KR101203287B1 - 세파클로르의 합성 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 반응 혼합물 중 효소의 존재 하에서, 7-아미노-3-클로로 세팔로스포란산(7-ACCA)을 활성화 형태의 D-페닐 글리신과 반응시켜 세파클로르를 형성하는 것을 포함하는 세파클로르의 합성 방법에 관한 것이며, 이때 적어도 7-ACCA 및/또는 PGa의 일부를 상기 반응 과정 동안 상기 반응 혼합물에 첨가한다. 또한, 본 발명은 10중량% 초과량의 세파클로르, 2중량% 미만량의 7-아미노-3-클로로 세팔로스포란산 및 2중량% 미만량의 D-페닐 글리신을 포함하는 수성 혼합물 및 상기 수성 혼합물로부터 세파클로르를 회수하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 0.250 미만의 400nm에서의 흡광도(A400)를 갖는 결정형 세파클로르에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 효소의 존재 하에 7-아미노-3-클로로 세팔로스포란산(7-ACCA)을 활성화 형태의 D-페닐 글리신과 반응시키는 것을 포함하는 세파클로르의 합성 방법, 세파클로르를 포함하는 수성 혼합물 및 상기 수성 혼합물로부터 세파클로르를 회수하는 방법에 관한 것이다.
효소에 의한 세파클로르의 합성 방법은 다양한 문헌에 공지되어 있다. 유럽 특허 제 567323 호는, 0 내지 20℃의 온도 및 주변 pH에서, 7-ACCA에 대한 D-페닐 글리신 메틸 에스터의 높은 몰 비(5 내지 6)로 효소에 의해 세파클로르를 합성하는 방법을 개시하고 있으며, 이것은 93% 및 88.2%의 수율을 제공한다. β-락탐 핵에 대한 활성화된 측쇄의 높은 몰 비는, 수반 비용을 증가시키고, 효소에 의한 합성 반응에서 최종 항생제(세파클로르)로부터 분리하기 어려운 부산물(예를 들어, D-페닐 글리신)의 형성을 증가시키기 때문에 바람직하지 않다.
유럽 특허 제 730035 호는 효소에 의한 세파클로르의 합성 반응에서 7-ACCA에 대한 D-페닐 글리신 아마이드의 몰 비를 감소시키는 것을 목적으로 한다. 페니 실린 G 아미다제 효소를 아즐락톤 중합체 상에 고정함으로써 7-ACCA 당 세파클로르의 수율이 98% 및 94%로 얻어지며, 이때 7-ACCA에 대한 D-페닐 글리신 아마이드의 몰 비는 2 내지 3이다.
본 발명자들은 7-ACCA에 대한 활성화 형태의 D-페닐 글리신의 몰 비가 약 2 내지 3이면, 효소에 의한 세파클로르의 합성 반응 동안 형성되는 부산물의 양이 매우 많다는 것을 밝혔으며, 상기 부산물은 반응 혼합물로부터 세파클로르를 회수하는 동안에 공정성 문제를 일으키고/일으키거나, 실질적으로 순수한 형태의 세파클로르가 수득될 수 없게 한다.
본 발명의 목적은 이러한 결점을 갖지 않으면서, 7-ACCA 및 활성화 형태의 D-페닐 글리신으로부터 효소에 의해 세파클로르를 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
이것은, 본 발명에 따르면, 반응 혼합물 중 효소의 존재 하에서, 7-아미노-3-클로로-세팔로스포란산(7-ACCA)을 활성화 형태의 D-페닐 글리신(PGa)과 반응시켜 세파클로르를 형성하는 것을 포함하고, 이때 7-ACCA 및/또는 PGa는 상기 반응 과정 동안 상기 반응 혼합물에 첨가되는, 효소에 의한 세파클로르의 합성 방법으로써 달성된다.
놀랍게도, 상기 반응에 사용되는 7-ACCA 및 PGa의 총 량을 상기 반응 시작 시에 첨가하는 효소 합성 방법에 비해, 본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법에서 7-ACCA 당 생성되는 세파클로르의 양이 더 많다는 것이 밝혀졌다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법에서는 세파클로르의 전환율이 90% 초과, 바람직하게는 92% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 더욱 바람직하게는 96% 초과일 수 있음이 밝혀졌다.
본원에 사용된 "세파클로르의 전환율"은, (생성된 세파클로르의 양(몰))/(반응 혼합물에 첨가된 7-ACCA의 총량(몰))으로 정의된다.
세파클로르의 수율은, 반응 혼합물로부터 회수된 세파클로르의 양(몰)/첨가된 7-ACCA의 총량(몰)으로 정의된다.
추가적으로, 본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법에서는 매우 적은 양의 부산물이 형성됨이 밝혀졌다. 반응 혼합물 중에서 부산물(예를 들어, D-페닐 글리신)의 농도가 낮으면, 이것은 반응 혼합물로부터 실질적으로 순수한 형태로 세파클로르를 회수하는 것이 가능함을 나타낸다. 실질적으로 순수한 형태의 세파클로르는 94중량% 이상, 바람직하게는 95중량% 이상, 바람직하게는 96중량% 이상, 바람직하게는 97중량% 이상, 바람직하게는 98중량% 이상, 바람직하게는 99중량% 이상의 세파클로르를 포함하는 생성물로 정의될 수 있다.
본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법에서, 7-ACCA 및 PGa는 7-ACCA에 대한 PGa의 몰 비가 2 미만, 바람직하게는 1.8 미만, 더욱 바람직하게는 1.5 미만, 가장 바람직하게는 1.2 미만이 되도록 반응 혼합물에 첨가되는 것이 바람직하다. 7-ACCA에 대한 PGa의 몰 비가 이러한 값 미만으로 유지되면, 합성 반응 동안 부산물이 거의 형성되지 않으며, 세파클로르를 회수하는 동안 공정성 문제가 거의 발생하지 않는다는 것이 밝혀졌다.
본원에서 사용된 7-ACCA에 대한 PGa의 몰 비는, 반응 혼합물에 첨가된 PGa의 총량(몰)을 반응 혼합물에 첨가된 7-ACCA의 총량(몰)으로 나눈 것으로 정의된다.
본 발명에 따른 효소에 의한 세파클로르 합성 방법에서는, 7-ACCA 및/또는 PGa이 반응 과정 동안 반응 혼합물에 첨가된다. 바람직하게는 반응 혼합물에 첨가되어야 할 7-ACCA 및/또는 PGa의 총량의 적어도 일부는, 10분 초과, 바람직하게는 20분 초과, 바람직하게는 30분 초과, 바람직하게는 60분 초과, 바람직하게는 90분 초과 및 바람직하게는 360분 미만, 바람직하게는 240분 미만, 바람직하게는 120분 미만의 합성 반응 과정 중에 연속적인 방식 또는 간헐적인 방식으로 반응 혼합물에 첨가된다.
본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법은, PGa가 합성 반응 과정 중에 반응 혼합물에 첨가되는 방법인 것이 바람직하다. PGa는 고체 형태 또는 용액 형태로 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 PGa는 아마이드(예를 들면, 1차, 2차 또는 3차 아마이드) 또는 D-페닐 글리신의 에스터일 수 있다. 바람직하게는 PGa가 D-페닐 글리신의 에스터, 예를 들면, D-페닐 글리신의 저급 알킬(C1-4) 에스터(예컨대 D-페닐 글리신의 메틸, 에틸 또는 아이소프로필 에스터)이다. 바람직하게는 D-페닐 글리신 메틸 에스터(PGM)이고, 가장 바람직하게는 염 형태의 PGM, 예를 들면, PGM의 포름산, 메탄 설폰산 또는 염산 염이다. 또한, 다른 D-페닐 글리신 에스터의 포름산, 메탄 설폰산 또는 염산 염도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 7-ACCA를 PGa와 반응시켜 세파클로르를 제조하는 공정에는 촉매로 적합한 임의의 효소가 사용될 수 있다. 이러한 효소는 예를 들어 페니실린 아실라제 또는 페니실린 G 아실라제(또한, 페니실린 G 아미다제 또는 벤질페니실린 아실라제(EC 3.5.1.11)라고 지칭됨)라는 일반 명칭으로 공지된 효소이다. 페니실린 G 아실라제는 페니실린의 6-아실기 또는 세팔로스포린의 7-아실기를 가수분해할 수 있는 미생물, 특히 박테리아로부터의 가수 분해 효소의 그룹을 지칭하는 것이다. 페니실린 아실라제 효소는 이의 기질 특이성 및 이의 분자 구조를 기준으로 분류될 수 있으며, 이것은 다양한 공개 문헌에 기술되어 있다(예를 들면, 국제 특허 공개 제 03/055998 호 및 국제 특허 공개 제 98/20120 호를 참조).
페니실린 아실라제 효소가 수득될 수 있는 미생물은 예를 들어 아세토 박터(Acetobacter)(특히 아세토박터 파스테리아늄(Acetobacter pasteurianum)), 에어로모나스(Aeromonas), 알칼리게네스(Alcaligenes)(특히 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis)), 아파노클라디움(Aphanocladium), 바실러스 속(Bacillus sp.)(특히 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 에스케리치아(Escherichia)(특히 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli, 이. 콜라이)), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸사리움(Fusarium)(특히 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)), 클루이베라(Kluyvera), 마이코플라나(Mycoplana), 프로타미노박터(Protaminobacter), 프로테우스(Proteus)(특히 프로테우스 레트가리(Proteus rettgari)), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 잔토모나스(Xanthomonas)(특히 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citrii))이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 세파클로르의 합성 방법에서의 효소는 돌연변이 효소이다.
페니실린 아실라제의 돌연변이 또는 아실라제 돌연변이는 임의의 공지된 페니실린 아실라제로부터 출발하여 제조될 수 있다. 돌연변이 아실라제는 예를 들어 당분야에 공지된 재조합 DNA 방법을 통해 하나의 아미노산 잔기가 새로운 잔기로 치환됨으로써, 야생형 아실라제로부터 유도된다.
본 발명의 방법에 사용되는 돌연변이 페니실린 아실라제는 예를 들어 이. 콜라이의 야생형 아실라제에 비해 더 높은 S/H 비를 갖는 페니실린 아실라제일 수 있다.
본원에서 정의된 합성/가수분해(S/H) 비는, 효소에 의한 반응 동안의 특정 시점에서 가수분해 생성물에 대한 합성 생성물의 몰 비로 이해된다. 합성 생성물은 활성화 측쇄 및 β-락탐 핵으로부터 형성된 β-락탐 항생제로 이해된다. 가수분해 생성물은 활성화 측쇄의 대응 산으로 이해된다.
상기 S/H 비는 반응물의 농도, β-락탐 핵에 대한 활성화 측쇄의 몰 비, 온도, pH 및 효소의 함수이다. 이상적인 상황에서는, 특정 후보 물질이 기준 효소, 바람직하게는 이. 콜라이 페니실린 G(PenG) 아실라제에 대해 동일한 조건 하에서 시험되는 비교 실험이 수행된다. S/H 비의 결정 방법에 대해서는 국제 특허 공개 제 03/055998 호에 상세하게 기술되어 있다.
바람직하게는 상기 돌연변이 효소는, 이. 콜라이의 페니실린 아실라제의 β-서브유닛(subunit)에 대응하는 β-서브유닛의 24 위치에서 아미노산이 치환된 돌연변이 페니실린 아실라제이다. 바람직한 양태에서는, 국제 특허 공개 제 98/20120 호에 기술된 대로, 이. 콜라이의 페니실린 아실라제의 β-서브유닛에 대응하는 β-서브유닛의 24 위치에서 L-페닐-알라닌이 L-알라닌으로 치환된다. 이러한 돌연변이는 이. 콜라이로부터의 PenG 아실라제에 적용될 수 있으나, 다른 공급원으로부터의 PenG 아실라제에도 또한 사용될 수 있다. 아미노산의 위치에 대한 번호는 이. 콜라이의 야생형 페니실린 G 아실라제의 아미노산 서열에 대한 번호에 대응한다.
본 발명의 추가적으로 바람직한 양태에서, 상기 효소는 담체 상에 고정화될 수 있다. 고정화된 형태에서, 상기 효소는 용이하게 분리되고 재순환될 수 있다. 고정화된 효소는 그 자체로 공지되어 있으며, 시판되고 있고, 예를 들면, 국제 특허 공개 제 92/12782 호에 기술된 대로 단리되고, 유럽 특허 제 222462 호 및 국제 특허 공개 제 97/04086 호에 기술된 대로 고정화된 이. 콜라이 페니실린 아실라제가 있다.
본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법은 임의의 적합한 pH에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 효소에 의한 합성 반응이 pH 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.7, 더욱 바람직하게는 6.8 내지 7.2에서 수행된다. 반응 혼합물의 pH는 임의의 적합한 유기 염기 또는 무기 염기, 또는 임의의 적합한 유기산 또는 무기산을 사용하여 정확한 pH 값으로 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법은 임의의 적합한 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는 효소에 의한 합성 반응이 5 내지 35℃, 바람직하게는 8 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 18 내지 23℃의 온도에서 수행된다. 또한, 효소에 의한 합성 반응은 8 내지 16℃, 바람직하게는 9 내지 15℃, 바람직하게는 10 내지 14℃에서 수행될 수 있다.
효소에 의한 세파클로르의 합성 방법에서 반응 혼합물은 원칙적으로 수성 반응 혼합물이다. 상기 수성 반응 혼합물은, 액체의 총 부피에 대해 바람직하게는 30부피% 미만, 더욱 바람직하게는 20부피% 미만, 더욱 바람직하게는 10부피% 미만, 더욱 바람직하게는 5부피% 미만의 유기 용매 또는 유기 용매들의 혼합물을 함유할 수 있다. 바람직하게는 상기 유기 용매가 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 알콜, 예를 들어 모노-알콜(특히 메탄올 또는 에탄올), 다이올(특히 에틸렌 글리콜) 또는 트라이올(특히 글리세롤)이다. 바람직하게는 상기 수성 반응 혼합물이, 액체의 총 부피에 대해 70부피% 이상, 더욱 바람직하게는 80부피% 이상, 더욱 바람직하게는 90부피% 이상, 가장 바람직하게는 95부피% 이상의 물을 함유한다.
효소에 의한 합성 반응의 마지막에, 상기 반응 혼합물의 온도를 5℃ 미만, 바람직하게는 4℃ 미만, 및 바람직하게는 0℃ 초과로 낮출 수 있다.
효소에 의한 합성 반응의 마지막에, 형성된 세파클로르를 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 상기 수성 반응 혼합물로부터 회수할 수 있다.
또한, 본 발명은 세파클로르, 7-아미노-3-클로로 세팔로스포란산(7-ACCA) 및 D-페닐 글리신(PG)을 포함하는 수성 혼합물에 관한 것이며, 이때 상기 수성 혼합물은 10중량% 초과량의 세파클로르, 2 중량% 미만량의 7-ACCA 및 2 중량% 미만량의 PG를 포함한다. 이 수성 혼합물은 본 발명에 따른 세파클로르의 합성 방법에 의해 유리하게 수득될 수 있다. 바람직하게는 상기 수성 혼합물이 12중량% 초과, 더욱 바람직하게는 15중량% 초과의 세파클로르 양을 포함하고, 바람직하게는 상기 수성 혼합물 중의 세파클로르 양이 50중량% 미만, 더욱 바람직하게는 30중량% 미만이다. 바람직하게는 상기 수성 혼합물이 1.5중량% 미만, 더욱 바람직하게는 1중량% 미만, 더욱 바람직하게는 0.8중량% 미만, 더욱 바람직하게는 0.6중량% 미만, 더욱 바람직하게는 0.4중량% 미만의 7-ACCA 양을 포함한다. 바람직하게는 상기 수성 혼합물이 1.5중량% 미만, 바람직하게는 1.2중량% 미만, 더욱 바람직하게는 1중량% 미만, 더욱 바람직하게는 0.8중량% 미만의 PG 양을 포함한다. 놀랍게도 세파클로르가 실질적으로 순수한 형태로, 가공성 문제가 거의 또는 전혀 없이 본 발명에 따른 수성 혼합물로부터 용이하게 회수될 수 있음이 밝혀졌다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 수성 혼합물로부터 세파클로르를 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 회수하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상부쪽으로 교반하면서 기부의 체(bottom sieve)를 통해 수성 혼합물로부터 세파클로르를 회수하여(예를 들어 NL 1006267 참고), 세파클로르 결정을 포함하는 현탁액을 생성한다.
본 발명에 따른 수성 혼합물 또는 세파클로르 결정을 포함하는 현탁액을 pH 0.5 내지 2로 산성화하여, 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 생성할 수 있다. pH 0.5 내지 2로 산성화하는 것은 임의의 적합한 무기산(예를 들면, 염산, 질산 또는 황산) 또는 임의의 적합한 유기산(예를 들면, 포름산, 아세트산 또는 구연산)을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 염산이 본 발명에 따른 수성 혼합물 또는 세파클로르 결정을 포함하는 현탁액을 산성화하여 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 생성하는 데 사용된다.
본 발명에 따른 수성 혼합물 또는 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 pH 4 내지 6이 되게 할 수 있으며, 이에 따라 세파클로르 결정이 형성된다. 본 발명에 따른 수성 혼합물 또는 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 pH 4 내지 6이 되게 하는데 적합한 염기는 무기 염기(예를 들면, 암모니아, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨) 또는 유기 염기(예를 들면, 트라이에틸아민 또는 구아니딘)이다. 바람직하게는 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 pH 4 내지 6이 되게 하는 데 암모니아가 사용된다.
세파클로르는 임의의 적합한 형태, 특히 세파클로르 수화물, 예를 들어 세파클로르 일수화물의 형태로 결정화될 수 있다.
용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 pH 4 내지 6이 되게 하여 형성된 세파클로르 결정은 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 상기 용액으로부터 분리하여, 세파클로르 결정을 포함하는 습윤 케이크(wet cake)를 생성할 수 있다. 이후에, 상기 세파클로르 결정을 포함하는 습윤 케이크는 당 분야에 공지된 임의의 방법으로 세척하고 건조할 수 있다.
놀랍게도 본 발명에 따른 수성 혼합물로부터 세파클로르를 수득하는 방법에 의해 수득된 세파클로르 결정이 저착색도를 갖는 세파클로르 결정을 생성한다는 것이 밝혀졌다. 바람직하게는, 상기 저착색도를 갖는 세파클로르 결정이, 본 발명에 따른 효소에 의한 세파클로르의 합성 방법에 의해 수득된 수성 혼합물로부터 수득된다.
본 발명의 범주에서 세파클로르 결정의 저착색도는 400nm에서 낮은 흡광도, 예를 들어 400nm에서 0.250 미만의 흡광도로서 정의될 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서 본 발명은 0.5g의 세파클로르를 10ml의 1N HCl 용액에 용해시킨 용액에 대해 실온에서 90초 후에 400nm에서의 흡광도(A400)를 측정할 때, 0.250 미만, 바람직하게는 0.200 미만, 바람직하게는 0.150 미만, 바람직하게는 0.100 미만, 바람직하게는 0.090 미만, 바람직하게는 0.080 미만, 바람직하게는 0.070 미만, 바람직하게는 0.060 미만, 바람직하게는 0.050 미만의 A400을 갖는 결정 형태의 세파클로르에 관한 것이다.
세파클로르는 착화체의 존재 하에 안정화될 수 있다. 상기 착화제는 합성 반응 동안 반응 혼합물에 첨가될 수 있으며, 합성 반응이 완료된 후의 반응 혼합물 또는 본 발명에 따른 수성 혼합물에 첨가될 수 있다. 또한, 착화제는 세파클로르의 회수 공정 중에 첨가될 수 있다. 적합한 착화제는 나프탈렌, 키놀린, 안트라키논설폰산 또는 파라벤일 수 있다. 착화제의 예는 1-나프톨, 2-나프톨, 2,6-다이하이드록시나프탈렌 및 안트라키논-1,5-다이설폰산이다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지만, 이로 한정하여 해석되지는 않는다.
효소 및 고정화
본원에서 사용된 페니실린 아실라제는 국제 특허 공개 제 98/20120 호에 기술된 이. 콜라이 PenG 아실라제 돌연변이 Phe-B24-Ala이다. 이 효소를 유럽 특허 제 222462 호 및 국제 특허 공개 제 97/04086 호에 기술된 대로 젤라틴 및 키토산을 겔화제로 사용하고 글루타르알데하이드를 가교제로 사용하여 고정화하였다.
실시예 1
a) 효소에 의한 세파클로르의 합성
175㎛의 기부의 체를 가진 반응기를 5.0g의 고정화된 PenG 아실라제 돌연변이 Phe-B24-Ala로 충전하였다. 13.9g(58.1mmol)의 7-ACCA, 0.1g의 나트륨 설파이트 및 60g의 물을 20℃에서 첨가하고, 암모니아를 사용하여 pH를 7로 조정하였다.
20℃에서, 별도의 용기에서 12.9g(63.8mmol)의 PGM HCl 염을 21g의 물과 혼합하여 PGM 용액을 제조하였다.
상기 PGM 용액을 t=0부터 t=117분까지 일정한 속도로 반응기에 투여하였다. t=0(PGM 용액이 처음 투여되는 때)에서 효소에 의한 축합 반응이 개시되었다. 암모니아를 사용하여 pH를 7로 유지하였다.
t=150분에서, 세파클로르, 7-ACCA, PGM 및 PG의 농도는 각각 17.5중량%, 0.33중량%, 0.23중량% 및 0.79중량%였다.
t=150분에서, 첨가된 7-ACCA 당 세파클로르로의 전환률은 97.0%였고, S/H 비는 9.1이었다.
이어서, 염산 용액을 사용하여 pH를 5.3으로 낮추었다. 온도는 2℃로 낮추 었다.
b) 세파클로르의 회수
상부쪽으로 교반하면서 기부의 체를 통해 반응기를 비웠다. 생성된 세파클로르 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하였다. 생성된 모액을 상기 반응기로 다시 이송하였다. 이러한 절차를 5회 반복하였다. 이렇게 하여, 고체의 바이오촉매로부터 95% 초과의 고체 세파클로르를 분리하였다.
세파클로르 습윤 케이크와 모액을 합하고, 온도를 2℃로 유지하였다. 합쳐진 세파클로르 습윤 케이크와 모액의 pH를 염산을 사용하여 0.8까지 낮추고, 생성된 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
결정화 반응기를 34g의 물 및 시드(seed)인 1.0g의 세파클로르로 충전하였다. 전술된 산성 세파클로르 용액을 35℃에서 60분 내에 결정화 반응기에 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 5.0으로 유지하였다. 이어서, 온도를 단계적으로 낮추었다: 30℃에서 30분, 25℃에서 30분 및 20℃에서 60분. 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하고, 습윤 케이크를 1부피의 물 및 2부피의 아세톤으로 세척하였다. 건조 후, 15.7g의 세파클로르 일수화물을 수득하였다(순도 99.4%).
비교예
a) 효소에 의한 세파클로르의 합성
175㎛의 기부의 체를 가진 반응기를 5.0g의 고정화된 PenG 아실라제 돌연변이 Phe-B24-Ala로 충전하였다. 13.9g(58.1mmol)의 7-ACCA, 0.1g의 나트륨 설파이트 및 81g의 물을 20℃에서 첨가하고, 암모니아를 사용하여 pH를 7로 조정하였다.
12.9g(63.8mmol)의 PGM HCl 염을 반응기에 첨가하여, 효소에 의한 축합 반응을 개시하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 7로 유지하였다. 고점성의 셔벗(sorbet) 같은 현탁액이 형성되었다.
t=150분에서, 세파클로르, 7-ACCA, PGM 및 PG의 농도는 각각 10.5중량%, 4.71중량%, 0.11중량% 및 3.96중량%였다. 7-ACCA에 대해 세파클로르로의 전환률은 59%였고, S/H 비는 1.1이었다.
이어서, 염산 용액을 사용하여 pH를 5.3까지 낮추었다. 온도는 2℃까지 감소시켰다.
b) 세파클로르의 회수
상부쪽으로 교반하면서 기부의 체를 통해 반응기를 비웠다. 그러나, 고점성 때문에, 고정화된 바이오촉매로부터 세파클로르 현탁액을 분리하는 것이 불가능하였다.
실시예 2
a) 효소에 의한 세파클로르의 합성
175㎛의 기부의 체를 가진 반응기를 10.0g의 고정화된 PenG 아실라제 돌연변이 Phe-B24-Ala로 충전하였다. 13.9g(58.1mmol)의 7-ACCA 및 52.5g의 물을 10℃에서 첨가하고, 암모니아를 사용하여 pH를 7로 조정하였다.
10℃에서, 별도의 용기에서 16.7g(63.7mmol)의 PGM 메탄 설폰산(MSA) 염을 20g의 물과 혼합하여 PGM 용액을 제조하였다.
상기 PGM 용액을 t=0부터 t=90분까지 일정한 속도로 반응기에 투여하였다. t=0(PGM 용액이 처음 투여되는 때)에서 효소에 의한 축합 반응이 개시되었다. 암모니아를 사용하여 pH를 7로 유지하였다. 온도는 12℃로 유지하였다. t=120분부터 t=180분까지, 온도를 12℃에서 2℃까지 선형적으로 감소시켰다.
t=190분에서, 세파클로르, 7-ACCA, PGM 및 PG의 농도는 각각 18.1중량%, 0.20중량%, 0.04중량% 및 0.64중량%이었다.
t=190분에서, 첨가된 7-ACCA 당 생성된 세파클로르의 전환률은 98.0%이었고, S/H 비는 12이었다.
이어서, 염산 용액을 사용하여 pH를 5.0까지 낮추었다.
b) 세파클로르의 회수
상부쪽으로 교반하면서 기부의 체를 통해 반응기를 비웠다. 생성된 세파클로르 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하였다. 생성된 모액을 상기 반응기로 다시 이송하였다. 이러한 절차를 5회 반복하였다. 이어서, 효소를 10ml의 물로 2회 세척하였다. 이렇게 하여, 고체의 바이오촉매로부터 95% 이상의 세파클로르를 분리하였다.
세파클로르 습윤 케이크, 모액 및 세척액을 합하고, 온도를 2℃로 유지하였다. 합쳐진 습윤 케이크와 모액의 pH를 염산을 사용하여 0.5까지 낮추고, 생성된 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
결정화 반응기를 10g의 물로 충전하였다. 전술된 산성 세파클로르 용액을 35℃에서 30분 내에 결정화 반응기에 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 5.0으로 유지하였다. 이어서, 현탁액을 10℃에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 상 기 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하고, 습윤 케이크를 15ml의 물로 2회, 15ml의 아세톤으로 2회 세척하였다. 건조 후, 18.3g의 세파클로르 일수화물을 수득하였다(순도 99.6%).
실시예 3
세파클로르의 착색도
실시예 2로부터 수득된 세파클로르의 착색도를 400nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
0.5g의 세파클로르 일수화물을 10ml의 1N HCl 용액에 용해시켰다. 실온에서, 400nm에서의 흡광도(A400)를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 550 S 분광광도계 상에서 1N HCl 용액을 기준 용액으로 하여 결정하였다. A400은 90초 후에 결정하였다. 실시예 2에 기술된 대로 단리하고 건조시킨 후 바로 측정된 세파클로르 일수화물의 흡광도는 0.036이었다. 실시예 2로부터의 세파클로르 일수화물 결정을 실온 및 70% 상대 습도에서 4주간 저장한 후에, 세파클로르 일수화물의 흡광도는 0.043이었다.
Claims (16)
- 반응 혼합물 중 효소의 존재 하에서, 7-아미노-3-클로로 세팔로스포란산(7-ACCA)을 활성화 형태의 D-페닐 글리신(PGa)과 반응시켜 세파클로르를 형성하는 것을 포함하고, 이때 PGa를 상기 반응 과정 동안 상기 반응 혼합물 중에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 세파클로르의 합성 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,PGa가 D-페닐 글리신의 에스터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,상기 효소가, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 페니실린 아실라제의 β-서브유닛(subunit)에 대응하는 β-서브유닛의 24 위치에서 L-페닐알라닌으로부터 L-알라닌으로의 아미노산 치환을 가지는 돌연변이 페니실린 아실라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,상기 합성 반응이 pH 6 내지 8에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,상기 합성 반응이 5 내지 35℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,세파클로르를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 세파클로르를 회수하는 것이 상기 반응의 끝에 얻어진 혼합물을 pH 4 내지 6이 되게 하는 것을 포함하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 세파클로르를 회수하는 것이 기부의 체(bottom sieve)를 통해 세파클로르를 회수하여, 세파클로르 결정을 포함하는 현탁액을 생성하는 것을 포함하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 세파클로르를 회수하는 것이 상기 반응의 끝에 얻어진 혼합물을 pH 0.5 내지 2로 산성화하여, 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 생성하는 것을 포함하는 방법.
- 제 12 항에 있어서,상기 세파클로르를 회수하는 것이 세파클로르 결정을 포함하는 현탁액을 pH 0.5 내지 2로 산성화하여, 용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 생성하는 것을 포함하는 방법.
- 제 13 항에 있어서,용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 염기를 사용하여 pH 4 내지 6이 되게 함으로써 세파클로르 결정을 형성하는 것을 추가의 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서,용해된 세파클로르를 포함하는 산 용액을 염기를 사용하여 pH 4 내지 6이 되게 함으로써 세파클로르 결정을 형성하는 것을 추가의 특징으로 하는 방법.
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