KR100516271B1 - β-락탐 항생제의 제조방법 - Google Patents

β-락탐 항생제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아실화제의 도움으로 β-락탐 핵을 효소 아실화 반응시키는 β-락탐 항생제의 제조 방법(여기서, 아실화제/β-락탐 핵의 몰 비율은 2.5 이하임)에 관한 것으로서,
아실화제, β-락탐 핵 또는 아실화제 및 β-락탐 핵은 아실화 반응의 전부 또는 일부중에 반응 혼합물내에 과포화되고,
상기 방법에서, 아실화 반응이 실행되는 온도보다 높은 온도 또는 아실화 반응이 실행되는 pH와는 상이한 pH를 갖는 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 농축된 슬러리 또는 용액이 아실화 반응 동안 반응 혼합물내에 첨가되며, 및
β-락탐 핵 및 아실화제 모두 반응 혼합물내에 과포화되는 것을 특징으로 한다.

Description

β-락탐 항생제의 제조방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF A β-LACTAM ANTIBIOTIC}
본 발명은 아실화제의 도움으로 β-락탐 핵을 효소 아실화 반응시키는 β-락탐 항생제의 제조 방법(여기서, 아실화제/β-락탐 핵의 몰 비율은 2.5 이하임)에 관한 것이다.
유사한 방법은 예를 들어 국제공개 WO-A-96/23897에 개시되어 있다.
사용된 β-락탐 핵의 양 당 및 사용된 아실화제의 양 당 종래의 효소 아실화 반응으로 수득되는 β-락탐 항생제의 수득율은 보통 β-락탐 핵, β-락탐 항생제, 또는 β-락탐 핵 및 β-락탐 항생제가 종종 비교적 불안정하기 때문에 비교적 낮으며, 반면 반응 시간은 보통 반응물의 낮은 용해도 때문에 비교적 길다. 그리고, 언급한 β-락탐 핵에 대한 아실화제의 비교적 낮은 비율에서, 사용된 β-락탐 핵의 양에 대해 비교적 낮은 수득율의 β-락탐 항생제가 수득될 수 있다.
본 발명은 효소 아실화 반응에서, 보다 짧은 반응 시간이 수득되고, 사용된 β-락탐 핵, 사용된 아실화제, 또는 사용된 β-락탐 핵 및 사용된 아실화제의 양 당 높은 수득율의 β-락탐 항생제가 수득되며, β-락탐 핵에 대한 사용된 아실화제의 양의 비율이 비교적 낮은 방법을 제공한다.
상기는 아실화 반응의 일부 또는 전부 중에 아실화제, β-락탐 핵, 또는 아실화제 및 β-락탐 핵이 반응 혼합물내에 과포화되는 본 발명에 따라 획득된다.
본 출원인은 반응 혼합물내 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 고도의 과포화도를 얻을 수 있으며, 특히 놀랍게도 과포화는 몇 시간 동안 안정하게 유지될 수 있는 것을 발견하였다. 이는 β-락탐 핵, 용해된 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 용해된 아실화제의 농도를 크게 증가시켜, 반응이 보다 신속하게 진행되도록 하고, β-락탐 항생제, 반응물, 또는 β-락탐 항생제 및 반응물이 덜 분해되며, 또한 사용된 β-락탐 핵의 양 당, 사용된 아실화제의 양 당, 또는 사용된 β-락탐 핵 및 상용된 아실화제의 양 당 β-락탐 항생제의 수득율이 높아진다. 또한 제조 능력이 보다 높아진다.
그리고, 아실화제와 β-락탐 핵 사이의 높은 몰비율을 적용함으로써 β-락탐 핵의 양 당 β-락탐 항생제의 높은 수득율이 얻어질 수 있다는 사실은 국제공개 WO-A-92/01061에 공지되어 있다. 그러나, 아실화제와 β-락탐 핵사이의 높은 몰비율을 적용하는 것의 단점은 아실화제(및 아마 β-락탐 항생제도)의 가수분해의 결과로서 다량의 아실화제가 손실된다는 점이다. 상기의 결과로 낮은 합성/가수분해 비율(S/H), 합성 생성물(β-락탐 항생제)과 가수분해 생성물 사이의 몰비율이 수득된다. 또한, β-락탐 항생제로 작업하는 것은 효소 아실화 반응 후에 수득된 반응 혼합물내에 존재하는 β-락탐 항생제에 대해 비교적 다량의 가수분해된 아실화제에 의해 종종 방해되며, 이 결과 소량의 β-락탐 항생제가 분리될 수 있다는 것을 알았다.
본 발명의 목적에 있어서, 아실화 반응에서 수득되는 반응물(β-락탐 핵 또는 아실화제) 양 당 β-락탐 항생제의 수득율은 사용된 반응물의 (몰)량 당 아실화 반응에서 형성된 β-락탐 항생제의 (몰)량을 의미한다.
본 발명의 목적에 있어서, 혼합물내 화합물의 용해도는 혼합물의 모든 다른 성분들의 존재하에서 화합물의 용해농도(mmol/ℓ 또는 질량%)를 의미한다. 용해도는 혼합물의 모든 성분들의 존재하에 일정한 pH 및 온도에서 화합물을 용해시킴으로써 측정한다. 이 후, 용해도는 평형(포화용액)에 도달할때 용해된 화합물의 양에서 계산할 수 있다.
본 발명의 목적에 있어서, 혼합물내 화합물의 용해농도가 용해도보다 클때 화합물은 과포화된다. 과포화 요소는 상기 두 용해도 사이의 비율(과포화를 포화로 나눔)을 의미한다. 획득되는 과포화 요소 및 과포화가 유지되는 시간은 화합물의 성질 및 농도, 혼합물내 다른 성분들의 성질 및 농도, pH 및 온도와 같은 여러 요소들에 따라 다르다. 수득되는 과포화 요소는 포함된 화합물에 크게 의존하며, 바람직하게 2개 이상, 보다 바람직하게 5개 이상이다.
용해된 β-락탐 핵의 농도는 액상 반응 혼합물 1 ㎏ 당 용해된 β-락탐 핵의 양(mole)으로 나타내며; 용해 및 용해되지 않은 β-락탐 핵의 총 농도는 총 반응 혼합물 1 ㎏ 당 β-락탐 핵의 양(mole)으로 나타내고; 총 반응 혼합물은 용액외에 여러 고형물들, 예를 들어 β-락탐 핵, β-락탐 항생제, (가수분해된) 아실화제 및 부동화 효소를 함유한다. 아실화제 및 β-락탐 항생제에 대해서도 상기와 유사한 규정을 적용시킬 수 있다.
β-락탐 핵 또는 아실화제 각각이 과포화된 혼합물은 예를 들어, pH 상승에 의해 수득될 수 있다. 결국에, 필요하다면 농축된 혼합물은 먼저 β-락탐 핵 또는 아실화제를 각각 용해시킴으로써 슬러리 또는 용액으로 제조될 수 있으며, pH 증가 또는 pH 감소, 또는 pH 감소 각각에 의해 고형물 형태로 존재한다. β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제는 수득된 혼합물내에 용해되는 것이 바람직하다. 그러나, β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 일부는 고형물 형태로 존재할 수도 있다. 이 후에, 상기 슬러리 또는 용액은 pH 감소 또는 pH 증가, 또는 pH 증가 각각에 적용시킬 수 있다. 상기 방법에서, β-락탐 핵 또는 아실화제가 과포화된 슬러리 또는 용액이 수득된다.
존재하는 임의의 고형물 β-락탐 핵은 3 이하, 바람직하게 2 이하, 특히 1 이하의 pH에 도달할때까지 pH를 감소시킴으로써; 또는 6 이상, 바람직하게 7 이상, 특히 8 이상의 pH로 pH를 증가시킴으로써 용해시킬 수 있다. 특히, 최종 pH는 β-락탐 핵이 완전하게 용액이 될 때까지 가능한한 농축된 용액이 수득되도록 선택하는 것이 바람직하다. 실제로, 농축된 용액은 5 중량% 이상의 β-락탐 핵 농도를 가질 것이다. 최종 pH는 보통 10 이하 및 0 이상일 것이다.
이 후에, 예를 들어 3.0 내지 9.0, 바람직하게는 4.0 내지 8.5, 특히 4.5 내지 8.0의 값으로 pH를 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, pH가 감소 또는 증가되거나 또는 그렇지 않은 용액으로부터 과포화 용액이 수득될 수 있다.
존재하는 임의의 고형물 아실화제는 8.0 이하, 바람직하게는 6.5 이하, 특히 5.0 이하의 값에 도달할 때까지 pH를 감소시킴으로써 용해시킬 수 있으며; 바람직하게 최종 pH는 아실화제가 완전히 용해되어 가능한한 농축된 용액이 수득될 수 있도록 선택된다. 실제로, 농축된 용액은 5 중량% 이상의 아실화제 농도를 가질 것이다. 최종 pH는 보통 1 이상일 것이다.
예를 들어 아실화제로 과포화된 혼합물은 예를 들어, 4.5 이상, 바람직하게는 5.5 이상, 특히 6.0 이상의 값으로 pH를 증가시킴으로써, pH가 선택적으로 감소되는 혼합물, 바람직하게 용액으로부터 수득될 수 있다.
β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제가 과포화된 혼합물을 수득하는 다른 방법은 온도를 감소시키는 것이며, 선택적으로 존재하는 임의의 고형물 β-락탐 핵, 고형물 아실화제, 또는 고형물 β-락탐 핵 및 고형물 아실화제는 먼저 온도 증가 또는 pH 변화에 의해 일부 또는 전부가 용해된다.
용해는 (거의)모든 고형물질이 용액내에 있을때까지 예를 들어, 15 ℃ 이상, 바람직하게는 20 ℃ 이상, 특히 25 ℃ 이상으로 온도를 증가시킴으로써 실행시킬 수 있다. 이 후에, 과포화 슬러리 또는 용액은 온도를 20 ℃ 이하, 바람직하게는 15 ℃ 이하, 특히 10 ℃ 이하로 감소시킴으로써 수득된 혼합물로부터 수득될 수 있다.
과포화 혼합물은 보다 많은 과포화 요소가 수득될 수 있을 만큼만 pH를 변화시킴으로써 제조하는 것이 바람직하다. 실제로, pH 변화 및 온도 감소는 보통 과포화 용액을 제조함과 동시에 가해질 것이다.
본 발명에 따른 방법의 적당한 실시형태에서, β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제가 과포화된 혼합물이 먼저 제조되고, (부동화) 효소를 첨가함으로써 아실화 반응이 시작된다. 반응물의 농도는 아실화 반응 동안 감소되어 과포화는 아실화 반응 말기에는 사라질 것이다. 다른 적당한 실시형태에서, 아실화 반응은 과포화되거나 또는 되지 않은 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 일부와 함께 시작되며, 이때 과포화는 유지되거나 또는 예를 들어, 적정에 의해 반응 혼합물에 아실화 반응이 실시되는 온도 또는 pH보다 높은 온도 또는 상이한 pH를 갖는 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 농축된 혼합물을 첨가함으로써 일어난다. 실제로, β-락탐 핵 및 아실화제는 모두 (높은 pH 또는 선택적으로 낮은 pH를 갖는)β-락탐 핵의 농축된 용액 또는 슬러리, 및 동시에 (낮은 pH를 갖는)아실화제의 농축된 용액 또는 슬러리를 미터링함으로써 아실화 반응 동안 과포화 조건하에서 존재한다. 상기에서, pH는 목적한다면 적정에 의해 아실화 반응 동안 일정하게 유지시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 세파클로(cefaclor)를 제조하는데 매우 적당하게 사용될 수 있다. 세파클로는 높은 pH(>6.5)에서 안 좋은 안정성을 나타내지만, 대응하는 β-락탐 핵(7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복시산; 7-ACCA)의 용해도는 세파클로의 분해도가 여전히 비교적 낮은 상기 pH 값(약 6.0-6.5)에서 낮다. 상기의 결과로, 세파클로의 수득율은 비교적 높은 pH 및 비교적 낮은 pH 모두에서 낮았으며, 따라서 기술적/상업적으로 매력적인 방법은 될 수 없다. 사용된 7-ACCA의 양 및 사용된 아실화제의 양에 대한 세파클로의 수득율은 착화제(complexing agent)로서 나프톨을 사용함으로써 명백히 향상시킬 수 있지만; 항생제를 제조하는데 상기 독성 보조 물질을 사용하면 완전히 제거시켜야 한다는 단점을 가지며, 공정 경제성에 부정적인 효과를 강하게 미치는 추가의 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 의해, 아실화 반응이 비교적 낮은 pH(6.0-6.5)에서 실시될 수 있도록 매우 높은 과포화 요소(>10)를 실행하며, 반면에 β-락탐 핵의 농도는 충분히 높다는 것을 알았다. 따라서, 기술적/상업적으로 매력적인 방법이 이루어질 수 있도록 보조 물질을 사용하지 않고 효소 아실화를 통해 고수율로 세파클로를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 D-페닐글리신 아미드(FGA)에 의해 6-아미노페니실란산(6-APA)을 아실화하는 것에 의해 암피실린을 제조하는데 또한 적용된다. 6-APA 및 암피실린은 높은 농도 및 높은 pH에서 비교적 신속하게 분해하기 때문에, 가능한한 낮은 pH에서 가능한한 신속하게 아실화 반응을 진행시키는 것이 중요하다. 예를 들어, 6-APA와 FGA의 혼합물의 pH를 7.0 내지 8.0으로 증가시키고, 그 다음에 6.0 내지 6.5의 pH로 낮추고, 다음에 효소 반응을 개시함으로써, 사용된 6-APA의 양 및 사용된 아실화제의 양에 대한 암피실린의 고수득율을 단시간내에 얻을 수 있으며, 비교적 높은 농도의 6-APA는 용액내에 존재하고, 암피실린의 분해는 비교적 낮은 pH 값에서 낮게 유지된다. 동시에, FGA의 D-페닐글리신(FG)으로의 가수분해가 제한된다.
본 발명에 따른 방법은 또한, D-페닐글리신 아미드(FGA)에 의한 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)의 아실화를 통해 세팔렉신을 효소적으로 제조하는데 유리하게 적용될 수 있다. 아실화 반응은 보통, 7.5 내지 8.5와 같은 비교적 높은 pH값에서 실시되며, FGA가 D-페닐글리신(FG)으로 (원치않는) 가수분해됨으로써 수반된다. 상기 반응은 가속화될 수 있으며, 아실화제의 가수분해는 본 발명에 따른 방법을 이용함으로써, 예를 들어 FGA와 7-ADCA의 혼합물의 pH를 8.0 내지 9.0으로 먼저 높이고, 상기 혼합물을 pH 6.5 내지 8.5로 산성화시킴으로써 제한될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 예는 6-APA 및 D-p-히드록시페닐 글리신 메틸 에스테르(FGHM)로부터 아목시실린을 효소적으로 제조하는데, 7-ADCA 및 FGHM으로부터 세파드록실을 제조하는데 사용하는 것이다. FGHM의 용해도는 비교적 낮으며, pH를 증가시킴과 동시에 감소하는 반면에, 6-APA 및 7-ADCA의 용해도는 비교적 낮으며, pH를 감소시킴과 동시에 감소한다. 6-APA 또는 7-ADCA와 FGHM의 혼합물의 pH를 FGHM이 실제로 완전히 용해되는 pH(pH 5 내지 6)로 감소시키고, 다음으로 pH 6 내지 7.5로 증가시킴으로써 3개 내지 5개의 요소에 의한 FGHM의 과포화가 이루어질 수 있게 된다는 것을 알았다. 따라서, 아실화 반응은 고농도의 용해된 β-락탐 핵과 함께 다소 높은 pH에서 실행할 수 있으며, 반면에 아실화제의 농도도 또한 비교적 높다.
다른 실시형태는 7-ADCA를 pH 8 내지 9의 염기에 의해 비교적 높은 농도로 용해시키고, FGHM의 농축된 산 용액을 첨가하는 것이며, 상기 방법에서 pH는 감소한다. 상기 실시형태에서, 7-ADCA 및 FGHM 모두의 과포화는 동시에 이루어질 수 있다. 효소 반응은 모든 반응물들이 첨가된 후에 시작될 수 있다. 또한, 반응 동안 농축된 FGHM 또는 7-ADCA 용액(또는 슬러리)의 (일부)를 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 실시예는 β-락탐 핵으로서 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA) 또는 7-아미노-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일-티오메틸)-3-세프-엠-4-카르복실산(7-ACA-MMTD) 및 테트라졸-1-아세트산으로부터 세파졸린을 효소적으로 제조하는데 있어서의 이것의 적용이다. 아실화제는 α-아미노기를 함유하고 있지 않기 때문에, 소위 산과의 열역학적지배결합반응이 수행된다. 상기 열역학적지배결합반응을 위한 최적 pH는 4.0 내지 6.5인 것이 바람직하다. 상기 pH에서, β-락탐 핵의 용해도는 비교적 낮다. 결합 반응에서 전환은 비교적 높은 pH(예를 들어, 7.0 내지 9.0)를 갖는 β-락탐 핵의 농축된 용액을 효소 반응 혼합물에 첨가함으로써 크게 증대시킬 수 있는 반면에, 반응 혼합물의 pH는 산으로 적정하는 것에 의해 4.0 내지 6.5의 값에서 유지된다는 것을 알았다.
본 발명에 따른 방법은 β-락탐 항생제, 예를 들어 세팔렉신(cephalexin), 암피실린(ampicillin), 세파클로(cefaclor), 아목시실린(amoxicillin), 세프라딘(cephradine), 세파드록실(cefadroxil), 세포탁심(cefotaxime), 세파졸린(cefazolin), 세프프로질(cefprozil), 로라카르베프(loracarbef) 및 세플로글리신(cefaloglycin)을 제조하는데 적당하게 사용될 수 있다.
임의의 β-락탐 핵, 특히 하기 화학식 1로 표시되는 β-락탐 핵이 사용될 수 있다:
[상기 화학식 1에서,
R0는 H 또는 1개 내지 3개의 C 원자를 갖는 알콕시기를 나타내며;
Y는 CH2, O, S 또는 산화형태의 황을 나타내고; 및
Z는 (여기에서, R1은 예를 들어, H, OH, 할로겐, 1개 내지 5개의 C 원자를 갖는 알콕시기, 1개 내지 5개의 C 원자를 갖는 알킬기, 4개 내지 8개의 C 원자를 갖는 시클로알킬기, 6개 내지 10개의 C 원자를 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기를 나타내며, 상기 기들은 예를 들어, 1개 내지 8개의 C 원자를 갖는 알킬기, 아릴기, 카르복시기 또는 알콕시기로 치환되거나 치환되지 않으며; 목적한다면, 카르복시산기는 에스테르기임)를 나타낸다]
본 발명에 따른 방법에 사용되는 β-락탐 핵의 적당한 예로는 페니실린 유도체, 예를 들어 6-아미노페니실란산(6-APA) 및 세팔로스포르산 유도체, 예를 들어 3-위치에 치환체를 가지거나 또는 가지지 않는 7-아미노세팔로스포란산, 가령 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA), 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA), 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복시산(7-ACCA), 7-아미노-3-(1-프로페닐)-세프-3-엠-4-카르복시산(7-PACA), 7-아미노-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일-티오메틸)-세프-3-엠-4-카르복시산(7-ACA-MMTD) 및 7-아미노-3-클로로-8-옥소-1-아자비시클로[4.2.0]옥-2-텐-2-카르복시산이 있다.
(효소)아실화 반응에서, 아실화제는 활성화 형태의 페닐글리신, 바람직하게 (일차, 이차 또는 삼차) 아미드 또는 이의 염, 또는 저급 알킬 (1개 내지 4개의 C)에스테르, 예를 들어 메틸 에스테르이며; 적당한 페닐글리신은 예를 들어, 치환 및 치환되지 않은 페닐글리신, 특히 페닐글리신, p-히드록시페닐글리신, 디히드로페닐글리신이다. 그리고, α-치환된 아세트산 유도체 및 대응하는 아미드 및 에스테르, 예를 들어 페닐 아세트산, 페녹시 아세트산, 테트라졸-1-아세트산, 만델산 또는 티에닐 아세트산이 사용된다.
본래, 결합 반응에서 촉매로서 적당한 효소가 임의의 효소로서 사용될 수 있다. 상기 효소들은 페니실린 아미다아제 또는 페니실린 아실라아제로 통칭되는 효소들을 포함한다. 상기 효소들은 예를 들어, J.G. Shewale외 다수, Process Biochemistry, 1989. 8. pp. 146-154 및 J.G. Shewale외 다수, Process Biochemistry International, 1990. 6. pp. 97-103에 기술되어 있다. 적당한 효소의 예로는 아세토박터(Acetobacter), 특히 아세토박터 파스테우리아눔(Acetobacter pasteurianum), 아에로모나스(Aeromonas), 알칼리게네스(Alcaligenes), 특히 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 아파노클라디움(Aphanocladium), 바실루스종(Bacillus sp.), 특히 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 에스테리시아(Escherichia), 특히 에스테리시아 콜리(Escherichia coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸사리움(Fusarium), 특히 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 솔라니(Fusarium Solani), 클루이베라(Kluyvera), 미코플라나(Mycoplana), 프로타미노박터(Protaminobacter), 프로테우스(Proteus), 특히 프로테우스 렛트가리(Proteus rettgari), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 크산토모나스(Xanthomonas), 특히 크산토모나스 시트리이(Xanthomonas citrii)로부터 유도된 효소들이 있다.
상기 경우, 효소는 쉽게 분리되어 재사용될 수 있기 때문에 부동화 효소가 사용되는 것이 바람직하다.
상업용으로 유용한 부동화 효소중 특히 적당한 효소로는 예를 들어, 상표명 엔지겔(Enzygel)R의 보에링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH)제 에스케리시아 콜리 효소, 레코르다티(Recordati)제 부동화 페니실린-G 아실라아제 및 파마 바이오테크놀로지 하노버(Pharma Biotechnology Hannover)제 부동화 페니실린-G 아실라아제가 있다. 그리고, 효소들은 또한, 결정형태(CLEC'sTM)로 사용될 수 있다.
효소 아실화 반응이 실시되는 온도는 보통 40 ℃ 이하, 바람직하게는 -5 내지 35 ℃이다. 효소 아실화 반응이 실시되는 pH는 보통 3.0 내지 9.5, 바람직하게는 4.0 내지 9.0이다. 동력학적지배결합반응을 위한 최적 pH는 4.5 내지 9.0, 바람직하게 5.5 내지 8.5, 특히 6.0 내지 8.0과 같이 비교적 높다. 열역학적지배결합반응의 최적 pH는 보통 낮으며, 예를 들어 3.0 내지 7.0, 바람직하게는 4.0 내지 6.5이다.
상기 반응은 최대 전환이 실제로 수득되었을 때 거의 완전하게 정지시키는 것이 바람직하다. 반응을 정지시키기 위한 적당한 실시형태는 pH를 바람직하게는 4.0 내지 6.3, 특히 4.5 내지 5.7로 낮추는 것이다. 다른 적당한 실시형태는 최대 전환이 수득되었을때 반응 혼합물의 온도를 낮추는 것이다. 상기 두 실시형태의 조합도 또한 가능하다.
최대 전환이 수득되었을 때 반응이 정지되면, 반응 혼합물은 보통, 다수의 고형물, 예를 들어 항생제, D-페닐글리신 및 가능하게 부동화 효소로 구성된 현탁액의 형태로 존재한다. 부동화 효소는 방법 경제성을 위해 회수되는 것이 바람직하다. 이는 교반하는 동안 반응 혼합물을 체위에서 여과시킴으로써 적당하게 실시될 수 있으며, 교반기의 회전 방향은 현탁액이 교반기의 중앙에서 윗방향으로 펌프되도록 선택한다. 이 후에, 항생제 및 FG와 같은 중요한 성분들은 pH 변화와 같은 수단에 의해 회수될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, pH 변화는 산을 첨가함으로써 실행시킬 수 있다. 적당한 산으로는 예를 들어 무기산(mineral acid), 특히 황산, 염산 또는 질산 및 카르복시산, 예를 들어 아세트산, 옥살산 및 시트르산이 있다. pH 증가는 염기를 첨가함으로써 실행시킬 수 있다. 적당한 염기로는 예를 들어, 무기염기, 특히 수산화암모늄, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨, 및 유기염기, 예를 들어 트리에틸 아민 및 FGA가 있다. 수산화암모늄을 사용하는 것이 바람직하다.
효소 아실화 반응 및 언급된 측정, 예를 들어 과포화 혼합물의 제조는 물안에서 실시될 수 있다. 목적한다면, 반응 혼합물은 또한 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물을 바람직하게 30 부피% 이하 함유한다. 적당한 유기 용매의 예로는 1개 내지 7개의 C 원자를 갖는 알콜, 예를 들어 일가알콜, 특히 메탄올 또는 에탄올; 디올, 특히 에틸렌 글리콜, 또는 트리올, 특히 글리세롤이 있다.
β-락탐 핵에 대한 아실화제의 몰비율, 즉 첨가된 아실화제의 전체양을 첨가된 β-락탐 핵의 전체양으로 나눈 값(mole)은 2.5 이하이다. 상기 몰비율은 0.5 내지 2.0, 특히 0.7 내지 1.8인 것이 바람직하다.
효소 아실화 반응은 일괄 방법으로 실시하는 것이 바람직하다. 목적한다면, 반응은 또한 연속해서 실행시킬 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 상술할 것이지만, 여기에 한정하지는 않는다.
약어:
7-ACCA: 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복시산
7-ADCA: 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산
6-APA: 6-아미노-페니실란산
AMPI: 암피실린
CCl: 세파클로
CEX: 세팔렉신
FG: D-페닐 글리신
FGA: D-페닐 글리신 아미드
FGH: D-p-히드록시페닐 글리신
FGHM: D-p-히드록시페닐 글리신 메틸 에스테르
어셈블라아제(Assemblase)TM는 국제공개 WO-A-97/04086에 기술된 바와 같이 E. coli ATCC 1105로부터의 부동화 에스테리시아 콜리 페니실린 아실라아제이다. 부동화는 유럽특허 EP-A-222462에 개시된 바와 같이 실행하며, 젤라틴 및 키토산은 겔화제로서 사용하며, 글루타르알데히드는 가교제로서 사용한다.
에스테리시아 콜리 페니실린 아실라아제의 최고 활성은 활성 소구체에 첨가된 효소의 양으로 측정하며, 건조 중량 3ASU/g로 정량하고, 1ASU(아목시실린 합성단위)는 시간당 6-APA 및 FGHM으로부터 아목시실린.3H2O 1g을 제조할 수 있는 효소의 양(20℃에서; 6.5% 6-APA 및 6.5% FGHM)으로 정의한다.
비교 실시예 1
세파클로의 합성(7-ACCA는 과포화되지 않음)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트(net-wet) 어셈블라아제TM 100 g을 채웠다.
제조 반응기(1.2 ℓ)에 FGA 75.4 g(0.500 mole), 이황화나트륨 4.0 g, 물 700 g, 4N H2SO4 6.6 g 및 7-ACCA 72.1 g(0.300 mol)을 채웠다. 상기 혼합물을 T=10 ℃에서 교반하고; pH는 7.5이었다. 이 후에, 혼합물을 물 118 ㎖(T=10 ℃)로 효소 반응기로 옮겼다.
효소 반응기내 교반기를 t=0에서 스위칭했다. 온도를 10 ℃로 유지하였다. pH는 4N H2SO4 적정에 의해 7.5로 유지하였다. t=48 분에, 효소 반응기는 대략 215 mmol CCl(전환율=72 %), 70 mmol 7-ACCA, 175 mmol FGA, 95 mmol FG를 함유하였다. t=81에, 효소 반응기는 대략 212 mmol CCl(전환율=71 %), 61 mmol 7-ACCA, 83 mmol FGA, 182 mmol FG를 함유하였다.
그러므로, CCl의 양은 감소된다. 반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 FGA(FGAs), 전체 FGA(FGAt), 용액내 7-ACCA(ACCAs), 전체 7-ACCA(ACCAt) 및 전체 CCL(CCLt)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 1에 도시되어 있다.
실시예 Ⅰ
세파클로의 합성(7-ACCA는 과포화됨)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 300 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 7-ACCA 86.6 g(0.360 mol), FGA 67.8 g(0.450 mol), 이황화나트륨 4.0 g 및 물 402 g을 채웠다. 상기 혼합물을 T=10 ℃에서 5 분 동안 교반하고; pH는 7.4이었다.
교반하는 동안 농축한 수산화암모늄 16.8 g로 pH를 8.0으로 하였다. 계속해서, 20 분 내에 4N H2SO4 73.8 ㎖에서 미터링하여 pH를 8.0 내지 6.4로 감소시켰다. 다음에, t=0에 물 140 ㎖(T=10 ℃)에 의해 혼합물을 제조 반응기로부터 효소 반응기로 옮겼다.
효소 반응기내 교반기를 t=0; T=10 ℃에서 스위칭했다. pH는 4N H2SO4 적정에 의해 6.4로 유지하였다. 7 시간 후, 산 66.0 ㎖를 첨가하였다. 반응기는 300 mmol CCl(전환율=83 %), 55 mmol 7-ACCA, 100 mmol FGA, 45 mmol FG를 함유하였다.
반응 동안, 농도(C)(mmol)/용액내 FGA(FGAs), 전체 FGA(FGAt), 용액내 7-ACCA(ACCAs), 전체 7-ACCA(ACCAt) 및 전체 CCL(CCLt)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 2에 도시되어 있다.
실시예 Ⅱ
세파클로의 합성(과포화된 7-ACCA 및 7-ACCA는 효소반응동안 미터링됨)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 150 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 7-ACCA 48.1 g(0.200 mol), FGA 75.4 g(0.500 mol), 이황화나트륨 4.0 g 및 물 175 g을 채웠다. 상기 혼합물을 T=10 ℃에서 5 분 동안 교반하고; pH는 7.43이었다.
교반하는 동안 농축한 수산화암모늄 15.5 g로 pH를 9.0으로 하였다. 이 후에, 45 분내에 6N H2SO4 80.6 ㎖에서 미터링하여 pH를 9.0 내지 6.4로 감소시켰다. 다음으로, t=0에 물 40 g(T=10 ℃)로 혼합물을 제조 반응기로부터 효소 반응기로 옮겼다.
효소 반응기내 교반기를 t=0에 스위칭했다. 온도는 T=10 ℃로 유지하였다. 7-ACCA 용액 244 g(0.200 mol)을 109 분내에 일정한 속도로 미터링하였다. 물 183 g내 7-ACCA 48.1 g을 T=3 ℃로 현탁하고, 진한 NH3 13.2 g로 pH를 8.2로 높임으로써 용액을 새로 제조하였으며, 상기 방법에서 모든 7-ACCA가 용해된다. t=0으로부터, 효소 반응기내 pH를 6N H2SO4 적정으로 6.4로 유지하였다. t=350분에, 효소 반응기는 350 mmol CCl(전환율=88 %), 45 mmol 7-ACCA, 80 mmol FGA, 65 mmol FG를 함유하였다.
t=400분에, 세파클로의 양은 최대였으며, 6N H2SO4 적정에 의해 pH를 5.0으로 감소시켰다. 효소 반응기는 370 mmol CCl(전환율=92 %), 25 mmol 7-ACCA, 40 mmol FGA, 85 mmol FG를 함유하였다.
반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 FGA(FGAs), 전체 FGA(FGAt), 용액내 7-ACCA(ACCAs), 전체 7-ACCA(ACCAt) 및 전체 CCL(CCLt)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 3에 도시되어 있다.
비교 실시예 B
암피실린의 합성(6-APA는 과포화되지 않음)
먼저, FGA.1/2 H2SO4 용액을 제조하였다. FGA 301.6 g(2.00 mol)을 T=5 ℃에서 물 650 g에 현탁하였다. 96% H2SO4 102.1 g(1.00 mol)을 교반하면서 적상첨가하고, 온도를 냉각에 의해 T<25 ℃로 유지하였다.
다음에, 효소 축합화를 실시하였다. 175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 300 g을 채웠다.
제조 반응기(1.2 ℓ)에 6-APA 131.6 g(0.600 mol), FGA 30.2 g(0.200 mol) 및 물 400 ㎖(T=10 ℃)를 채웠다. 상기 혼합물을 T=10 ℃에서 15 분 동안 교반하고, 계속해서 t=0에 물 100 ㎖(T=10 ℃)로 효소 반응기에 옮겼다.
효소 반응기내 교반기를 t=0에서 스위칭했다. FGA.1/2H2SO4 423.7 g(0.800 mol)을 283 분내에 일정한 속도로 용액에 첨가하고, 온도를 10 ℃로 유지하였다. pH는 6.3이었다. t=328분으로부터, pH는 6N H2SO4 적정에 의해 6.3으로 유지하였다.
t=540분에, 암피실린의 양은 최대였으며, pH는 6N H2SO4를 첨가함으로써 5.6으로 감소시켰다.
효소 반응기는 575 mmol AMPI(=사용된 6-APA의 양에 대해 96 %), 15 mmol 6-APA, 50 mmol FGA, 365 mmol FG을 함유하였다.
반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 FGA(FGAs), 전체 FGA(FGAt), 용액내 6-APA(APAs), 전체 6-APA(APAt) 및 전체 Ampi(Ampit)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 4에 도시되어 있다.
실시예 Ⅲ
암피실린의 합성(6-APA는 과포화됨)
175㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5ℓ, 직경 11㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 300 g을 채웠다.
제조반응기(1.2ℓ)에 물 550 ㎖(T=10 ℃), FGA 138.8 g(0.920 mol) 및 6-APA 131.6 g(0.600 mol)을 채웠다. 5 분 후에 10 ℃에서, 7.4의 pH를 갖는 맑은 용액을 얻었다. 계속해서, 96% H2SO4(ca. 16 g)로 pH를 6.5로 하고, 10 ℃에서 5 분 동안 교반한 후 상기 용액을 물 100 ㎖(T=10 ℃)로 t=0에 효소 반응기에 옮겼다.
t=0에, 온도는 10 ℃였으며, pH는 6.3이었다. 효소반응 동안, pH는 6N H2SO4 적정에 의해 6.3으로 유지하였다. t=300분에, AMPI의 양은 최대였으며, pH는 6N H2SO4 적정에 의해 5.6으로 낮췄다.
효소 반응기는 575 mmol AMPI(=사용된 6-APA의 양에 대해 96 %), 15 mmol 6-APA, 40 mmol FGA, 295 mmol FG을 함유하였다.
반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 FGA(FGAs), 전체 FGA(FGAt), 용액내 6-APA(APAs), 전체 6-APA(APAt) 및 전체 Ampi(Ampit)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 5에 도시되어 있다.
비교 실시예 C
세팔렉신의 합성(7-ADCA는 과포화되지 않음)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 75 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 물 668g(T=4 ℃), 이황화나트륨 4.0 g, 7-ADCA 130.3 g(0.600 mol) 및 FGA 75.4 g(0.500 mol)을 채웠다. 농축한 수산화암모늄 7.8 g을 첨가하고, 현탁액을 T=4 ℃에서 15 분 동안 교반했다. pH는 7.8이었다.
계속해서, t=0에 물 50 ㎖(T=4 ℃)에 의해 현탁액을 효소 반응기로 옮겼다. 효소 반응기내 교반기를 t=0에 스위칭했다. 온도는 T=4 ℃에서 내내 유지하였다. 7-ADCA 용액 모두는 약 75 분 후에 용해되었으며; 그 후에 고체 어셈블라아제TM로부터 분리된 맑은 용액을 얻었다. 210 분 후에 pH는 8.6으로 높아졌다.
반응기는 393 mmol CEX(전환율=66 %; S/H=6.1), 200 mmol 7-ADCA, 64 mmol FG, 33 mmol FGA를 함유하였다.
전환율(%)의 함수로서 S/H(CEX(mmol)/FG(mmol))는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 Ⅳ
세팔렉신의 합성(7-ADCA는 과포화됨)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 75 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 물 600 ㎖(T=4 ℃), 이황화나트륨 4.0 g, 7-ADCA 130.3 g(0.600 mol) 및 FGA 90.5 g(0.600 mol)을 채웠다. 상기 현탁액을 T=4 ℃에서 15 분 동안 교반했다. pH는 7.6이었다.
교반하면서, 농축한 수산화암모늄 43.8 g을 이용하여 pH를 8.6으로 하였다. 교반은 T=4 ℃에서 5 분 동안 실시하였다. 계속해서 농축한 H2SO4 21.2 g을 첨가하였다. T=4 ℃에서 15 분간 상기 맑은 용액을 교반하였다. pH는 7.4였다.
계속해서, t=0에 물 50 ㎖(T=4 ℃)에 의해 현탁액을 효소 반응기로 옮겼다. 효소 반응기내 교반기를 t=0에 스위칭했다. 온도는 T=4 ℃로 내내 유지하였다. t=90분에 pH는 8.05로 올라갔다. 진한 H2SO4 5.5 g을 첨가하여 pH를 7.75로 감소시켰다. 효소 반응내내 고체 어셈블라아제TM로부터 분리된 맑은 용액이 존재했다. 340 분 후에 pH는 8.5로 올라갔다.
반응기는 445 mmol CEX(전환율=74 %; S/H=7.2), 146 mmol 7-ADCA, 62 mmol FG, 80 mmol FGA를 함유하였다.
전환율(%)의 함수로서 S/H(CEX(mmol)/FG(mmol))는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 Ⅴ
세팔렉신의 합성(7-ADCA는 과포화되지 않음)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 75 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 물 500 ㎖(T=4 ℃), 이황화나트륨 4.0 g, 7-ADCA 162.9 g(0.750 mol) 및 FGA 113.1 g(0.750 mol)을 채웠다. 상기 현탁액을 T=4 ℃에서 15 분 동안 교반했다. pH는 7.6이었다.
교반하면서, 농축한 수산화암모늄 55.6 g을 이용하여 pH를 8.7로 하였다. 교반은 T=4 ℃에서 5 분 동안 실시하였다. 계속해서 농축한 H2SO4 9.6 g을 첨가하였다. T=4 ℃에서 15 분 간 상기 맑은 용액을 교반하였다. pH는 8.0이었다.
계속해서, t=0에 물 50 ㎖(T=4 ℃)에 의해 현탁액을 효소 반응기로 옮겼다. 효소 반응기내 교반기를 t=0에 스위칭했다. 온도는 T=4 ℃로 내내 유지하였다. t=60분에 pH는 8.3으로 올라갔다. 농축한 H2SO4 적정에 의해 pH를 8.3에서 유지하였다.
t=300분에 진한 H2SO4 23.4 g 전체를 적정하였다. 상기 지점에서 적정을 멈추고; t=450분에 pH는 8.7로 올라갔다.
효소 반응내내 고체 어셈블라아제TM로부터 분리된 맑은 용액이 존재했다.
t=450분에 반응기는 545 mmol CEX(전환율=73 %; S/H=8.5), 195 mmol 7-ADCA, 64 mmol FG, 129 mmol FGA를 함유하였다.
전환율(%)의 함수로서 S/H(CEX(mmol)/FG(mmol))는 도 6에 도시되어 있다.
비교 실시예 D
세파드록실의 합성(7-ADCA도 FGHM도 과포화되지 않음)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 300 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 7-ADCA 63.7 ㎖(0.293 mol), FGHM 107.1 g(0.590 mol), 이황화나트륨 4.0 g 및 물 440 g을 채웠다. 농축한 수산화암모늄 7.5 g에 의해 pH를 7.0으로 유지하면서 상기 혼합물을 T=10 ℃에서 5 분 동안 교반했다.
t=0에 물 50 ㎖(T=10 ℃)에 의해 현탁액을 제조 반응기로부터 효소 반응기로 옮겼다. 효소 반응기내 교반기를 t=0에 스위칭했다. 온도는 T=10 ℃로 유지하고; pH는 7.0로 일정하게 유지하였다(적정없음).
380 분 후에 효소 반응기는 68 mmol 세파드록실(전환율=23 %; S/H=0.67), 222 mmol 7-ADCA, 420 mmol FGHM, 101 mmol FGH를 함유하였다.
반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 전체 세파드록실(세파드록실t), 전체 FGH(FGHs), 전체 FGHM(FGHMt), 용액내 FGHM(FGHMs), 전체 7-ADCA(7-ADCA t) 및 용액내 7-ADCA(7-ADCAs)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 7에 도시되어 있다.
실시예 Ⅵ
세파드록실의 합성(FGHM 및 7-ADCA 모두 과포화됨)
175 ㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소 반응기(1.5 ℓ, 직경 11 ㎝)에 네트-웨트 어셈블라아제TM 270 g을 채웠다.
제조반응기(1.2 ℓ)에 7-ADCA 97.7 ㎖(0.448 mol), 이황화나트륨 4.0 g 및 물 250 g(T=10 ℃)을 채웠다. T=10 ℃에서 현탁액을 5 분 동안 교반했다. 계속해서, NH3 40.3 g에 의해 pH를 8.1로 하고, 상기 방법에서 맑은 용액을 발생시켰다(T=10 ℃).
제2 제조 반응기에는 FGHM 98.5 g(0.538 mol), 물 60 g(T=10 ℃) 및 6N H2SO4 용액 105.1 g을 채웠다. 상기 용액을 T=10 ℃; pH=2.3으로 하였다.
7-ADCA 용액을 물 20 ㎖(T=10 ℃)에 의해 제1 제조 반응기로부터 효소 반응기로 옮겼다. 효소 반응기내 교반기를 스위칭했다. t=0으로부터, FGHM 용액을 120 분내에 일정한 속도로 제2 제조 반응기로부터 효소 반응기로 미터링하였다. 온도는 T=10 ℃에서 유지하였다.
30 분 후에, pH는 8.1에서 6.8로 감소하였다. 다음으로, pH는 농축된 수산화암모늄 적정에 의해 6.8로 유지하였다. t=120분에, 농축된 수산화암모늄 8.3 g을 첨가하였다. 적정을 멈추고; pH는 6.8로 지속하였다.
420 분 후에 효소 반응기는 390 mmol 세파드록실(전환율=87 %; S/H=4.0), 50 mmol 7-ADCA, 44 mmol FGHM, 97 mmol FGH를 함유하였다.
반응동안, 농도(C)(mmol)/용액내 전체 세파드록실(세파드록실t), 전체 FGH(FGHs), 전체 FGHM(FGHMt), 용액내 FGHM(FGHMs), 전체 7-ADCA(7-ADCA t) 및 용액내 7-ADCA(7-ADCAs)(㎏)은 시간(T)(분(min.))의 함수로서 도 8에 도시되어 있다.

Claims (16)

  1. 아실화제의 도움으로 β-락탐 핵을 효소 아실화 반응시키는 β-락탐 항생제의 제조 방법(여기서, 아실화제/β-락탐 핵의 몰 비율은 2.5 이하임)으로서,
    상기 아실화제, β-락탐 핵, 또는 아실화제 및 β-락탐 핵은 아실화 반응의 일부 또는 전부 중에 반응 혼합물내에 과포화되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    아실화제, β-락탐 핵, 또는 아실화제 및 β-락탐 핵은 아실화 반응 초기에 반응 혼합물내에 과포화되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    아실화 반응이 실행되는 pH와는 상이한 pH 또는 아실화 반응이 실행되는 온도 이상의 온도를 갖는 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제의 농축된 슬러리 또는 용액은 아실화 반응 중에 반응 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    β-락탐 핵은 반응 혼합물내에 과포화되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    β-락탐 핵이 용해된 혼합물의 pH는 pH가 3.0 내지 9.0에 도달할 때 까지 감소 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    pH의 감소 또는 pH의 증가는 pH가 4.0 내지 8.5에 도달할 때 까지 실행하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아실화제는 반응 혼합물내에 과포화되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    아실화제가 용해된 혼합물의 pH를 증가시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 pH를 5.5 이상의 pH로 증가시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 pH를 6 이상의 pH로 증가시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  11. 제 4 항에 있어서,
    용해된 β-락탐 핵, 아실화제, 또는 β-락탐 핵 및 아실화제를 함유하는 혼합물의 온도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 온도를 15 ℃ 이하의 온도로 감소시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 온도를 10 ℃ 이하의 온도로 감소시키는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  14. 제 7 항에 있어서,
    p-히드록시페닐 글리신의 메틸 에스테르를 아실화제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미드를 아실화제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제의 제조 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 (7-ADCA), 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복시산(7-ACCA), 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA), 7-아미노-3-(1-프로페닐)-세프-3-엠-4-카르복시산(7-PACA), 7-아미노-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일-티오메틸)-세프-3-엠-4-카르복시산(7-ACA-MMTD) 또는 7-아미노-3-클로로-8-옥소-1-아자비시클로[4.2.0]옥-2-텐-2-카르복시산을 β-락탐 핵으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 β-락탐의 제조 방법.
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