsobu, uvedeného v príklade 1. Ako je naznačené v tabuľke 1, po syntéze nedošlo k signifikantnej strate aktivity katalyzátora a katalyzátor bol teda vhodný na opätovné použitie.The catalyst retained in the separation unit was washed with 50 mM phosphate buffer (pH value: 6.0) and its activity was then tested according to the method described in Example 1. As indicated in Table 1, there was no significant loss of catalyst activity after the synthesis. it was therefore suitable for reuse.

Tabuľka 1Table 1

Množstvo katalyzátora, g Amount of catalyst, g Aktivita, U/g activity U / g Pred použitím Before use 10.00 10:00 115.0 115.0 Po jednom použití After single use 9.85 9.85 114.5 114.5

HPLC analýza reakčných zložiekHPLC analysis of reactants

Stĺpec RP LC-18, (250 x 4.6 mm; 5 m)RP column LC-18, (250 x 4.6 mm; 5 m)

Eluent A 25 mM fosfátový pufer, pH hodnota 6.5Eluent A 25 mM phosphate buffer, pH 6.5

Eluent B acetonitril.Eluent B acetonitrile.

Vypieranie sa uskutočnilo so zmesami eluentov A a B podľa tabuľky 2.Washing was performed with mixtures of eluents A and B according to Table 2.

Tabuľka 2Table 2

Čas, minúty Time, minutes % A % A 0 -> 10 0 -> 10 99 -> 80 99-> 80 10 -> 20 10 -> 20 80 80 20 -> 21 20 -> 21 80 -> 99 80-> 99 21 -> 35 21-> 35 99 99

Prietok : 1 ml/min.Flow rate: 1 ml / min.

UV detekcia pri 215 nmUV detection at 215 nm

Doba zadržania v minútach : D-PG : 4.1, 6-APA : 8.1, ampicilín : 13.9, D-PGM : 18.Dwell Time in minutes: D-PG: 4.1, 6-APA: 8.1, ampicillin: 13.9, D-PGM: 18.

Príklad 3Example 3

Enzvmatická syntéza fcefalexínuEnzymatic synthesis of fcephalexin

Metylester D-fenylglycínu, HCl-soľ, (1.6526 g) a kyselina 7-aminodezacetoxycefalosporánová (7-ADCA) (0.4278 g) sa rozpustili v 50 mM fosfátového pufra (pH hodnota: 6.5) a temperovali sa na 35 C. Pridal sa enzýmový katalyzátor podľa príkladu 1 (2 g) a objem reakčnej zmesi sa doplnil do 20 ml pufrom. Reakcia sa ponechala prebiehať za účinného miešania, pričom sa pH hodnota a teplota udržovali konštantnými .D-Phenylglycine methyl ester, HCl salt, (1.6526 g) and 7-aminodezacetoxycephalosporanoic acid (7-ADCA) (0.4278 g) were dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH value: 6.5) and tempered to 35 C. Enzyme was added. the catalyst of Example 1 (2 g) and the volume of the reaction mixture was made up to 20 ml with buffer. The reaction was allowed to proceed with efficient stirring while maintaining the pH and temperature constant.

Približne 45 minút po pridaní enzýmového katalyzátora sa vytvoril precipitát a po ďalších 20 minútach sa miešanie zastavilo a obsah reakčnej nádoby sa preniesol do filtračnej jednotky, popísanej v príklade 2, a katalyzátor sa odseparoval od vytvoreného precipitátu a reakčnej kvapaliny. Z precipitátu a reakčnej kvapaliny, ktoré obsahovali o.i. cefalexín, D-fenylglycín, metylester D-fenylglycínu a kyselinu 7-aminodezacetoxycefalosporánovú, sa izoloval cefalexín a vyčistil sa známymi postupmi.Approximately 45 minutes after the addition of the enzyme catalyst, a precipitate formed and after a further 20 minutes stirring was stopped and the contents of the reaction vessel were transferred to the filtration unit described in Example 2, and the catalyst was separated from the precipitate and reaction liquid formed. From the precipitate and reaction liquid containing o.i. cephalexin, D-phenylglycine, D-phenylglycine methyl ester, and 7-aminodezacetoxycephalosporanoic acid were isolated and cephalexin was purified by known procedures.

Po separačnom kroku sa u katalyzátora zachovalo viac než 99 % katalytickej aktivity a katalyzátor bol teda vhodný na opätovné použitie. Pred opätovným použitím katalyzátora je možné vložiť premývací krok.After the separation step, the catalyst retained more than 99% of the catalytic activity and was thus suitable for reuse. It is possible to insert a washing step before re-using the catalyst.

Reakcia sa sledovala pomocou HPLC za tých istých podmienok, aké boli popísané v príklade 2. Zistili sa doby zadržania pre 7-ADCA 6.3 min. a pre cefalexín 13.4 min.The reaction was monitored by HPLC under the same conditions as described in Example 2. Retention times were determined for 7-ADCA 6.3 min. and for cephalexin 13.4 min.

Príklad 4Example 4

Enzvmatická syntéza amoxicilinuEnzymatic synthesis of amoxicillin

Pripravila sa suspenzia D-4-hydroxyfenylglycínamidu (44.9 g, v ďalšom označovaný ako HPGA) a 6-APA (14 .30 g) v 50 mM fosfátovom pufri (pH hodnota: 6.5) a temperovala sa pri 25 C v reakčnej nádobe, vybavenej sitom s veľkosťou ôk 100 m ako spodkom nádoby, a rotujúcou vrtuľou, umiestnenou bezprostredne nad sitom. Reakcia sa odštartovala pridaním 40 g katalyzátora (podľa príkladu 1) (konečný objem: 400 ml) a pH hodnota sa udržovala počas reakcie konštantnou titráciou 2 M H₂SO₄. Objem pod sitom bol menej než 15 ml a pomocou čerpadla sa filtrát (obsahujúci reakčnú kvapalinu, kryštály východiskových materiálov a produktov) kontinuálne vracal do vrchnej časti reakčnej nádoby počas celého procesu.A suspension of D-4-hydroxyphenylglycamide (44.9 g, hereinafter referred to as HPGA) and 6-APA (14.30 g) in 50 mM phosphate buffer (pH value: 6.5) was prepared and tempered at 25 C in a reaction vessel equipped with a sieve with a mesh size of 100 m as the bottom of the vessel, and a rotating propeller located immediately above the sieve. The reaction was started by the addition of 40 g of catalyst (according to Example 1) (final volume: 400 ml) and the pH was maintained during the reaction by constant titration of 2 M ₂ SO ₄ . The volume under the sieve was less than 15 ml and by means of a pump the filtrate (containing the reaction liquid, starting material crystals and products) was continuously returned to the top of the reaction vessel throughout the process.

Po 10 hodinách 'koncentrácia amoxicilínu dosiahla maximum, zodpovedajúce 85 %-nej konverzii a reakčná zmes obsahovala o.i. kryštály amoxicilínu, D-4-hydroxyfenylglycín (v ďalšom označovaný ako HPG) a nezreagovanú HPGA. Recirkulácia filtrátu do reakčnej nádoby sa zastavila a namiesto toho sa filtrát zaviedol do centrifúgy. Tak, ako bolo popísané v predchádzajúcich dvoch príkladoch, sa čistá kvapalina nad usadeninou použila na vymytie posledných kryštálov z katalyzátora.After 10 hours, the concentration of amoxicillin reached a maximum corresponding to 85% conversion and the reaction mixture contained o.i. crystals of amoxicillin, D-4-hydroxyphenylglycine (hereinafter referred to as HPG) and unreacted HPGA. Recirculation of the filtrate to the reaction vessel was stopped and instead the filtrate was introduced into a centrifuge. As described in the previous two examples, pure supernatant was used to wash the last crystals from the catalyst.

Z filtrátu sa získalo 95 % vyrobeného amoxicilínu a 98 % HPG. Amoxicilín sa ďalej čistil postupmi, známymi z doterajšieho stavu techniky.95% of the produced amoxicillin and 98% HPG were recovered from the filtrate. Amoxicillin was further purified by methods known in the art.

Katalyzátor bol vhodný na opätovné použitie, pretože sa zachovalo viac než 99 % jeho katalytickej aktivity.The catalyst was suitable for reuse because more than 99% of its catalytic activity was retained.

Reakcia sa sledovala tým istým HPLC systémom, ako bol popísaný v príklade 2, s výnimkou toho, že sa na izokratickú elúciu (1 ml/min.) zlúčenín použilo 5 % acetonitrilu v 95 % 25 mM fosfátového pufra (pH hodnota: 6.0). Tieto podmienky poskytli pre relevantné zlúčeniny nasledujúce doby zadržania (v minútach): D-4-hydroxyfenylglycín: 2.5, D-HPGA: 3.3, 6-APA: 6.0 a amoxicilín: 15.0.The reaction was monitored by the same HPLC system as described in Example 2, except that 5% acetonitrile in 95% 25 mM phosphate buffer (pH value: 6.0) was used for isocratic elution (1 mL / min) of the compounds. These conditions gave the following retention times (in minutes) for the relevant compounds: D-4-hydroxyphenylglycine: 2.5, D-HPGA: 3.3, 6-APA: 6.0 and amoxicillin: 15.0.

Príklad 5Example 5

Enzvmatická hvdrolýza D-4-hydroxyfenvlqlycinamidu (HPGA)Enzymatic hydrolysis of D-4-hydroxyphenylglycinamide (HPGA)

K zmesi HPGA (8.35 g) vo vode, nastavenej na pH hodnotu 6.0, sa pridal mokrý katalyzátor (2.25 g, podľa príkladu 1), pričom sa celkový objem doplnil do 100 ml. Hydrolýza sa nechala prebiehať pri 35 C za udržovania konštantnej pH hodnoty 6.0 titráciou 2 M kyselinou sírovou, pričom sa účinne miešalo.To a mixture of HPGA (8.35 g) in water adjusted to pH 6.0 was added a wet catalyst (2.25 g, according to Example 1), bringing the total volume to 100 ml. Hydrolysis was allowed to proceed at 35 ° C while maintaining a constant pH of 6.0 by titration with 2 M sulfuric acid while stirring effectively.

Po 3 hodinách bola HPGA úplne hydrolyzovaná na voľnú kyselinu, HPG. Kvôli katalyzátoru a obsahu čiastočne precipitovanému HPG vznikla reakčná zmes ako suspenzia.After 3 hours, HPGA was completely hydrolyzed to the free acid, HPG. Due to the catalyst and the partially precipitated HPG content, the reaction mixture formed as a slurry.

Obsah reakčnej nádoby sa preniesol do separačnej jednotky a katalyzátor sa odseparoval od reakčnej zmesi, ako bolo popísané v príklade 2. Filtrát z tejto separácie obsahoval precipitovaný HPG a kvapalinu nad usadeninou, ktorá obsahovala o.i. soli a rozpustený HPG. Celkove sa vo filtráte zistilo 96 % vytvoreného HPG. HPG sa ďalej čistil známymi postupmi.The contents of the reaction vessel were transferred to a separation unit and the catalyst was separated from the reaction mixture as described in Example 2. The filtrate from this separation contained precipitated HPG and supernatant containing o.i. salts and dissolved HPG. Overall, the filtrate detected 96% of the HPG formed. HPG was further purified by known procedures.

Katalyzátor v réakčnej nádobe sa premyl 50 mM fosfátovým pufrom (pH hodnota: 6.0) a opätovne sa použil bez signifikantnej straty katalytickej aktivity (počas syntézy a následnej separácie sa stratilo menej než 1 % celkovej aktivity) .The catalyst in the reaction vessel was washed with 50 mM phosphate buffer (pH value: 6.0) and reused without significant loss of catalytic activity (less than 1% of total activity was lost during synthesis and subsequent separation).

Na monitorovanie reakcie sa použila HPLC metóda, popísaná v príklade 4.The HPLC method described in Example 4 was used to monitor the reaction.

Príklad 6Example 6

Príprava termolvzínového katalyzátoraPreparation of thermolvzine catalyst

Termolyzín (8 g, Sigma P-1512) sa rozpustil v 25 mM fosfátovom pufri (pH hodnota: 7) na približne 50 mg proteínu na ml a približne 3750 U (pozri ďalej) na ml. Bunky z E.coli fermentácie (napr. Gebauer A. a spol., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55 - 58) sa zozbierali (pribi. 40 g suchej látky) a zahrievali sa na 100 C 10 minút, aby sa inaktivovala väčšia časť enzýmovej aktivity v bunkách. Termolyzín sa pridal k bunkám, ktoré boli imobilizované, ako to popísal Wúmpelmann, M. a spol., US patent č. 4,892,825 (Novo Industri A/S). Materiál, nesúci imobilizované bunky, sa extrúdoval a vysušil na obsah vody približne 10 %. Výsledné častice sa pomleli a pomletý materiál sa preosial. Frakcia s veľkosťou častíc 75 - 150 m sa použila ako katalyzátor v syntéze metylesteru N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu. Aktivita katalyzátora bola približne 3000 U na g. Aktivita sa merala metódou vyluhovania kazeínu (1 jednotka (U) zhydrolyzuje kazeín, aby vytvoril farebný ekvivalent 1.0 mólu tyrozínu za minútu pri pH hodnote 7.5 pri 35 C (farba činidlom Folin-Ciocalteu)) .Thermolysin (8 g, Sigma P-1512) was dissolved in 25 mM phosphate buffer (pH value: 7) to about 50 mg protein per ml and about 3750 U (see below) per ml. Cells from E. coli fermentation (e.g. Gebauer A. et al., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55-58) were harvested (approx. 40 g dry substance) and heated at 100 ° C for 10 minutes to inactivate larger cells. part of the enzyme activity in cells. Thermolysin was added to cells that had been immobilized as described by Wumpelmann, M. et al. No. 4,892,825 (Novo Industri A / S). The material carrying the immobilized cells was extruded and dried to a water content of approximately 10%. The resulting particles were milled and the milled material was sieved. A fraction with a particle size of 75-150 m was used as a catalyst in the synthesis of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester. Catalyst activity was approximately 3000 U per g. Activity was measured by casein leaching method (1 unit (U) hydrolyzed casein to produce a color equivalent of 1.0 mole tyrosine per minute at pH 7.5 at 35 ° C (color with Folin-Ciocalteu reagent)).

Syntéza_metylesteru N-benzyloxykarbonyl-L-aspartvl-L-fenvlalanínuSynthesis of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenvlalanine methyl ester

Kyselina N-benzyloxykarbonyl-L-aspartová (0.1 mólu) a hydrochlorid metylesteru L-fenylalanínu (0.25 mólu) sa rozpustili vo vode a nastavili na pH hodnotu 6.5 a konečný objem 350 ml. Roztok sa temperoval pri 40 C a pridal sa katalyzátor, pripravený, ako bolo popísané vyššie (15 g). Katalyzátor pred použitím napúčiaval vo vode, čím sa veľkosť častíc zväčšila na asi 150 - 400 m. Reakcia sa nechala prebiehať pri 40 C, pričom sa za miešania udržiavala konštánt20 ná hodnota pH 6.5. Kondenzačný produkt, metylester N-benzyloxykarbonyl-L-aspartyl-L-fenylalanínu (ZAPM), tvorí adičnú zlúčeninu s nezreagovaným metylesterom L-fenylalanínu, ktorá je veľmi slabo rozpustná vo vode. V dôsledku toho produkt precipitoval takmer kvantitatívne, ako sa postupne tvorila táto adičná zlúčenina. Po 20 hodinách sa reakčná zmes ochladila na približne 5 C a preniesla sa do separačnej jednotky, popísanej v príklade 2. Katalyzátor sa odseparoval od produktu a reakčnej kvapaliny, ako je popísané v príklade 2. Katalyzátor v reakčnej nádobe možno opätovne použiť, pretože po separačnom kroku sa zachovalo viac než 99 % celkovej katalytickej aktivity. ZAPM možno ďalej spracovať na aspartám spôsobmi, známymi ako takými (odstránením N-chrániacej skupiny aspartovej časti, kryštalizáciou, atď.) . Ma sledovanie tvorby ZAPM sa použila HPLC metóda Oyamu a spol., J.C.S. Perkin II (1981), 356.N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid (0.1 mol) and L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (0.25 mol) were dissolved in water and adjusted to pH 6.5 and a final volume of 350 ml. The solution was heated at 40 ° C and the catalyst prepared as described above (15 g) was added. The catalyst swelled in water before use, increasing the particle size to about 150-400 m. The reaction was allowed to proceed at 40 ° C while maintaining a constant pH of 6.5 with stirring. The condensation product, N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (ZAPM), forms an addition compound with unreacted L-phenylalanine methyl ester, which is very poorly soluble in water. As a result, the product precipitated almost quantitatively as this addition compound gradually formed. After 20 hours, the reaction mixture was cooled to approximately 5 ° C and transferred to the separation unit described in Example 2. The catalyst was separated from the product and reaction liquid as described in Example 2. The catalyst in the reaction vessel can be reused because after separation step, more than 99% of the total catalytic activity was retained. ZAPM can be further processed to aspartame by methods known per se (removal of the N-protecting group of the aspart moiety, crystallization, etc.). To monitor the formation of ZAPM, the HPLC method of Oyama et al., J.C.S. Perkin II (1981) 356.

Príklad 7Example 7

Enzvmatická syntéza cefalexínu v prítomnosti 2-naftolu s použitím imobilizovaného enzýmu, ktorý možno recyklovaťEnzymatic synthesis of cephalexin in the presence of 2-naphthol using an immobilized enzyme that can be recycled

E. coli s penicilín-G-acylázovou aktivitou sa fermentovala podľa Gebauera A. a spol., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55 - 58. Imobilizácia sa vykonala podľa Wumpelmanna M. a spol, US patent č. 4,892,825 (Novo Industri A/S). Látka obsahujúca imobilizovaný enzým sa extrúdovala a vysušila až do zvyškového obsahu vody približne 10 % hmotnostných. Vysušený materiál sa pomlel a frakcia s distribúciou veľkosti častíc 100 - 200 m sa z pomletého produktu získala použitím príslušných sít. V tejto frakcii sa zistila enzýmová aktivita približne 200 penicilín-G-acylázových jednotiek/g. Po napučaní vo vode bola distribúcia veľkosti častíc približne 200 - 500 m.E. coli with penicillin-G-acylase activity was fermented according to Gebauer A. et al., Bioprocess Engineering 2 (1987), 55-58. Immobilization was performed according to Wumpelmann M. et al. No. 4,892,825 (Novo Industri A / S). The immobilized enzyme-containing substance was extruded and dried to a residual water content of about 10% by weight. The dried material was milled and a fraction with a particle size distribution of 100-200 m was obtained from the milled product using appropriate sieves. Enzyme activity of approximately 200 penicillin-G-acylase units / g was detected in this fraction. After swelling in water, the particle size distribution was approximately 200-500 m.

pH hodnota zmesi (suspenzie) D-PGA.1/2H₂SO₄ (74.7 g, 0.375 mol), 7-ADCA (21.4 g, 0.10 mol) a 2-naftolu (10.8 g, 0.075 mol, veľkosť častíc < 100 m) v približne 300 ml vody sa nastavila na 6.7 pridaním 4 M hydroxidu amónneho. Pridala sa voda do 400 ml a následne imobilizovaná E. coli penicilín-G-acyláza, pripravená, ako bolo popísané vyššie (50 g na suchej báze, suspendované vo vode do celkových 100 ml) a zmes sa miešala pri 25 C.pH of D-PGA.1 / 2H ₂ SO ₄ (74.7 g, 0.375 mol), 7-ADCA (21.4 g, 0.10 mol) and 2-naphthol (10.8 g, 0.075 mol), particle size <100 m ) in approximately 300 ml of water was adjusted to 6.7 by addition of 4 M ammonium hydroxide. Water was added to 400 ml followed by immobilized E. coli penicillin-G-acylase, prepared as described above (50 g on a dry basis, suspended in water to a total of 100 ml), and the mixture was stirred at 25 ° C.

Po 3 hodinách Sa reakčná zmes vyliala na sito s otvormi 100 m, ktoré zachytilo častice nesúce enzým, zatiaľ čo zvyšná časť reakčnej zmesi, stále ešte suspenzia, cezeň prešla. Suspenzia, prechádzajúca cez sito, sa filtrovala na sintrovanom sklenenom filtri, ktorý zachytil tuhý materiál a časť kryštalizačného lúhu sa použila na premytie tuhého materiálu, ktorý zostal na 100 m site, aby sa enzýmové častice uvoľnili od všetkej priľnutej jemnej suspenzie, obsahujúcej syntetizovaný produkt. Aj výplach sa filtroval cez sintrovaný sklenený filter. Produkt, pozberaný na sklenenom filtri, sa premyl butylacetátom a suspendoval v zmesi vody (150 ml) a butylacetátu (150 ml). pH hodnota vodnej fázy sa nastavila na 1.5 pridaním 3 M kyseliny sírovej a miešanie pokračovalo 10 minút. Vodná fáza sa potom odseparovala od butylacetátovej fázy a premyla ďalším butylacetátom (2 x 20 ml). Objem vodnej fázy sa zmenšil na 75 ml odparovaním, pridal sa 2-propanol (75 ml) a pH hodnota sa nastavila na 4.7 pridaním 4 M hydroxidu amónneho. Získaná suspenzia sa ochladila na 5 C na 15 minút, načo sa tuhý materiál pozberal na sintrovanom sklenenom filtri a premyl sa vodou/2-propanolom (1:1, 25 ml) . Po sušení vo vákuovej peci pri 30 C počas 12 hodín sa získalo 33.6 g (92.4 % teoretického výťažku) monohydrátu cefalexínu vo forme bieleho prášku (čistota pomocou HPLC: 99.9 %).After 3 hours, the reaction mixture was poured onto a 100 m sieve which retained the enzyme-bearing particles while the remainder of the reaction mixture, still suspended, passed through. The slurry passing through the sieve was filtered on a sintered glass filter which retained the solid material and a portion of the crystallization liquor was used to wash the solid material remaining on the 100 m sieve to release the enzyme particles from any adhering fine suspension containing the synthesized product. The rinse was also filtered through a sintered glass filter. The product collected on a glass filter was washed with butyl acetate and suspended in a mixture of water (150 mL) and butyl acetate (150 mL). The pH of the aqueous phase was adjusted to 1.5 by the addition of 3 M sulfuric acid and stirring was continued for 10 minutes. The aqueous phase was then separated from the butyl acetate phase and washed with additional butyl acetate (2 x 20 mL). The volume of the aqueous phase was reduced to 75 ml by evaporation, 2-propanol (75 ml) was added and the pH was adjusted to 4.7 by addition of 4 M ammonium hydroxide. The resulting suspension was cooled to 5 ° C for 15 minutes, after which the solid material was collected on a sintered glass filter and washed with water / 2-propanol (1: 1, 25 mL). After drying in a vacuum oven at 30 ° C for 12 hours, 33.6 g (92.4% of theory) of cephalexin monohydrate were obtained as a white powder (HPLC purity: 99.9%).

Po použití sa enzýmové častice, ktoré zostali na 100 m site, premyli vodou (3 x 100 ml), vypustili a napokon vysušili do obsahu vody približne 10 %. Hmotnosť bola približne 50 g, a zistila sa enzýmová aktivita približne 200 penicilín-G-acylázových jednotiek/g, čo znamená, že nedošlo prakticky k žiadnej strate aktivity. Teda imobilizovaný enzým bol vhodný na recyklovanie, napr. v procese, aký bol popísaný vyššie.After use, the enzyme particles remaining on a 100 m sieve were washed with water (3 x 100 mL), drained and finally dried to a water content of approximately 10%. The weight was approximately 50 g, and an enzyme activity of approximately 200 penicillin-G-acylase units / g was found, meaning virtually no loss of activity. Thus, the immobilized enzyme was suitable for recycling, e.g. in the process as described above.

Claims

A method for separating a particulate solid catalyst from a reaction mixture further comprising another particulate solid component and a liquid, characterized in that one of the particulate solid components will have an apparent particle size that is outside the apparent particle size range of the other solid (s). the component (s), whereupon the reaction mixture is filtered or centrifuged using a device which captures the component (s) with larger particles and passes the remainder of the mixture.

Method according to claim 1, characterized in that the solid component (s) to be separated from the catalyst has an apparent particle size smaller than the lower limit of the apparent size range. of catalyst particles.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the ratio between the apparent diameter of the larger particles and the apparent diameter of the smaller particles is at least 2.

Method according to claim 2 or 3, characterized in that the apparent diameter of the catalyst particles is in the range from 25 to 10,000 µm, preferably from 50 to 750 µm, more preferably from 50 to 300 µm.

Process according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the solid catalyst is an immobilized enzyme.

The method of claim 5, wherein the immobilized enzyme is a protease, metalloprotease, serine protease, thermolysin, amidase, esterase, or acylase.

The method of claim 5, wherein the immobilized enzyme is capable of deacylating the 6-amino group of penicillin G or the 6-amino group of ampicillin. ^{8 * *}

The process according to any one of claims 1 to 4, wherein the solid catalyst is an immobilized whole cell preparation or a cell homogenate.

9. A process according to any one of the preceding claims wherein the solid product in which the starting solvent (s) is (are) dissolved in the reaction mixture is separated from the catalyst continuously during the reaction by passing a filtrate from a catalyst-only filter. a filter which captures the synthesized solid product and recirculates the filtrate from the filter to the catalyst.

of claims 2 to 8, forming in the process, the material (s) in total

A method according to any one of the preceding claims, for separating the immobilized enzyme used to catalyze the acylation of 6-aminopenicillanic acid, 7-aminocephalosporic acid, 7-amino-7-methoxycephalosporic acid, 7-amino-3-methoxy-3-cefem-4- carboxylic acid, 7-aminodezacetoxycephalosporanoic acid, 3-chloro-7-amino-3-cephem-4-carboxylic acid, 7-amino-3- (1,2,3-triazol-4 (5) -ylthiomethyl) -3- cefem-4-carboxylic acid or 7-amino-3- [2- (5-methyl-1,3,4-thiadiazolyl) thiomethyl] -3-cefem-4-carboxylic acid D-phenylglycine, D-4-hydroxyphenylglycine , 2-thiopheneacetic acid or 3-thiophenemalonic acid or amide, methyl, ethyl, propyl or isopropyl ester of D-phenylglycine, D-4-hydroxyphenylglycine, 2-thiopheneacetic acid or 3-thiophenemalonic acid, if present in the remainder of the reaction mixture. a solid material other than a catalyst when processing begins.

A process according to any one of claims 1 to 6 and 8 to 9 for separating an immobilized enzyme used to catalyze the acylation of L-phenylalanine methyl ester or D-L-phenylalanine methyl ester with N-protected L-aspartic acid from the obtained solid acylation product, if the reaction is carried out under such conditions that the formed product or a portion thereof precipitates from the reaction mixture.

A process according to any one of claims 1 to 9 for separating the immobilized enzyme used to catalyze the hydrolysis of an amide or ester of an aminocarboxylic acid to obtain the corresponding free acid or salt thereof from the obtained solid product when the reaction is carried out under conditions such that the product or a portion thereof precipitates from the reaction mixture.

A process according to any one of claims 1 to 6 and 8 to 9 for separating the immobilized enzyme used to catalyze the conversion of fumaric acid or a salt thereof into malic acid or a salt thereof from the obtained solid product when the reaction is carried out under conditions such that the product or a portion thereof precipitates from the reaction mixture.