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3u48S6 經濟部中央標準局8工消费合作社印*|衣 Α6 Β6 五、發明説明（1 ) 技術範画 本發明係有關自反應期間或反懕後之化學混合物分離微 粒固體觸媒。 發明背景 自液體分皤沈澱為熟知之程序可藉由傾倒、過漶或離心 來進行。然而，若反應混合物含兩種或多種不同固體姐份 ，則自互相之間分離固體姐份並無一般通用之方法。過溏 接著藉著將粒子分類而機械分離固體對於大部分之實務目 的不被考嫌。於一些情形可藉由機械方法如浮選而將固體 姐份彼此分離。其他方法為物化方法如抽提或分配，其利 用姐份在例如水中、酸水溶液中、鹼水溶液中或有機溶萷 中之溶解度差異。這些方法應用性之必要條件為可找到於 其中待分離之姐份為穩定之條件0 於涉及使用觸媒之工業方法中，觸媒之價格於方法之全 部經濟中為很重要之參數。因此，若觸媒可再利用而無顯 著的失去催化活性則為重要的利益。當觸媒與在反應期間 形成如副產物或所須之產物*或在全部遇程中存在例如過 最添加之固體起始物質之另外之固體姐份一起存在於反應 混合物中時*則觸媒之單離與再利用受阻礙。 於此種情形，有時可藉由會溶離除了觸媒以外之固體之 有機溶劑及/或酸或鹸抽提其他固體而單離觸媒。然而* 觸媒包括誨之活性•對於所謂觸媒毒素很敏應。觸媒毒素 藉由例如強烈地结合於觸媒或藉由將其分觸而發揮其活性 。因此，強酸與鐮通常對觸媒之活性有不利之影響，且特 -3- 本紙張X·度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 ---：---,----------(J---；---裝.一-|1---、玎-----('¥ (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) B7

第82103667號專利申請累 3〇488§ 文說明書修正頁（85年8月）A7 五、發明説明（V) 別是酶一般經暴露於高澳度之酸或鹼即受到不可逆之傷害 。此對使用酸與鹼於來自媒觸反懕之反懕混合物之逐步完 成中，當觸媒乃待再利用而無顯著失去活性時，強制某些 限制。對逐步完成條件之其他限制當然受本身可能為不穩 定化合物之所須產物之性質強制。 先前技藝無指出對上面摘要之分離問題之令人滿意之解 決0 發明概要 作為於反應後溶解除了固體觸媒以外之固體姐份並藉過 濾分離觸媒之替代法，根據本發明可將觸媒於反應被認為 已完成後或視情況以連績之方式，藉由將反應混合物過篩 或過濾而幾乎定量性地分離。於此具體實施例之特佳方式 中*使用詳细定義粒子尺寸範圍之觸媒粒子，而反懕混合 物之其他固體姐份具有小於觸媒之視粒子尺寸範圍之低限 。觸媒之分離再藉由令姐成反應混合物之漿通過鋪或過漶 其會保留觸媒粒子而令混合物之其餘部分通過。此可κ分 批或以連續之方式為之。 如精於此道者會知道的•有幾種可能性來影響待從觸媒 分離之粒子尺寸與形狀。因此，當粒子為晶II時（其為最 常有之情形），於彼等之形成當中剌烈搜拌反應混合物， 易於產生比中度攪拌較少之晶體-。影堪晶鵂生長之其他參 數為：溶劑或溶劑混合液之選擇、溫度、溫度梯度、反懕 混合物之pH值、晶骽於溶劑中之棰晶及老化。影響晶體生 長之參數對於被認為在反懕中為一定之觸媒粒子尺寸無影 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 「裝 ； 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局負工消费合作社印裝 B6 經濟部中央標準局®:工消费合作社印製 五、發明説明（3 ) 響或只有很小之影響。工業方法通常在詳细定義之條件下 進行，且因此產生具有詳佃定義之性質包括例如晶體之粒 子尺寸之產物。因此•於根據本發明之方法之實務使用中 ，於一些例子中结果為藉由使用具«宜粒子尺寸範圍之觸 媒、調整待從觸媒分離之姐份之粒子尺寸變得不必要。 固體姐份之分離，若在分離時將濾盤或筛子振動或若將 濾盤上之漿攪動則可促進。於分離觸媒後，可將反應混合 物之其餘部分於會保留固體姐份之濾器上過濾。於濾胼與 «液中所發現之所須產物之相對fi依所須產物於反應媒質 中之溶解度而定。可將濾液與《胼分開逐步處理，一些姐 份視情況與觸媒一起於製程中再循環。 • - - - · - . 因此，於本發明之最廣方面係有瞄自另包含至少一種其 他微粒固雅姐份及液賭之反應混合物中分離微粒固體觸媒 之方法，藉由使微粒固體姐份之一一具有在其他固體姐份之 視粒子尺寸範圍外之視粒子尺寸，於是使用會保留具較大 顆粒之姐份而令混合物之其餘部分通過之裝置過瀘或離心 0 於本發明之第一個較佳具體實施例中，待自觸媒分離之 固體姐份具有小於觸媒之視粒子尺寸範圍之下限之視粒子 尺寸。 於本發明之另外較佳具體實施例中，於較大粒子之視直 徑與待分離之較小粒子之視直徑之間之比至少為2 。 於本發明之另外較佳具體實豳例中*觸媒之視粒子直徑 於25至10,000微米之範圍，較佳地由50至750微米，更佳 -5- 本紙張尺度適用中國0家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 -------„----------{ -·-------裝.---L---# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 烴濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（4 ) 地由50至300微米。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固體觸媒為固定之 梅。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固髀觸媒為固定之 蛋白海。 於本發明之另外較佳具體實胞例中，固體觸媒為固定之 金羼蛋白酶。 於本發明之另外較佳具體實豳例中，固體觸媒為固定之 絲胺酸蛋白酶。 於本發明之另外較佳具賭實施例中，固體觸媒為固定之 晴熱菌蛋白酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固體觸媒為固定之 醯胺酶。 於本發明之另外較佳具體實腌例中，固體觸媒為固定之 酯酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固體觸媒為固定之 醢酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固體觸媒為能將青 徽素G之6 -胺基脫醸基化之固定之酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固體觸媒為能將安 匹西林之6 -胺基脫醸基化之固定之酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固定之酶為青饊胃 G醯基酶。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固定之酶為安匹@ -6- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂. 崃· 本紙張尺度適用中圉國家標準（CNS)肀4規格（210 X 297公货） 82丄 2〇,0〇〇 3u4S86 A6

五、發明説明（5 ) 經濟部中央標準局β工消費合作社印製 林水解_。 於本發明之另外較佳具賭實施例中•固體觸媒為固定之 全细胞製備物。 於本發明之另外較佳具體實施例中，固释觸媒為固定之 细胞勻漿製備物。 於本發明之另外較佳具體實施例中，將於起始物質完全 溶解於反應混合物中之製程中產生之固體產物，於反應期 間連續地自觸媒分離，藉由將濾液自只保留觸媒之濾器引 導至保留合成之固體產物之滤器*並自此濾器再循環至觸 媒° 於另外之較佳具體實施例中，本發明係有闞分離用來催 • · - · . . 化/3 -内醯胺抗生素核之醢基化作用（K相當於側鐽之酸 或此酸之衍生物）之固定之酶與反應潖合物之其餘部分之 方法。 … 於另外較佳之具體實施例中，本發明係有關分離用來催 化於6-胺基青徽酸（penicHlanic acid)中之6-胺基之醯 化作用之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳之具體實施例中，本發明係有關分離用於催 化7 -胺基-頭孢菌酸（cephalosporanic acid)之醯基化作 用之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外之較佳具體實施例中，本發明係有闞分離用於催 化7-胺基-7-甲氧基頭孢菌酸中之7-肢基之醸基化作用之 固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳之具體實施例中，本發明係有關分離用於催 -7 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝- 訂. -ft. 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 82丄 20,000 經濟部中央標準局8工消費合作杜印製 A6 ______B6 五、發明説明（6 ) 化7 -胺基-3-甲氧基-3-晒吩（cephem)-4-羧酸中之7 -胺 基之釀基化作用之固定之_與反應混合物之其餘部分之方 法。 於另外較佳之具體實施例中’本發明係有關分離用於催 化7 -胺基-脫乙醯氧基頭孢菌酸中之7_胺基之醢基化作用 之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外之較佳具體實施例中’本發明係有關分離用於催 化3-氛-7-胺基-3-晒吩-4-羧酸中之7-胺基之醯基化作 用之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用於催化 7-胺基-3-(1,2,3-三唑-4(5).基硫甲基）-3-哂吩-4-羧酸 中之7-胺基之醢基化作用之固定之酶與反應混合物之其餘 部分之方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用來催化 7-胺基-3-[2-(5-甲基-1,3,4-噻二唑基）硫甲基]-3-哂 吩-4-羧酸中之7-胺基之醸基化作用之固定之酶與反應混 合物之其餘部分之方法。 於另外較佳之具體實施例中，本發明係有關分離用來催 化/9 -內醯胺抗生素核之醢基化作用（MD-苯基甘胺酸為 皤化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實腌例中·本發明係有闞分離用來催化 /3 -内醯胺抗生素核之醢基化作用（MD -苯基甘胺酸之衍 生物為醢化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方 法。 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82丄 20,000 -------------C ---------裝.---^---.ΤΓ (諸先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 五、發明説明（7 ) A6 B6 催醣法 來酸方 用胺之 離甘分 分基部 笨餘 D-其 Μ之 ί物 用合 本作混 ，化應 中基反 例醣與 施之酶 實核之 體素定 具生固 佳抗之 較肢} 之醣劑 外内化 另-醢 於々為 化胺 闞 有 係 明 發 離 分 顒 有 係 明 發 甘分 基部 苯餘 D-其 以之 ί物 用合 本作混 ，化應 中基反 例醯與 施之_ 實核之 體素定 具生固 之抗之 佳胺} 較醢劑 外内化 另 I 醢 於点為 化酯 催丙法 來酸方 用胺之 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 催丙 來異 用酸 離胺 分甘 關基 有苯 係D-明Μ 發ί 本用 -作 中化 例醢 施之 實核 體素 具生 之抗 佳胺 較醢 外內 另-於点 化 法 方. 之 分 部 餘 其 之 物 合. 混 應 反 與 之. 定 固 之 )/ 劑 化 醢 為 酯

化酸 0胺 來甘 用基 離苯 分羥 腰 4 有D-係Κ 明 ί 發用本怍 ，化 中基 例醸 施之 實核 體素 具生 佳抗 較瞭 WM QHU 夕醮 另内 於 I 。化 法催 方來 之用 分離 部分 餘關 其有 之係 物明 合發 混本 應， 反中 與例 酶施 之實 定體 固具 之佳 丨較 劑外 化另 醢於 為 酸分 胺部 甘餘 基其 笨之 羥物 4-合 D-混 Μ懕 {反 用與 作酶 化之 基定 釀固 之之 核} 素劑 生化 抗醢 胺為 醢物。 内生法 I 衍方 之之 --裝- 訂· Λ 經濟部中央標準局®工消费合作社印® 甘分 基部 苯餘 羥其 4-之 D-物 Μ合 ί混 用應 本作反 ，化與 中基梅 例醢之 施之定 實核固 體素之 具生} 佳抗劑 較胺化 外醯醸 另內為 於 I 胺 Λ- 0 來 用 離 分 關 有 係 明 發 化酸方 催胺之 法

Jga 催 來 用 離 分 關 有 係 明 發 本 中 例 施 實 體 具 之 佳 較 外 另 於 82.1. 20,000 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 化冷-内皤胺抗生素核之醢基化作用（KD-4-羥苯基甘胺 酸甲_為醣化劑）之固定之_與反應混合物之其餘部分之 方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用來催化 /0-内醢胺抗生素核之釀基化作用（MD-4 -羥苯基甘胺酸 乙酯為醢化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方 法。 於另外較佳之具體實施例中，本發明係有闞分離用來催 化/3 -内醢胺抗生素核之藤基化作用（KD-4 -羥苯基甘胺 酸丙酯為醸化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之 方法。 ...... 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用來催化 /9 -内醢胺抗生素核之醣基化作用（M D-4-羥苯基甘胺酸 異丙醚為醢化劑）之固定之酶與_反應混合物之其餘部分之 方法。 於另外較佳具賭實施例中*本發明係有藺分離用來催化 /3-內醢胺抗生素核之醢基化作用（M2-硫苯乙酸為醯化 劑）之固定之酶與反應混.合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實施例中*本發明係有瞄分離用來催化 /9 -内醢胺抗生素核之醢基化作用（M2-硫苯乙酸之衍生 物為醢化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法 〇 於另外較佳具艄實施例中*本發明係有闞分離用來催化 冷-內醱胺抗生素核之醢基化作用（以2 -硫苯乙酸醣胺為 一 10- 本紙張Λ度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝. 訂· 砵·

Su4S86 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裂 五、發明説明（9 ) 醯化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具SS實施例中*本發明係有闞分雛用來催化 冷-内醢胺抗生素核之醣基化作用（M2 -硫笨乙酸甲酯為 醢化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有闞分離用來催化 卢-内醯胺抗生素核之醯基化作用（M2 -硫苯乙酸乙酯為 醯化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用來催化 /3-内醸胺抗生素核之醢基化作用（M3 -硫苯丙二酸為醢 化劑）之固定之酾與反應混合物之其餘部分之方法。 於另外較佳具體實施例中，本發明係有關分離用來催化 冷-内醯胺抗生素核之醣基化作用（K 3-硫笨丙二酸之衍 生物為醢化劑）之固定之酶與反應混合物之其餘部分之方 法。 於另外較佳具Si實施例中，本發明係有關分離用來催化 L-苯基丙胺酸甲酯之醢基化作用（ML-天冬胺酸衍生物， 其中將胺基加K保護）之固定之酶與反應混合物之其餘部 分之方法。 於另外較佳具體茛施例中·本發明係有瞄分離用來催化 D.L-苯基丙胺酸甲醋之醢基化作用（以L-夭冬胺酸衍生物 ，其中將胺基加Μ保護）之固定之酶與反應混合物之其餘 部分之方法。 於另外較佳具艄實施例中，本發明係有瞄分離用來催化 胺基羧酸之醯胺或酯之水解作用以提供對應之自由態酸或 -11- 本紙張Α度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 il·---.----------CL —,—裝-—^—訂-----{奸 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) A6 B6 經濟部中央標準局βκ工消費合作社印製 五、發明説明（10) 其鹽之固定之_與反應混合物之其餘部分之方法·其中水 解反應係在所形成之產物或其部分會自反應混合物中沈狼 出來之此種條件下進行。 於另外較佳具體實施例中·本發明係有關分離用來催化 富馬酸或其鹽之轉化成蘋果酸或其鹽之固定之酶與所得之 產物之方法，其中反應係在所形之產物或其部分會自反應 混合物中沈溅出之此種條件下進行。 發明之詳细說明 根據本發明之分離方法，當欲將不均勻的觸媒例如固體 、微粒、固定之海自另包含至少一種其他之微粒、固體姐 份之反應混合物中分離時特別有用。此其他之微粒、固體 姐份可或為在觸媒影堪下合成之產物•或可為未反應之起 始物質，例如以過量添加之起始物質。於本專利說明書中 ，產物一宇當未另外特定時，甫指所須產物或由反應產生 之副產物。 當觸媒為反應之開始時存在於反應混合物中之唯一之固 體姐份，且產物在反應混合物之液體部分中為微溶時，可 藉由使固體產物粒子具有在固體觸媒粒子之視粒子尺寸範 圍外之視粒子尺寸，因此使用會保留具有較大粒子之姐份 而令反應混合物之其餘部分通過之濾器或離心機將反應混 合物過濾或分離而自反應混合物中分離觸媒。於下面將反 應混合物之液體部分定名為、、反應液體〃或只是、、液體〃 。反應液體因此包括反應於其中進行之溶劑（或溶劑混合 物）*及起始物質之溶解之部分及為固體或液體之產物。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂. -ft. 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 82.1. 20,000 烴濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（11 ) 當固體產物係在起始物質完全溶解及產物粒子小於觸媒粒 子之製程中產生，則觸媒自反應混合物之其餘部分中分離 *可K連鑛之方式進行，藉由自只保留觸媒之濾器將濾過 物引導至保留合成之固體產物之濾器，並使來自此滹器之 濾過物再循環至觸媒。K此方式，反應之平衡受影響朝向 較高產率。 一種或多種起始物質可能難溶於進行反應之溶劑中。於 此情形，起始物質可Μ固體型式存在於反應混合物中，那 麽反應液體將為有闞之姐份所飽和。若得自反應之產物易 溶於反應液體，則在逐步處理中待由本發明解決之問題為 自含有固體，未反應之起始物質.之反應液體中分離觸媒。 若產物亦為難溶於反應液體*則在將觸媒與反應混合物之 其餘部分分離後•必須將產物與未反應之起始物質互相分 開。 · 粒子像晶體之真正尺寸可藉由例如使用裝有適宜尺度之 顯微鏡測定。粒子有許多種不同形狀。因此晶體可為例如 針狀、板狀或立方體。於本文中重要之特性並非粒子之真 正尺寸而是例如記述為視直徑之視尺寸。於本專利說明書 中名稱"視尺寸"或 ''視直徑"用來反映粒子在篩子或濾 器上之行為如何。因此，粒子之視直徑相當於在實用上恰 容許粒子自其通過之洞或孔之直徑。於本發明之較佳具體 實施例中，將觸媒之粒子尺寸盡量降低至分離過程所容許 。此有助於確保觸媒之高活性及有助於消除散布之問題。 熟知的是在觸媒之影響下進行之許多製程為很特異性的 -1 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 ---Γ---.----------·( I---;---裝---Ϊ---訂-----·( # (特先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（12) 且彼等Μ很高之產率，特別是若觸媒為酶時。本方法之好 處之一為可將觸媒再利用。由於使用很溫和之條件來分離 觸媒與反應混合物之其餘部分，觸媒活性之損失通常很小 。高產量係由本方法為棰適合供每體積單位之反應混合物 有如此大量之起始物質存在以致其一部分最初可能以固體 型式存在之下進行之反應使用之事實所提供。 根據本方法待使用之固賭觸媒可Κ微粒固定之酶製備物 之型式存在，且可具有比反應液體高或低之密度。於此製 備物中，酶可被吸附、吸收、共價结合、截留或藉由離子 力结合。固定酶之方法已知於技藝界。已知之技藝亦提供 製備載送固定之觸媒例如酶之粒子及根據微粒固賻之粒子 尺寸分佈而單離其各種鈒分部分之方法。待使用於各情形 之特異性觸媒依待進行之製程而定。 本發明之方法一般於水中進行。視需要亦可加有機溶劑 。有櫬溶劑較好選自與水可互溶溶劑如甲酵、乙醇、1-丙 醇、2-丙醇、卜丁醇、1,4-丁二酵、丙爾、乙腈、二 甲基甲醣胺及二甲亞碾。 如前所提，當形成固體產物時•溫度為影響粒子尺寸之 參數之一。此可因為晶體之生長速率依溫度而定，或於一 些情形中由於於不同之溫度下發生不同的晶體修飾。反應 液體之凝固點形成供進行本發明方法之絕對之溫度下限。 若使用之觸媒為固定之酶•則供進行本發明方法之絕對之 溫度上限通常依酶而定。 於本發明導致重要改進之特殊方面之實例為·· 1)半合成 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂. U4S86 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（13) 之育徽素類與頭孢菌素類之製備，2)醢胺與酯之水解及 3)肽之合成。 可使用本發明之方法有利地製備之；8 -內醢胺抗生素（ 青徽素類與頭孢菌素類）之實例為安匹西林、阿萁西林 (amoxici丨1 in) 、α -羧基唾吩、青嫌素、氯頭孢菌素、 頭孢三嗪、頭孢哌羅、頭孢氨苄、羥氨苄頭孢菌素、頭孢 菌素1Π、及噻孢徽素納。 現在，工業上藉由化學方法製備半合成之/9 -内醯胺。 青徽素類例如藉由將通常將其羧基加Μ保護之6-ΑΡΑ與活 化之側鏈衍生物反應，接著藉水解除去保護基來製備。因 此，安匹西林可藉由將加以適宜地保護接酸基之6-ΑΡΑ與 D-苯基甘胺醢基氯反應，接著Μ水解除去保護羧酸基之基 。這些反應典型地包括費用高之步驟如使用低於〇Ό 之溫 度（於某些情形甚至低於-2510)，矽烷基化試劑及有機溶 劑如二氯甲烷*其必須小心處理，因彼等有礙健康且對環 境有害。 藉由MD-苯基甘胺酸或D-4-羥苯基甘胺酸之衍生物（如 低碳烷基酷）將/3 -内醣胺核醯基化而海促性製造半合成 之/3 -内醸胺抗生素為已知，例如DE專利申謫案第 2,1 63,792號，AT專利第243,986號，NL專利申請案第 70-091 38號，DE專利申請案第2,621,618號及EP専利申請 案公告第339,751號。於先前技蕤中所述之方法典型地於 D-苯基甘胺酸衍生物低於300raM及/3-內皤胺核低於 25mM之濃度下進行。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 82.1. 2〇,〇〇〇 (請先閲讀背面之注意事項再場窝本頁) -裝| 訂. Λ A6 B6 經濟部中央標準局β工消費合作社印製 五、發明説明（14) 此相當低濃度之起始物質為酶促性製造半合成点-內醢 胺抗生素之這些已知方法（尚無一者被用於工業規模）之 可能之缺點，因其使得單離所形成之点-內醢胺抗生素更 加困難且因此花費更大。再者，所報告之產率低，典型地 少於85»；，且須要將未反應之/3-內皤胺核再循環之程序 •其導致更多且更花費之單元操作。 於半合成yS -内醢胺抗生素之梅促性合成中增加靼始物 質之澹度所遇到之問題之一為一些涉及之起始物與在反應 時形成之產物之溶解度相當低。因此*為了在經濟上更有 利之條件下進行製程，必須在反應開始時具有如此多之起 始物質存在，Μ致其不能完全地溶於反應液體中。而且， 所形成之產物可能以固體型式分離，因每體積單體產生之 大量可能不完全溶於反應液體中。當進一步之逐步處理可 能包括有害於酶活性之條件例如於低出值（例如於0.5 -2.0之出值）溶解產物與未反應之起始物質，則必須將觸 媒在反應混合物之其餘部分進一步逐步處理Μ前，從含有 固體產物及/或未反應之起始物質之反應混合物中分離。 用來引入側鐽於卢-内醯胺抗生素核内亦即引入醢基於 青徽素類之6 -胺基中或頭孢菌素類之7 -胺基中之醸化劑可 為對應之酸或其衍生物，例如其低碳烷基（甲基、乙基、 丙基或異丙基）酯或一鈒、二級或三級醢胺。甲酯、乙酯 及醯胺為佳。衍生物可以自由態型式或Μ鹽形式例如HC1 鹽或H2S〇4鹽使用。 待使用之酶可為催化有關反應之任何之酶。此種酶通常 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂· -1 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 82.1. 20,000 304S86 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（15) 稱為育徽素醣胺酶、青徽素醢酶、或甯徵素水解_。已知 具有此活性之許多微生物之_自例如_捍菌_、i單胞菌.、 Hv^oplana 、精朊捍菌臑、氣屋睢菌（DE專利申請案第 2,163,792號）假厘胞菌（AT惠剎笛243 · 986號）、音梅 ||_(NL専利申請案第 70-09138) 、A d h a η o c 1 a d i u m 、頭孢 菌_(DE專利申請案第2,621,618號）、巴氏醋桿菌（DE專 利申請案第2,163,792 6)、混濁_稈菌（1'31^1133»1丨等人 ，Biochem. J. 137(1974), 497-503)、大產假單胞菌 (Pseudomonas melanogfinum) (Kim & B y u η , B i o r h i m. R i 〇 p h v s . Acta · 1040(1990), 12-18)、柑桔黃單胞菌（ EP專利申請案公告第.339,75丨號）、Kluyvera citrophila (Qkachi 等人 » A g r . Biol . Π h em ., 37 (1 973), 2797-2804)、大腸桿菌（DE專利申誧案第 2930794 號）及巨大穿抱捏菌（dhiang & Bennett, J. Bacteriol·, 93(1967), 302)衍生。 於與反應混合物之其餘部分分離後，觸媒可再被利用， 視情況於通過洗滌遇程之後再利用。可分離產物及視情況 分離未反應之起始物質，並分開逐步處理或分別再循環。 可用本發明方法有利的製備之肽實例為H-苄氧羰基- L-天冬胺醢基-L-笨基丙胺酸甲酯，於下面定名為ZAP M. ZAPM為製造甘味劑阿斯巴甜（aspartame)之主要中間物。 於阿斯巴甜（L-α -天冬胺醢基-L-笨基丙胺酸甲酿）之 製造中，決定性步驟之一包括_催化之天冬胺酸衍生物與 笨基丙胺酸甲醋鹽酸鹽之偶聯（例如偶聯苄氧羰基-L- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝· 訂_ 冰· -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格（210 X 297公® ) 82.1. 2.0,000 經濟部中央標準局8工消費合作社印製 A6 _____B6_ 五、發明説明（16) 天冬胺酸與L-苯基丙胺酸甲醏鹽酸鹽）形成ZAPM°ZAPM與 L-苯基丙胺酸甲酯（或D-苯基丙胺酸甲酷，若存在的話） 形成極難溶之加成化合物，而因此在合成時沈澱。反應之 平衡因此向縮合反應移動。 根據先前技藝，於縮合步驟中可使用半纯化、可溶性酶 製備物（例如嘈熱菌蛋白_)為觸媒。為分開酶與反應產 物，將反應產物溶解而藉由加有機溶劑（例如丙酮）將_ 沈澱並除去，例如藉由遇濾。然而*在此過程中失去由 14!«至高達至少60S：之酶之催化活性（Nonaka等人，美國 專利第4,212,945號，及Me ijer等人於有機合成中之生 物觸媒〃（編.輯者：T r a m p e r n d.e r .P 1 a +s a n d

Linko), pp. 1 3 5-156(1985))。活性之主要流失發生於酶 之沈澱與單濉之時。 使用根據本發明具有固定之嗜熱菌蛋白酶製備物於上述 製備ZAP Μ過程中之方法，簡化分離步驟而因此降低於分離 步驟中之酶活性之流失至約1!«。 本發明進一步藉由下面實伊·!說明，然而其並非被解釋為 限制保護之範圍。揭示於前述於下面實例及申請專利範圍 中之特微，分開地及Μ其任何姐合，皆為使本發明以其各 種型式實現之資料。 實例] 谪官合成θ -肉醸防類之豳媒夕郸谌 將得自大腸桿菌之固定之青徽素G醢酶（250克， Eupergit^-PcA，得自 Roha Pharma)藉由水洗於 300 微米 -18- 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)甲4规格(210 X 297 ^ " 82.1. 20 000 (請先閲讀背面之注意事項再§本頁) _裝| 訂. A6 B6 經濟部中央標準局S工消费合作社印製 五、發明説明（17) 篩上過篩再於180微米篩上篩埋。將留在180微米篩上之 物用於提供於下面實例2-5中之酶觸媒。當箱由 Balasinghao 等人於 R ί ο π h i m. R i o d h v s . Acta. 276 (1972) 250-256中所述之4-二甲胺基苯甲醛方法測定 時，觸媒之活性為每克之潮濕觸媒有115青徽素G醢酶單 位⑻。 實例2 安匹西林之瞄促桦合成 將D -苯基甘胺酸甲酯（於下面定名為D-PGM)及6 -胺基青 徽酸（下面定名為6-APA)懸浮於具出值6.0之50raM磷酸鹽 緩衝液，D-PGM與6-APA之最後濃度分別為450mM與 1 00 mM 。使懸浮液之溫度至35t：並加10.0克潮濕之固定之 酶（根據實例1 )，總賭積為100亳升。令反應進行並於 35C下有效的播拌，藉由K2M IUS04滴定使出值維持於 6.0 〇 於約0.5小時後，D-苯基甘胺酸（於下面定名為D-PG) 開始從反應潖合物中沈澱，且於約3小時後，安匹西林濃 度達最大之77raM，相當於6-APA之85¾轉化。於此時，將 反應容器之内容物移至具有100微米孔徑之篩為底及在篩 子之正上面放置有旋轉之螺旋槳之濾器單元。固定之酶被 篩子保留而漿之其餘部分則通過。於此濾過物中之沈澱由 含一些安匹西林之D -苯基甘胺酸晶體及含溶解之產物與未 反應之起始物質之液體所姐成。形成之安匹西林晶體具少 於50微米之粒子尺寸。將濾液（亦即含晶體與反應液體之 -19- 本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS)甲4规格（210 X 297公轻） 82.1. 20,000 (請先Μ讀背面之注意事項再塡寫本頁) 装· 訂. 線· \ A6 ____ ._B6__ 五、發明説明（18) 漿）離心，用澄清心離心液來洗去留在觸媒上之晶體。藉 由調整來自分離單元之濾過物之流動及至分離單元之澄清 上清液之流動，使觸媒於分離期間所有時間皆保持於懸浮 液中。當在觸媒部分不再看到晶體時*將槽完全排乾*只 留下觸媒於篩上。 於分離後，於合成中形成之97!«之安匹西林與95S5之 D-PG乃在濂液中。將安匹西林單離且藉已知方法再純化。 將留在分離單元中之觸媒M50mM磷酸鹽媛衝液（出值： 6.0)洗，再根據實例1中所提之方法測定其活性。如表1 中所指示•在合成後無顬著的流失觸媒活性，因此觸媒適 宜再使用。 表1 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 丨案· 觸媒之畜.京 妖袢丨丨/克 使用前 10.00 1 1 B . 0 使用一汝後 9 - RR 1 1 4 . B 反應钿份夕HP Ι.Π分析 訂 線· 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 管柱：1{卩[(：-18,(25〇\4.6毫米；5微米）， 溶離劑六：251!^磷酸》緩衝液，出值6.5。 溶離劑B :乙腈 根據表2M溶離劑A與B之混合液做溶雔。 ~ 2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐j 82.1. 20,000 $04386 A6 B6 經濟部中央標準局8工消费合作社印製 五、發明説明（19) 表2 蒔間，分 % A 0^ 1 0 9Q-> 90 10^ 20 80 99 99 流速：1奄升/分 UV於215微米檢測 滯留時間以分表示：D-PG:4.1, 6-ΑΡΑ:8,1 ，安匹西林 :13 . 9, D-PGM:18 。. . 實例3 踊孢親竿> _伢袢会成 將D-苯基甘胺酸甲賭HC1鹽（ 1.6526克）及7-胺基脫乙 醢氧基頭孢菌酸（7-ADCA) ( 0.4278克）溶於50mM磷酸鹽緩 衝液（pH值：6.5)並保持恆溫至35C。加根據實例1之酶 觸媒（2克）並K媛衝液調節反應棍合物之體積至2 0奄升 。令反應於有效之攪拌下進行，保持出值及溫度恆定。 於加酶觸媒後約45分，形·成沈澱並於另20分後停止播拌 ，將反應容器之内容物移至實例2中所述之過濾單元，自 形成之沈澱與反應液體分雔觭媒。自含有頭孢氨苄、D-笨 基甘胺酸、D -笨基甘胺酸甲酯及7 -胺基脫乙醯氧基頭孢菌 酸之沈澱及反應液體，單離頭孢氨苄並藉已知方法纯化。 於分離步驟後留於觸媒中之催化活性大於99¾ ，因此諝 -21- 本纸張尺度適用中8國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20.000 IT---.----------------^---1——#-----^ ^ (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（20) 媒適宜再使用。在觸媒再使用前可加入洗滌步驟。 反應接著使用如同實例2中所述之條件做HP LC。 7-ADC A與頭孢氨苄之滯留時間烴發現分別為6.3與13.4分 Ο * 實例4 筠親苄畜锺素之瞄伢抻合成 製備D-4-羥苯基甘胺酸醢胺（ 44.94克，於下面定名為 HPGA)及6-ΑΡΑ(14·30克）於50πιΜ磷酸鹽媛衝液（出值： 6.5)中之漿•並於裝備有100微米孔徑篩為底及在篩之正 上面放置有旋轉之螺旋槳之反應器中使恆溫至25C。藉由 加40克觸媒（根據實例1)(最後體積：400奄升）來開始 反應，在反應時藉由2Μ H 2S〇4滴定將出值維持一定。在篩 下之贈積少於15毫升並藉肋於泵，使濾過物（含反應液體 及起始物與產物之晶體）在整痼過程中不斷回至反應器之 頂端。 10小時後，羥氨苄青徽素之濃度達相當於85ίΚ轉化之最 高點*且反應混合物含有羥氨苄胄徽素之晶體、D-4-羥苯 基甘胺酸（於下面定名為HPG)及未反應之HPGA。停止濾液 之再循環至反應器而替代地將濾過物導至離心機。如前兩 例中所述，用澄清之上清液自觸媒洗去最後之晶體。 自濾過物中回收95¾產生之羥氨苄冑嫌素及98S；產生之 HPG 。羥氨苄青徽素再藉已知於技藝中之方法純化。 所用之觸媒因保留其催化活性之99¾:以上*適宜再使用 (請先聞4RSP面之注意事項再填寫本頁) .丨束· 訂· .線. -22- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 2.0,000 經濟部中央標準局BK工消費合作社印製 -23- 本紙張適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） A6 B6 五、發明説明（21) 反應接著使用如實例2中所述之HPLC糸统*除了使用 5!K乙臃於95X 25»M磷酸鼸緩衝液（出值：6.0)做化合物之 單液法溶離（1亳升/分）以外。這些條件提供下列有闞 化合物之滞留時間（K分表示）：D-4-羥笨基甘胺酸： 2.5 ，D-HPGA:3.3, 6-APA:6.0 及羥氨苄青擞素：15.0。 實例5 Π-4-筠笼某甘昉除18防（ΗΡΠΑ)^醻促抻水解 於HPGA ( 8.35克）於水中（調至6.0之pH值）之混合物 中，加潮湄觸媒（2.25克•根據實例1)將缌體積調至 100奄升。令水解作用於35t：下進行，並藉由2M硫酸滴定 保持出值一定，同時維持有效之攪拌。 3小時後，HPGA完全水解成自由態酸。由於觸媒及部分 沈澱之HPG之容量，反應混合物顯現為漿狀。 將反應器之内容物移至分離箪元，如實例2中所述自反 應混合物分離觸媒。自此分離之滤過物包括沈澱之HPG及 包含鹽及溶解之HPG之上清液。於滹過物中發現總共96X 之形成之HPG 。再將HPG藉已知方法纯化。 反應器中之觸媒K50mM磷酸篇媛衝液（出值：6.0)洗並 再使用而無顯著的流失催化活性（於合成及後績之分離中 ，流失少於1«之缌活性）。 用實例4中所述之HPLC方法監测反應。 實例6 睹埶菌番鳙姐夕脚備 將晴熱菌蛋白_ (8克，Sigma Ρ-1512)溶於25mM磷酸 82丄 20,000 ------.----------「111:----装---訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 304886 A6 B6 五、發明説明（22 ) 籩緩衝液（pH值：7)至約每奄升50毫克蛋白質及約每奄升 37501H見以下）。採集得自大瞬桿菌發酵之细胞（例如 A · G e b a u e r 等人，Β ί 〇 p r 〇 c e s s E n g i n e e r i n g (1 9 8 7) 55-58)(約40克之乾物）並加熱至lOOt：歴10分使细胞中 大部分之_活性不活性化。將唯热菌蛋白酶加至如 Wumpelmann,M.等人於美國專利第4,892,825 號（頒予 Novo Industri A/S)中所述般被固定之细胞。將載送固定 之细胞之物質擠壓並乾煉至約10»水含量。將所得粒子碾 磨並將碾磨之物質遇篩。使用75-150微米粒子尺寸部分作 為合成N-苄氧羰基-L-天冬胺醣基-L-苯基丙胺酸甲酯之 觸媒。觸媒之活性約為毎克3000U 。活性藉由酪蛋.白消化 法測量（1單位（10於7.5之出值、35Ό下每分鐘將水解 酪蛋白產生相等於1.0微莫耳酪胺酸之顔色（由Polin-Ciocalteu試劑產生顔色））。 N-笮氬糖某-丨，-壬客防醣某-I.-栄某丙胺除甲酯之合成 (請先聞$面之注意事項再填寫本頁)

T -丨裝. 订· 經濟部中央標準局與工消費合作社印製 將N-苄氧羰基-L-天冬胺酸（0.1莫耳）及L-苯基丙胺 酸甲酯鹽酸鹽（0.25荑耳）溶於水並調至出值6.5及最後 髑積350奄升。將溶液恆溫於40p，加如上述製備之觸媒 (15克）。使用前將觸媒於水中膨脹，藉Κ將粒子尺寸增 至約150— 400微米。令反應於40t：進行，保持出值一定於 6.5並維持有效的低切力播拌。縮合產物，N -苄氧羰基 -L-天冬胺醢基-L-笨基丙胺酸甲酯（ZAPM)與未反應之 L-笨基丙胺酸甲醏（具很差之水溶解度）形成加成化合物 。於是當此加成化化合物慢慢地形成，產物幾乎定量性地 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 -f深· 304886 A6 B6 五、發明説明（23 ) 沈澱。於20小時後，冷卻反應混合物至約5¾ 並移至實例 2中所述之分離單元。如實例2中所述自產物反應液體分 離觸媒。當分離步驟後仍保留大於99S；之總催化活性時， 則於反應器中之觭媒可再使用。ZAPM可藉由本身已知之方 法（天冬胺部分之N-保護基之除去，结晶等）再處理成阿 斯巴甜。在形成ZAPM後使用Qyana等人，J.C.S· Perkin I (1981 ) 356ilHPLC 方法。 實例7 2 -蓉酚存亦下使用可®循播之固宝之IS醮促性合成頭 (請先閲讀背面之注意事項再f本頁) 經濟部中央標準局8工消費合作社印製 根據 Geb.auer, A..等人 Bioproces. s Engi.neering 2 (1987 ) 55-58將具有青徽素G釀酶活性之大腸桿菌發酵。 根據1^«^61|831111,><.等人美國專利第4,892,825號（預予 Hovo Industri A/S)做固定。將含固定梅之物質擠壓並乾 煉直至殘餘水量約lOXU/w)。將乾燦之物質碾磨，並藉由 使用適當之篩子，自經碾磨之產物得具有100-200微米之 粒子尺寸分佈之部分。於此部分之酶活性經發現約為20 0 育緻素G藤海單位/克。於水中膨脹後，粒子尺寸分佈約 為200-500微米。 將 D-PGA. 1/2H2S04(74.7克，0.375 莫耳）、7-ADCA ( 21,4克* 0.10莫耳）及2-萘酚（10.8克，0.075莫耳，粒 子尺寸<100微米）於約300奄升水中之混合物（漿）之出 值，藉由加4M氫氧化銨調至6.7 。加水至40 0毫升接著固 定如上述製備（將基於乾燥者50克懸浮於水至缌共100毫 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 裝 訂 琛 A6 B6 經濟部中央標準局B工消費合作社印製 五、發明説明（24) 升）之大腸桿菌青徽素G醢梅，再將琨合物於25 t：攪拌。 3小時後，反應混合物例於1〇〇微米孔徑篩上，其保留 載送酶之粒子而反應混合物之其餘部分（仍為漿狀）通過 ，將通過篩子之漿於保留固體物質之燒结玻璃濾器上遇滤 ，且用一些母液洗留在100微米篩子上之固體物質，K自 含合成產物之任何吸著性细漿中洗去酶粒子。將收集於玻 璃濾器上之產物以乙酸丁酯（200毫升）洗，再懸浮於水 (150毫升）與乙酸丁酯（150毫升）之混合液中。水相 之pH值藉由加3M硫酸調至1.5 ，並繼績攪拌10分。再將水 相與乙酸丁酯栢分離並再以乙酸丁酯（2X20毫升）洗。 水相之體積藉由蒸發減至75毫升，加2-丙醇（75毫升）， 並賴加4M NfUOH將pH值調至4.7 。將所得之漿冷至5"0 歷 15分•於是將固體物質收集於熗结玻璃濾器上，並K水/ 2-丙酵（1:1 ，25毫升）洗。於真空烘箱内30¾乾燥12小 時後，得33.6克（理論產率之92.4¾)—水合頭孢氨苄為白 色粉末（由HPLC之純度：99.9%)。 使用後，將留在100微米篩上之酶粒子Μ水（3X100微 升）洗、令水排乾，最後乾堍至水含量約10S：。重最約為 50克，且酶活性經發規約為200青黴素G醢酶單位/克， 指示在實際應用上並無流失活性發生。因此，固定之酶適 宜例如於上述之製程中再循環。 (請先閲讀背面之注意事項再$本頁) •丨裝. 訂· 線· -26- 本紙張Α度適用中國國家樣事（CNS)甲4規格（210 X 297公楚） 82.1. 20,000

Claims (1)

1. + , a修正 公告本 D8 86·1·28 補充 第82103667¾專利申誇案 六、申請專利範圍 304886 κ 一種自另含他種徴粒固《姐分與液《之反應混合物中分 難微粒固«固定醃之方法*其特徵為使該固定_之視粒 子直徑介於25至10,000微米、待與固定酶分離之》粒固 β姐份具有小於固定酶視粒子尺寸範下限之視粒子尺 寸、且固定藹粒子之視直徑與持分離撤粒固《组份之視 直徑比例至少為2 ，並使用會保留固定酶而令混合物其 餘部分通過之設備遇濾或齄心反應混合物。 2. 根據申謫專利範圍第1項之方法•其中固定_之視粒子 直徑介於50至750微米。 3. 根據申請専利範圏第2項之方法，其中固定酶之視粒子 直徑介於50至300微米。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該固定酶為蛋白 酶、金JS蛋白梅、絲胺酸蛋白_、嘈熱菌蛋白_、醣胺 酶、酯梅或醯_。 5- 根據申請専利範圍第4項之方法，其中該固定酶能將育 徽素G之6 -胺基或安匹西林之6 -胺基脫釀基化》 6. 根據申請專利範園第1項之方法*其中於固定，為固定 之全细胞或细胞勻漿製備物。 7. 根據申讅專利範圔第1或2項之方法，其中將於起始物完 全溶解於反應混合均之製程中產生之固體產物·於反應 中鞴由將自只保留固定酶之《器之濾遇物引導至保留合 成之固«產物之濾器並將自此濾器之濉遢物再循環至固 定酶連鑛地自固定酶分離。 8. 根據前述申請専利範園第1或2項之方法*當開始逐步處 t適用中國國家標準（CNTS > Α4規格（210X297公釐） I.-------丨裝----:—V-----1線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本I) 經濟部中央標準局員工消費合作社 304886 H C8 D8 、申請專利範圍 9. 10 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 11 s時有除了固定梅以外之固鱷物質存在於反應混合物中 時*供分離用於催化6-肢基青徽酸、7-胺基頭孢菌酸、 7-胺基-7-甲氧基頭孢菌酸、7-胺基-3-甲氣基-3-哂 吩-4-羧酸、7-胺基脫乙酺氧基頭孢菌酸、3-氯-7-肢 基-3-晒吩-4-羧酸、7-胺華-3-(1,2,3-三唑-4(5)-基 碕甲基）-3-晒吩-4-羧酸或7-胺基-3-[2- (5-甲基 ~1，3,4-噻二唑基）磓甲基]-3-哂吩-4-羧酸之醢基化 反應（MD-苯基甘胺酸、D-4-羥苯基甘胺酸、2-碕笨乙 酸或3-疏笨丙二酸或D-苯基甘胺酸、D-4-羥苯基甘肢酸 、2-碕苯乙酸或3-疏苯丙二酸之醮胺、甲酯、乙酯、丙 酯或異丙酯）之固定酶與反應混合物之其餘部分。 根據申請專利範園第1,2或3項之方法，當反應在所形成 之產物或其一部分會自反應混合物中沈澱之條件下進行 時•供分離用於催化L-笨基丙胺酸甲醣或D,L-苯基丙胺 酸甲酯之醢基化反應（Μ N-經保譆之L-天冬胺酸）之固 定酶與所得之固艚醣基化產物。 根據申謫専利範圚第1,2或3項之方法，當反應在所形成 之產物或其一部分會自反應混合物中沈澱之條件下進行 時》供分難用於催化胺基羧酸之水解提供對應之自由態 酸或其鼸之固定_輿所得之固Μ產物。 根據申請專利範圃第1,2或3項之方法，當反應在所形成 之產物或其一部分會自反應混合物中沈澱之條件下進行 時·供分離用於催化富馬酸或其Μ之轉化之固定酶興所 得之固體產物。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項- 再 填 寫 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）