NL1007827C2 - Complexen van beta-lactam antibiotica. - Google Patents

Description

• I

- 1 - PN 9441

COMPLEXEN VAN β- LACTAM ANTIBIOTICA

5 De uitvinding betreft complexen van een β- lactam antibioticum en een aromatische verbinding.

Dergelijke complexen zijn bekend uit WO-A-93/12250 betreffende de bereiding van antibiotica via enzymatische acylering van een /J-lactamkern in 10 aanwezigheid van naftalenen, in het bijzonder /3-naftol, tijdens de enzymatische acyleringsreactie.

Verrassenderwijze is nu gevonden dat wanneer in plaats van 0-naftol, een aromatische verbinding wordt toegepast met formule 1 (HO) m--O O' (1) waarin X staat voor C of N en m en n een natuurlijk 20 getal (inclusief het getal 0) voorstellen waarbij de som van m en n groter is dan of gelijk aan 2, de complexatie van het /?-lactam antibioticum sneller verloopt en met een hoger rendement waardoor het mogelijk is een hogere opbrengst aan jS-lactam 25 antibioticum te bereiken.

De complexen volgens de uitvinding zijn in het bijzonder nuttige tussenproducten bijvoorbeeld in de enzymatische bereiding van jS-lactam antibiotica, bij de winning van β-lactam antibiotica uit reactiemengsels 30 verkregen na een chemische of enzymatische acyleringsreactie en bij de zuivering van 0-lactam antibiotica.

De complexen volgens de uitvinding kunnen eenvoudig worden bereid door de β-lactam antibiotica in 35 contact te brengen met een aromatische verbinding met formule 1. De molaire verhouding van de aromatische verbinding met formule 1 tot β-lactam antibioticum is bij voorkeur groter dan 0,5 en ligt in het bijzonder tussen 0,5 en 2. De concentratie van het jS-lactam 1007827 - 2 - antibioticum wordt daarbij bij voorkeur zo hoog mogelijk gekozen, bij voorkeur groter dan 0,01 gew.% β-lactam antibioticum in het reactiemengsel. De temperatuur is daarbij niet bijzonder kritisch en ligt 5 bijvoorbeeld tussen -10 en 100°C, bij voorkeur tussen -5 en 50°C. De pH waarbij de complexen worden gevormd is evenmin bijzonder kritisch; de te bereiken rest-concentratie van het jS-lactam antibioticum in oplossing na complexatie blijkt nagenoeg onafhankelijk van de pH 10 van het mengsel in een brede range van pH-waarden bijvoorbeeld van 1-10 in het bijzonder 2-9, meer in het bijzonder 3-8. Bijgevolg kan de complexvorming eenvoudig worden ingepast op diverse plaatsen in een werkwijze voor de bereiding van jS-lactam antibiotica, 15 bijvoorbeeld tijdens een enzymatische acyleringsreactie, bij de hydrolyse van beschermde β-lactam antibiotica na een chemische acyleringsreactie, waarbij beschermingsgroepen worden toegepast, bij de zuivering van antibiotica en bij het isoleren van β-20 lactam antibiotica uit een reactiemengsel verkregen na de acyleringsreactie of uit de moederloog. Bij voorkeur wordt een pH-waarde tussen 2 en 9, in het bijzonder tussen 4 en 7 gekozen. Uit het complex kan het β-lactam antibioticum worden gewonnen op voor de deskundige 25 algemeen bekende wijze.

Geschikte aromatische verbindingen zijn bijvoorbeeld naftalenen en chinolines met 2 of meer, in het bijzonder 2, 3 of 4 hydroxy-groepen op de ringen, in het bijzonder dihydroxynaftalenen of 30 dihydroxychinolines, bijvoorbeeld 2,6-dihydroxy-naftaleen, 2,7-dihydroxynaftaleen of 2,3-dihydroxynaftaleen.

Een bijzonder geschikte toepassing van de complexen volgens de uitvinding is in de enzymatische 35 acylering van een β-lactamkern met een acyleringsmiddel, waarbij ten minste gedurende een deel van de acyleringsreactie een aromatische verbinding met 1ÜÜ7327 - 3 - formule 1 aanwezig is in het reactiemengsel. Bij een kinetisch gecontroleerde koppeling treedt tijdens een enzymatische acyleringsreactie normaal gesproken hydrolyse van het acyleringsmiddel en het β-lactam 5 antibioticum op. Door de aanwezigheid van de aromatische verbinding in het reactiemengsel en bijgevolg de vorming van de complexen volgens de uitvinding wordt een hogere synthese/hydrolyse verhouding (S/H), de molaire verhouding syntheseproduct 10 (/3-lactam antibioticum) tot hydrolyse product, verkregen en vindt als gevolg van complexatie minder afbraak van het /3-lactam antibioticum plaats. Daarnaast werd een hogere reactiesnelheid gerealiseerd waardoor de afbraak van het β-lactam antibioticum en de β-15 lactamkern wordt beperkt.

De concentratie waarbij de enzymatische acyleringsreactie wordt uitgevoerd is niet bijzonder kritisch. De concentratie van de β-lactamkern en van het acyleringsmiddel aan het begin van de 20 acyleringsreactie ligt bijvoorbeeld tussen 100 en 2.000 mM, bij voorkeur tussen 400 en 1.000 mM. Bij voorkeur zijn de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel ten minste tijdens een deel van de acyleringsreactie oververzadigd in het reactiemengsel aanwezig. Dit kan 25 bijvoorbeeld worden bereikt door een mengsel waarin de β-lactamkern en/of het acyleringsmiddel geconcentreerd aanwezig zijn te onderwerpen aan een pH-verhoging of -verlaging of aan een temperatuurverlaging.

De uitvinding betreft tevens een werkwijze 30 voor de bereiding van de complexen en het β-lactam antibioticum via (enzymatische) acylering van een β-lactamkern in aanwezigheid van de complexen volgens de uitvinding en de winning van een jS-lactam antibioticum uit een mengsel gebruikmakend van de complexen volgens 35 de uitvinding.

De werkwijze volgens de uitvinding kan geschikt worden toegepast bij de bereiding van β-lactam 1007827 - 4 - antibiotica, bijvoorbeeld cephalexine, cefaclor, cephradine, cefadroxil, cefotaxim, cefazoline, cefprozil, loracarbef en cefaloglycine, in het bijzonder cephradine en cefadroxil.

5 In principe kan elke β-lactamkern worden toegepast; in het bijzonder een /3-lactamkern met de algemene formule (1)

Ro h!K--1/ \

15 O^OK

waarin R0 staat voor H of een alkoxygroep met 1-3 C-atomen; Y staat voor CH2, O, S of een geoxideerde vorm van zwavel; en Z staat voor 20 \ \ \

Λ A « A

" Rx , of CH2 25 waarin Rx bijvoorbeeld staat voor H, OH, halogeen, een alkoxygroep met 1-5 C-atomen, een alkylgroep met 1-5 C-atomen, een cycloalkylgroep met 4-8 C-atomen, een aryl of een heteroarylgroep met 6-10 C-atomen, waarbij de 30 groepen eventueel gesubstitueerd kunnen zijn bijvoorbeeld met een alkyl-, een aryl-, een carboxy- of een alkoxygroep met 1-8 C-atomen; en waarin de carbonzuurgroep desgewenst een estergroep kan zijn.

Geschikte voorbeelden van /3-lactamkernen die 35 kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn cefalosporine-derivaten, bijvoorbeeld een 7-aminocefalosporaanzuur al of niet met een substituent op de 3-plaats, bijvoorbeeld 7-aminocefalosporaanzuur (7-ACA), 40 7-aminodesacetoxycefalosporaanzuur (7-ADCA) en 7-amino- 1007827 - 5 - 3-chloor-cef-3-em-4-carbonzuur (7-ACCA) en 7-amino-3-chloor-8-oxo-l-azabicyclo[4.2.0] oct-2-een-2-carbonzuur.

In de (enzymatische) acyleringsreactie kunnen als acyleringsmiddel bijvoorbeeld een fenylglycine in 5 geaktiveerde vorm bij voorkeur een (primair, secundair of tertiair) amide of zout daarvan, of een lager alkyl (1-4C) ester, bijvoorbeeld een methylester worden toegepast; als fenylglycines komen bijvoorbeeld in aanmerking al dan niet gesubstitueerde fenylglycines in 10 het bijzonder fenylglycine, p-hydroxyfenylglycine, dihydrofenylglycine.

Als enzym kan daarbij in principe elk enzym worden toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreactie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld 15 de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld beschreven in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry, Augustus 1989 p. 146-154 en in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry 20 International, Juni 1990, p. 97-103. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van Acetobacter. in het bijzonder Acetobacter pasteurianum, Aeromonas, Alcaligenes, in het bijzonder Alcaligenes faecalis, Aphanocladium. Bacillus sp., in het bijzonder 25 Bacillus megaterium, Cephalosporium, Escherichia, in het bijzonder Escherichia coli. Flavobacterium.

Fusarium. in het bijzonder Fusarium oxvsporum en Fusarium solani. KIuwera. Mvcoplana. Protaminobacter. Proteus. in het bijzonder Proteus rettgeri. Pseudomonas 30 en Xanthomonas, in het bijzonder Xanthomonas citrii.

Bij voorkeur wordt een geïmmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig afgescheiden en hergebruikt kan worden.

Van de geïmmobiliseerde enzymen die 35 commercieel verkrijgbaar zijn, zijn bijvoorbeeld bijzonder geschikt gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygel® 1007827 - 6 - commerciëel verkrijgbaar is, het geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati en het geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Pharma Biotechnology Hannover. Daarnaast kunnen enzymen ook 5 als kristallijne stof worden ingezet (CLEC's™).

De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd is niet bijzonder kritisch en ligt vanwege de stabiliteit van het enzym meestal lager dan 40°C, bij voorkeur tussen -5 en 35°C. 10 De pH waarbij de enzymatische acyleringsreactie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 5,5 en 9,5, bij voorkeur tussen 6,0 en 9,0.

Bij voorkeur wordt de reactie vrijwel volledig gestopt wanneer nagenoeg de maximale conversie 15 is bereikt. Een geschikte uitvoeringsvorm om de reactie te stoppen is het verlagen van de pH, bij voorkeur tot een waarde tussen 4,0 en 6,3, in het bijzonder tussen 4,5 en 5,7. Een andere geschikte uitvoeringsvorm is het verlagen van de temperatuur van het reactiemengsel 20 zodra de maximale conversie is bereikt. Ook een combinatie van beide uitvoeringsvormen is mogelijk.

Nadat de reactie vrijwel gestopt is bij het bereiken van maximale conversie, is het reactiemengsel meestal aanwezig in de vorm van een suspensie die 25 meerdere vaste stoffen, bijvoorbeeld het antibioticum, D-fenylglycine en eventueel geïmmobiliseerd enzym bevat. Het geïmmobiliseerde enzym wordt, vanwege de proceseconomie, bij voorkeur teruggewonnen. Dit kan bijvoorbeeld geschikt worden uitgevoerd door het 30 reactiemengsel roerend te filteren over een zeef, waarbij bij voorkeur de draairichting van de roerder zodanig wordt gekozen dat de suspensie bij het centrum van de roerder omhooggepompt wordt. Vervolgens kunnen waardevolle componenten, bijvoorbeeld het antibioticum 35 en FG, worden gewonnen, bijvoorbeeld met behulp van een pH-verandering.

Een pH-verlaging kan in het kader van de 1007827 - 7 - uitvinding bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door toevoegen van een zuur. Geschikte zuren zijn bijvoorbeeld minerale zuren, in het bijzonder zwavelzuur, zoutzuur of salpeterzuur en carbonzuren, 5 bijvoorbeeld azijnzuur, oxaalzuur en citroenzuur. Een pH-verhoging kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door toevoegen van een base. Geschikte basen zijn bijvoorbeeld anorganische basen, in het bijzonder ammonia, kaliloog of natronloog en organische basen, 10 bijvoorbeeld triethylamine en FGA. Bij voorkeur wordt ammonia toegepast.

De enzymatische acyleringsreaktie en de aangegeven maatregelen bijvoorbeeld de aanmaak van de oververzadigde mengsels kunnen worden uitgevoerd in 15 water. Desgewenst kan het reaktiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol.%. Voorbeelden van organische oplosmiddelen die kunnen worden toegepast zijn alcoholen met 1-7 C-20 atomen, bijvoorbeeld een monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.

De molaire verhouding acyleringsmiddel tot β-lactamkern, d.w.z. de totale hoeveelheid toegevoegd 25 acyleringsmiddel gedeeld door de totale hoeveelheid toegevoegde /3-lactamkern uitgedrukt in molen, is kleiner dan 2,5. Bij voorkeur ligt de molaire verhouding tussen 0,5 en 2,0, in het bijzonder tussen 0,7 en 1,8.

30 De enzymatische acyleringsreactie wordt bij voorkeur als batch proces uitgevoerd. Desgewenst is het ook mogelijk om de reactie continu uit te voeren.

De uitvinding zal verder worden toegelicht aan de hand van de voorbeelden zonder evenwel daardoor 35 te worden beperkt.

Voorbeelden 1007827 - 8 - 7 -ACCA: 7-amino-3 -chloor-cef-3-em-4-carbonzuur 7-ADCA: 7-aminodesacetoxycefalosporaanzuur 6-APA: 6-aminopenicillaanzuur CC1: cefaclor 5 CEX: cephalexine FG: D-fenylglycine FGA: D-fenylglycineamide FGH: D-p-hydroxyfenylglycine FGHM: D-p-hydroxyfenylglycine methylester 10

Assemblase™ is een geïmmobiliseerde Escherichia coli penicilline acylase uit E. coli ATCC 11105, zoals beschreven in WO-A-97/04086. De immobilisatie is uitgevoerd als beschreven in EP-A-222462, waarbij 15 gelatine en chitosan als gelerend agens en glutaaraldehyde als crosslinker zijn gebruikt.

De uiteindelijke activiteit van de Escherichia coli penicilline acylase wordt bepaald door de hoeveelheid enzym die aan de geactiveerde bolletjes 20 is toegevoegd en bedroeg 3 ASU/g drooggewicht waarbij 1 ASU (Amoxicilline Synthese Unit) is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per uur l g Amoxicilline.3H20 genereert uit 6-APA en FGHM (bij 20°C); 6,5% 6-APA en 6,5% FGHM).

25

Voorbeeld I

Complexatie van diverse cefalosprines met diverse naftaleen derivaten als complexerend agens.

Aan een waterige oplossing van een 30 cefalosporine met een concentratie van 1-2 massa % (als aangegeven op t=0) werd een loog- of ammoniakoplossing toegedruppeld tot de pH-waarde van 6,3 was bereikt. Vervolgens werd een equimolaire hoeveelheid van het naftaleenderivaat toegevoegd. Op diverse tijdstippen 35 werden monsters genomen. Na filtratie over een 0,45 μ filter werd in het filtraat m.b.v. HPLC de concentratie van het betreffende cefalosporine bepaald.

1007827 .

- 9 -

De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.1-1.3.

TABEL 1.1 5 Complexatie van cefadroxil met 2,7-dihydroxynaftaleen of 2,6-dihydroxynaftaleen als complexerend agens.

[cefadroxil] in filtraat (m%) 10 Reaktietijd (uur) 0 0,5 1,5 24,0 2,7-dihydroxynaftaleen 1,00 0,15 0,07 0,07 2.6- dihydroxynaftaleen 1,00 0,20 0,19 0,19 15 TABEL 1.2

Complexatie van cephradine met dihydroxynaftaleen-derivaten als complexerend agens.

20 [cephradine] in filtraat (m%)

Reaktietijd (uur) 0 0,5 1,5 24,0 2,3-dihydroxynaftaleen 1,10 0,06 0,06 0,06 2.6- dihydroxynaftaleen 1,10 0,12 0,12 0,10 2.7- dihydroxynaftaleen 1,10 0,15 0,14 0,13 25 1,4-dihydroxynaftaleen 1,10 0,18 0,21 0,33 1,5-dihydroxynaftaleen 1,10 0,86 0,77 0,12 1007627 - 10 -TABEL 1.3

Complexatie van cephalexine met dihydroxynaftaleen-derivaten als complexerend agens 5 [cephalexine] in filtraat (m%) Reaktietijd (uur) 0 0,5 1,5 24,0 1,5-dihydroxynaftaleen 0,95 0,19 0,18 0,11 2,3-dihydroxynaftaleen 0,95 0,16 0,16 0,13 10 2,6-dihydroxynaftaleen 0,95 0,23 0,22 0,15

Voorbeeld II

Aan een waterige oplossing met 11,1 g FGHM 15 (425 mM) en 9,4 g 7-ADCA (305 mM) werd 3,9 g 2,7- dihydroxynaftaleen toegevoegd (158 mM) bij T=15°C. Voorafgaand aan toevoeging van geïmmobiliseerd Assemblase™ (35,4 g) werd de pH op 7,0 gesteld m.b.v. NH40H. Op diverse tijdstippen werden monsters genomen en 20 geanalyseerd. Conversie, S/H-ratio en de cefadroxilconcentratie in filtraatmonsters zijn weergegeven in Tabel 2.

TABEL 2 25

Enzymatische synthese van cefadroxil in aanwezigheid van 2,7-dihydroxynaftaleen.

30 Tijd (min) 6 98 193 1250

Conversie (%) 1,6 24,2 55 78 S/H ratio 0,5 2,7 3,0 1,1 [cedrox] (llcraat 0,18 0,12 0,11 0,14 10C7Q'27 '

Claims (12)

1. Complex van een /S-lactam antibioticum en een 5 aromatische verbinding, met het kenmerk, dat de aromatische verbinding een verbinding is met formule (1) /''V'-x*08*· 10 (HO)ir(- o | O I (1) X waarin X staat voor C of N en m en n een natuurlijk getal (inclusief het getal 0) 15 voorstellen waarbij de som van m en n groter is dan of gelijk aan 2.

2. Complex volgens conclusie 1, waarin de aromatische verbinding een naftaleen is.

3. Complex volgens conclusie 2 waarin het β-lactam 20 antibioticum cefadroxyl is en de aromatische verbinding 2,7-dihydroxynaftaleen is.

4. Complex volgens conclusie 2, waarbij in het β-lactam antibioticum cephradine is en de aromatische verbinding 2,3-dihydroxynaftaleen is.

5. Complex volgens conclusie 2, waarin het 0-lactam antibioticum cefaclor is en de aromatische verbinding 2,6-dihydroxynaftaleen is.

6. Werkwij ze voor de bereiding van een complex van een β-lactam antibioticum en een aromatische 30 verbinding met formule (1) waarin X, m en n als boven gedefinieerd zijn waarin een /3-lactamkern wordt geacyleerd met een acyleringsmiddel waarbij gedurende ten minste een deel van de acyleringsreactie een complexerend agens aanwezig 35 is, met het kenmerk, dat als complexerend agens een aromatische verbinding met formule (1) als boven gedefinieerd wordt toegepast. 1007827 I, - 12 -

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het complex wordt geïsoleerd en uit het complex het β-lactam antibioticum wordt vrijgemaakt.

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarbij de 5 acyleringsreactie plaatsvindt in aanwezigheid van een enzym.

9. Werkwijze voor het winnen van een jS-lactam antibioticum waarbij een mengsel dat het β-lactam antibioticum bevat in contact wordt gebracht met 10 aromatische verbinding met formule l als boven gedefinieerd waarbij een complex van het β-lactam antibioticum en de aromatische verbinding wordt gevormd en het complex wordt gewonnen.

10. Werkwijze volgens conclusie 9 waarbij vervolgens 15 uit het complex het β-lactam antibioticum wordt vrijgemaakt.

11. Complexen en werkwijzen voor de bereiding van de complexen en β-lactam antibiotica daaruit, zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de 20 voorbeelden. 1C01827 SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDSONDER20EK VAN INTERNATIONAAL TYPE IOENTIFIKATIE VAN OE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van o· aanvrager ol van αβ gemacruigae 9441NL Neoenandse aanvrage nr inoienngsdatum 1007827 18 december 1997 Ingeroepen voorrangsoaum Aanvrager (Naam) CHEMFERM vof Oanm van net verzoek voor een onoerzoek van intemaDonaai type Door oe Insanoe voor Intemaoonaai Onoerzoek (ISA) aar. net verzoek voor een onoerzoek van internationaal type segekenO nr. SN 30488 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONDERWERP (bij oecassmg van verscfullenoe dassilicaoes. alle oassifieaoesymboien opgeven) Volgens oe internationale classificatie (IPC) Int.Cl.6: C 07 D 501/12, C

12 P 35/04 ________________ " | II. ONDERZOCHTE GE3IEDEN VAN DE TECHNIEK 1 1 ' ~ * ——— I _ OnaerzccTte minimum documentatie____! Classificatiesysteem | ____ Classificatiesvrrccien__*__! — j I i { Int.Cl.6: C 07 D, C 12 P j Ij * i I ! j i i : I ί ί Onoerzocr.te ancere cocumencaie öan ae minimum dccumenaoe voer zover aergeiiike documenaen m oe oncerzocr.te ceoieoen zqn oogenomen i ί \ I : i : j I I j ^ i _ j lil.;_ GEEN ONDERZOEK MCGELUK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (ccnerxirger. co aanvullingsdag IV. ~~ GE3REK AAN EENHEID VAN UITVINDING iccmerkircen cc aanvuilmcsciaci·