CN100507000C - 制备头孢拉定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了制备头孢拉定的方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定，使得7-ADCA到头孢拉定的转化率为至少70%，其中，反应混合物中D-二氢苯基甘氨酸(DH)的浓度小于2wt.%，其中，7-ADCA到头孢拉定的转化率等于(nCEF/n7-ADCA)×100%，其中，nCEF＝形成的头孢拉定的数量(以摩尔计)，n7-ADCA＝加入到反应混合物中的7-ADCA的总量(以摩尔计)。本发明还描述了制备头孢拉定水合物的方法，其特征在于，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与DHa反应，形成头孢拉定；制备包含至少部分头孢拉定的水溶液；以及使头孢拉定从所述水溶液中结晶出来。本发明还描述了可通过根据本发明的方法获得的头孢拉定水合物。本发明还描述了450nm处吸光度小于0.050的头孢拉定水合物。
Description
本发明涉及制备头孢拉定的方法，所述方法包括：在存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应；本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的头孢拉定。
WO-A-97/04086公开了用酶来生产β-内酰胺抗生素的方法，其通过用母体β-内酰胺与活化形式的侧链反应来实现，其中包括用7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应来制备头孢拉定。该公开文本除描述了合成反应，即活性侧链与母体β-内酰胺的反应之外，还描述了通过目标产物和活性侧链的水解会形成侧链酸。在头孢拉定的酶生产的情况下形成的侧链酸是D-二氢苯基甘氨酸(DH)。WO 97/04086此外还公开了在存在野生型E.coli酰基转移酶的情况下对头孢拉定进行的酶合成，其示出，当青霉素酰基转移酶被固定到特定的载体上时，会获得增加的合成/水解(S/H)比例。
在WO 97/04086的方法中，已获得了高达68％的从7-ADCA和二氢苯基甘氨酸甲酯到头孢拉定的转化率。
人们发现，当寻找能使转化率增加的头孢拉定的酶合成方法时，会遇到显著的可加工性的问题。具体而言，人们发现，当增大转化率时，反应混合物可能会变得高度粘滞，并且所述增加的粘度甚至会使得更高的转化率无法以实用的方式实现。
本发明的目的是使得7-ADCA和DHa能以高转化率转化为头孢拉定。
该目的是通过本发明来实现的，本发明提供了制备头孢拉定的方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定，使得7-ADCA到头孢拉定的转化率为至少70％，其中，反应混合物中D-二氢苯基甘氨酸(DH)的浓度小于2wt.％。
我们惊奇地发现，粘滞的混合物是反应期间形成的水解产物(即，DH)结晶的结果。通过根据本发明将DH保持在低浓度，就可以使得DH的结晶被最小化或被避免，并可以获得增加的转化率，而不会遇到可加工性方面的问题。根据本发明的方法的进一步的好处在于从反应混合物中回收头孢拉定可以以简单的方法来进行，从而获得稳定、优质的产物。
本文中使用的7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸也被称为7-ADCA。
本文中使用的活化形式的D-二氢苯基甘氨酸也被称为DHa。
本文中使用的D-二氢苯基甘氨酸也被称为DH。
根据本发明的方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定，使得7-ADCA到头孢拉定的转化率为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％。本文中使用的7-ADCA到头孢拉定的转化率被定义为(nCEF/n7-ADCA)×100％，其中，
nCEF＝所形成的头孢拉定的总量(以摩尔计)，以及，
n7-ADCA＝加入到反应混合物中的7-ADCA的总量(以摩尔计)。
所形成的头孢拉定可以在反应混合物中以例如溶解形式和/或固体形式的任何形式存在，例如为头孢拉定水合物。
可用任何合适的方式将7-ADCA加入到反应混合物中。一次性将全部数量的7-ADCA加入到反应混合物中是可行的。将至少部分7-ADCA在反应过程期间加入到反应混合物中也是可行的。
根据本发明，反应混合物中DH的浓度小于2wt.％。优选地，反应混合物中DH的浓度小于1.5wt.％，更优选小于1.0wt.％，更优选小于0.8wt.％。反应混合物中DH的降低的浓度可以有如下优点：由于DH的结晶导致的粘滞混合物的形成被进一步减少或被完全避免。本文中使用的以wt.％表示的DH的浓度是相对反应混合物的总重给出的，即包括可能存在于反应混合物中的液相重量和固体组分的重量在内的总重，所述固体组分例如是被固定的酶和/或固体反应物或反应产物。
反应混合物可以是下述任何合适的混合物，在所述混合物中，可在存在酶的情况下，进行7-ADCA与活化形式的DH的反应。优选地，反应混合物是水性反应混合物。水性反应混合物还可以含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选地，所述有机溶剂或有机溶剂的混合物的含量小于30vol.％，更优选地，小于20vol.％，更优选地，小于10vol.％，更优选地，小于5vol.％(相对液体总体积而言)。优选地，有机溶剂是具有1-7个碳原子的醇，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二醇，特别是乙二醇；或三醇，特别是甘油。优选地，水性反应混合物含有至少70vol.％的水，更优选地，至少80vol.％，更优选至少90vol.％，最优选至少95vol.％的水(相对液体总体积而言)。
在根据本发明的方法中，DHa可以是酰胺，例如D-二氢苯基甘氨酸(DH)的一级、二级或三级酰胺，或D-二氢苯基甘氨酸(DH)的酯。优选地，DHa是DH的酯，例如DH的低级烷基(1-4C)酯。优选的是D-二氢苯基甘氨酸甲酯(DHMe)，最优选的是以盐的形式存在的DHMe，例如，DHMe的蚁酸盐或HCl盐。其它DH酯的蚁酸盐或HCl盐也是可以使用的。
可以用任何合适的方法将反应混合物中DH的浓度在整个反应期间保持为小于2wt.％，优选小于1.5wt.％，更优选小于1.0wt.％，更优选小于0.8wt.％。优选的条件见下文所述。
DHa对7-ADCA的摩尔比(即用加入到反应混合物中的DHa的总量去除以加入到反应混合物中的7-ADCA的总量(两者均以摩尔计))可在很宽的范围内变动。优选地，该摩尔比小于2.5，优选在0.5至2.0之间，更优选在0.7至1.8之间。
施加于反应混合物中的7-ADCA和活化形式的DH(DHa)的浓度可在很宽的范围内变动。加入到反应混合物中的7-ADCA和加入到反应混合物中的DHa的摩尔总量可在每升反应混合物10至2000毫摩尔之间，优选在每升反应混合物50至1500毫摩尔之间。
在本发明的一种优选的实施方式中，使得7-ADCA与DHa反应得到至少70％的DHa到头孢拉定的转化率，优选为至少80％，更优选为至少90％，其中DHa到头孢拉定的转化率＝(nCEF/nDHa)×100％，其中，
nCEF＝所形成的头孢拉定的总量(以摩尔计)，以及，
nDHa＝加入到反应混合物中的DHa的总量(以摩尔计)。
可用很多方式来加入反应混合物中的DHa。所有的DHa可在最初，即在反应开始时例如一批加入。也可以在反应过程期间向反应混合物中加入至少部分的DHa。
例如，可以通过控制反应混合物的pH和/或温度，将反应混合物中DH的浓度在整个反应期间保持为小于2wt.％，优选小于1.5wt.％，更优选小于1wt.％，更优选小于0.8wt.％。
应用的pH和温度可在很宽的范围内变动。用以形成头孢拉定的反应例如可在-5至35℃之间的温度下进行，优选在0至30℃之间的温度下进行。更优选地，该反应在5至25℃之间的温度下进行。
用于形成头孢拉定的反应例如可在6至9之间的pH下进行。优选地，该反应在6.3至8.5之间的pH下进行。
可用多种方法将反应混合物的pH调节为想要的pH值，例如通过加入酸例如无机酸，特别是硫酸、盐酸或硝酸来进行化学调节。还可以通过加入例如氢氧化钠或氨水的碱来将pH调节为希望的pH值。
通过在经过稀释的反应物7-ADCA和DHa浓度下进行反应，或使用具有经过改善的性质(例如改善的S/H比)的酶，可将反应混合物中DH的浓度在整个反应期间保持为小于2wt.％，优选小于1.5wt.％，更优选小于1wt.％，更优选小于0.8wt.％，所述的酶可以是野生型或经突变的酶。根据本发明保持DH的低浓度允许增大转化率。然后，例如可通过应用足够长的保持时间来达到此目的。
下述任何酶都可使用，所述的酶适于在根据本发明的方法中，作为催化剂使得7-ADCA与活化形式的DH反应，以制备头孢拉定。此类酶例如是一般术语“青霉素酰基转移酶”下已知的酶，或例如已知的青霉素G酰基转移酶，其也被称为青霉素G酰胺酶或苯甲基青霉素酰基转移酶(EC3.5.1.11)。青霉素G酰基转移酶指来自微生物(尤其是细菌)的一组能对青霉素的6-酰基或头孢菌素的7-酰基进行水解的水解酶。可基于其底物特异性或基于其分子结构，对青霉素酰基转移酶进行分类，这在很多种文献中有描述，例如见WO 03/055998和WO 98/20120。
可从中获得青霉素酰基转移酶的微生物是，例如，Acetobacter(特别是Acetobacter pasteurianum)、Aeromonas、Alcaligenes(特别是Alcaligenes faecalis)、Aphanocladium、Bacillus sp.(特别是Bacillusmegaterium)、Cephalosporium、Escherichia(特别是Escherichia coli)、Flavobacterium、Fusarium(特别是Fusarium oxysporum和Fusariumsolani)、Kluyvera、Mycoplana、Protaminobacter、Proteus(特别是Proteus rettgari)、Pseudomonas和Xanthomonas(特别是Xanthomonascitrii)。
在本发明的一种实施方式中，酶可被固定于载体上。以固定形式存在的酶可被容易地分离和重复利用。被固定的酶本身是已知的，并可通过商业途径获得，例如，按照WO 92/12782所述进行分离、按照EP 222 462和WO97/04086所述进行固定的E.coli青霉素酰基转移酶。
例如取决于所用的酶，根据本发明的制备头孢拉定的方法可在任何合适的pH和温度下进行。例如，包括用7-ADCA与DHa反应以形成头孢拉定的方法可在野生型青霉素酰基转移酶存在的情况下以及低于15℃的温度下进行。优选地，包括在野生型青霉素酰基转移酶存在的情况下用7-ADCA与DHa反应以形成头孢拉定的方法在低于15℃的温度和至少为7.0的pH下进行。
申请人发现，如果反应在相对高的温度下(例如，高于15℃，优选在15至30℃之间)和相对低的pH下(例如，低于7.7，优选在6至7.5之间)进行，相对野生型的E.coli酰基转移酶具有增大的S/H比的酶可获得增大的转化率。因此，本发明还涉及一种方法，其包括：在温度为至少15℃，优选在15至30℃之间，存在有比野生型的E.coli酰基转移酶具有更高的S/H比(优选为更高S/Hini比)的酶作为酰基转移酶的情况下，使7-ADCA与DHa反应，以形成头孢拉定。优选地，在存在有比野生型的E.coli酰基转移酶具有更高的S/H比的酶作为酰基转移酶的情况下，使7-ADCA与DHa反应以形成头孢拉定的方法在至少15℃(优选在15至30℃之间)的温度下和低于7.7(优选在6至7.5之间)的pH下进行。
这是令人吃惊的，因为在具有相对低的S/H比的酶的情况下，过去发现在相对低的温度和相对高的pH下获得最高的转化率。当具有增加的S/H比的酰基转移酶具有比野生型的E.coli酰基转移酶更低的酶活性时，上述效应尤其明显。
比野生型的E.coli酰基转移酶具有更高S/H比的酰基转移酶可以是任何酶。该酶可以例如是经突变的青霉素酰基转移酶。可从任何已知的青霉素酰基转移酶开始，来制备青霉素酰基转移酶的突变体或酰基转移酶突变体。经过突变的酰基转移酶例如是通过本领域已知的重组DNA方法，通过用新的残基去取代一个氨基酸残基，从野生型酰基转移酶获得的。
在本发明的一种优选的实施方式中，该酶是具有氨基酸取代的经突变的青霉素酰基转移酶，所述取代处于相应于E.coli的青霉素酰基转移酶β-亚基的β-亚基第24位。在一种优选的实施方式中，相应于E.coli的青霉素酰基转移酶β-亚基的β-亚基第24位的L-苯丙氨酸已在该位置被L-丙氨酸取代，如WO 98/20210所述。该突变可被应用于来自E.coli的Pen G酰基转移酶，但是也可对来自其它来源的Pen G酰基转移酶使用。对氨基酸位置的编号对应于野生型的E.coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸序列的编号。
如本文中所定义的，合成/水解(S/H)比应被理解为：在酶反应期间的特定时刻，合成产物与水解产物的摩尔比。合成产物应被理解为是由活性侧链和β-内酰胺核心形成的β-内酰胺抗生素。水解产物应被理解为活性侧链的相应的酸。
S/H比是反应物浓度、活性侧链与β-内酰胺核心的摩尔比、温度、pH和酶的函数。在理想状况中，在同样的条件下进行比较实验，其中，对特定的待测酶相对对照酶(优选是E.coli PenG酰基转移酶)进行测试。
在酶酰基化反应期间，S/H比通常会降低。优选地，在相等的转化率下，对不同的青霉素酰基转移酶的S/H比进行比较。最为常见地，对0％的转化率(因此时间t＝0)处的所谓初始S/H比(S/Hini)进行比较，其因此是对S/H比的量度。可通过下述方法来测定具有足够精确的S/Hini：进行酰基化反应，直至达到足够高的转化率，使得可对产物(尤其是水解产物)进行精确的测量，然后绘出S/Hini对转化率的图，将其外推至转化率为0％处。通过外推来测定初始S/H比可能是必要的，因为在低转化率下形成的水解产物对于S/Hint的精确测定来说太少了。可用本领域内已知的曲线拟合算法来获得更为可靠的外推。为进行精确测定，必须要有足够的数据点。足够的数据点意味着至少三个数据点，其应当表示出至少0.5％的转化率差异。
酶活性通常可被定义为：在酶酰基化反应中的特定时刻，每单位时间，对每单位量的已溶解或被固定的酶而言，被转化或合成的反应物或产物的摩尔量。优选地，应用固定形式的酶，按照每单位量的被固定的酶来定义酶活性。每单位数量的酶的酶活性通常也被称为特定酶的比活性。
可用多种方法来进行根据本发明的方法，例如采用分批培养或连续培养。优选地，根据本发明的方法以分批过程来进行。分批培养可以是分批培养、补料分批培养、分批和补料分批模式的组合、重复补料分批模式或任何其它组合。
通过根据本发明的方法形成的头孢拉定可以以任何方式结晶。
优选地，根据此后所述的优选实施方式，获得具有增大的稳定性的头孢拉定水合物。
优选地，根据本发明的方法包括从水溶液结晶头孢拉定。所述水溶液可含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选地，有机溶剂或有机溶剂的混合物的含量小于30vol.％，更优选地，小于20vol.％，更优选地，小于10vol.％，更优选地，小于5vol.％(相对液体总体积而言)。优选地，有机溶剂是具有1-7个碳原子的醇，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二醇，特别是乙二醇；或三醇，特别是甘油。优选地，水溶液含有至少70vol.％的水，更优选地，至少80vol.％，更优选至少90vol.％，最优选至少95vol.％的水(相对液体总体积而言)。
水溶液可以含有7-ADCA和/或DH。
头孢拉定可以任何形式被结晶出来，典型地，以头孢拉定水合物的形式。本发明不限于特定的头孢拉定水合物。典型地，所述头孢拉定水合物是头孢拉定一水合物。头孢拉定水合物的水含量例如在按重量计3％至6％的范围内。
优选地，从下述水溶液中结晶出头孢拉定，在所述水溶液中，mCEF/(m7-ADCA+mCEF)之比>0.7，优选>0.8，更优选>0.9，并且，其中，XDH在0至2wt.％之间，优选在0至1wt.％之间，其中，
mCEF＝水溶液中头孢拉定的摩尔量；
m7-ADCA＝水溶液中7-ADCA的摩尔量；并且
XDH＝水溶液中DH相对水溶液总重的浓度。水溶液总重包括水溶液中存在的液相的重量和任何固体组分例如头孢拉定水合物的重量。
已经发现，可通过根据本发明的方法来高效获得优选的水溶液，从而获得增加的转化率和低的DH浓度。
已经发现，从优选的水溶液中结晶出头孢拉定使得结晶的头孢拉定具有提高的质量。
因此，本发明还涉及一种方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定；并且，从水溶液中结晶出头孢拉定，在所述水溶液中，mCEF/(m7-ADCA+mCEF)之比>0.7，优选>0.8，更优选>0.9，并且，其中，XDH在0至2wt.％之间，优选在0至1wt.％之间。
优选地，水溶液中7-ADCA的浓度在水溶液总重的0至5wt.％之间，优选在0至2wt.％之间。已经发现，这使得结晶出的头孢拉定的质量被进一步提高。
可通过任何合适的方法来制备包含头孢拉定的水溶液。
优选地，根据本发明的制备头孢拉定的方法包括：在所述结晶之前，将酶与头孢拉定分离。例如通过将反应混合物过筛，可以例如从包含头孢拉定的反应混合物中分离出酶，以使酶与头孢拉定分离。在反应混合物中，部分头孢拉定可能以头孢拉定水合物的形式存在，且该方法可能包括将头孢拉定水合物溶解，以及从得到的溶液中分离出酶。可以根据任何合适的方法，例如过滤或离心，将酶从包含溶解的头孢拉定的水溶液中分离。
在根据本发明的方法的一种实施方式中，所形成的部分头孢拉定在反应混合物中作为头孢拉定水合物存在，且该方法进一步包括将至少部分所述头孢拉定水合物溶解。
可以任何合适的方法来溶解头孢拉定水合物。对头孢拉定水合物的溶解可以例如在pH等于或大于8下进行，更优选地，在8.3至9.5之间的pH下进行，最优选地，在8.5至9之间的pH下进行。在一种优选的实施方式中，头孢拉定水合物的溶解例如是通过对反应混合物的pH进行调节来实现的，特别是将反应混合物的pH增加至大于等于8的值，优选地，8.3至9.5之间的pH，最优选地，8.5至9之间的pH。可以通过加入合适的碱，例如氢氧化钠或氨水，使反应混合物的pH增加至目标pH值。所述溶解可以分批或连续进行。还可以从反应混合物中分离出头孢拉定水合物，并将分离出的头孢拉定水合物溶解以形成水溶液。
从包含头孢拉定的水溶液中结晶出头孢拉定的操作可在任何合适的温度下进行。我们惊奇地发现，当在增大的温度下进行结晶时，会获得经提高的产物质量。在这些温度下结晶出的头孢拉定可以是已经通过化学方法或酶方法制备出的。
因此，本发明还涉及制备头孢拉定晶体的方法，其特征在于，所述方法包括从水溶液中结晶出头孢拉定，以形成头孢拉定晶体，其中所述结晶在45至65℃之间的温度下进行，优选在45至60℃之间，优选在48至55℃之间进行。最优选地，结晶在49至52℃之间的温度下进行。通过在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-ADCA与DHa反应以形成头孢拉定的酶方法所制备的头孢拉定，优选地，通过根据本发明的方法制备的头孢拉定可有利地在上文公开的温度下被结晶出来。但是，用于结晶的温度不限于通过酶方法制备出的头孢拉定的结晶，其可以例如有利地用于通过化学方法(例如，在不存在酶的情况下)制备出的头孢拉定的结晶。
通过在反应混合物中，存在酶的情况下使7-ADCA与DHa反应以形成头孢拉定的酶方法所制备的头孢拉定，优选地，通过根据本发明的方法制备的头孢拉定，也可在35至60℃之间的温度下结晶，例如，在35至55℃之间的温度下，例如在35至45℃之间的温度下。
从包含头孢拉定的水溶液中结晶出头孢拉定的操作可在任何合适的pH下进行。优选地，结晶出头孢拉定的操作可在4.0至6.0之间的pH下进行，优选在4.5至5.5之间的pH下，更优选地，在4.7至5之间的pH下进行。我们惊奇地发现，在进行结晶的优选pH范围内头孢拉定晶体的产率会增大。在本发明的方案内，可用多种方法对水溶液的pH进行调节，例如通过化学方法，加入酸，例如无机酸，特别是硫酸、盐酸或硝酸。优选地，所述结晶是连续进行的。
我们惊奇地发现，应用优选条件得到展示出增大的稳定性的头孢拉定水合物，增大的稳定性是通过在稳定性测试中450nm波长处的吸光度降低来测得的。
根据本发明的方法还包括：在使得制备出的头孢拉定水合物在450nm处的吸光度小于0.050，优选小于0.040，最优选小于0.030，通常大于0.005的pH和温度下来进行所述的结晶。
在根据本发明的方法的一种实施方式中，酶反应在存在亚硫酸氢钠的情况下进行。优选地，酶反应中存在的亚硫酸氢钠在1至25mM之间，优选在5至15mM之间。令人惊奇地，酶反应期间亚硫酸氢钠的存在会进一步减少制备出的头孢拉定的颜色。
亚硫酸氢钠还可存在于根据本发明的方法对头孢拉定进行的结晶期间。优选地，在对头孢拉定进行结晶以形成头孢拉定一水合物的期间，存在的亚硫酸氢钠的量在5至250mM之间，更优选在25至150mM之间。
可用任何合适的方法，从水溶液中分离出头孢拉定水合物，并对其进行干燥。
在另一个方面，本发明涉及可通过本文所述的方法获得的头孢拉定水合物。令人惊奇地，可通过根据本发明的方法获得的头孢拉定水合物的颜色很低，这是指450nm处的吸光度小于0.050，优选地，450nm处的吸光度在0.005至0.050之间，更优选地，在0.008至0.040之间，最优选地，在0.010至0.030之间。我们还发现，可通过根据本发明的方法获得的头孢拉定水合物具有高的颜色稳定性。高的颜色稳定性指，在胁迫(stress)稳定性试验中仅产生较少的颜色，即，头孢拉定水合物的颜色为在40℃、相对湿度75％下贮藏8周后，450nm处的吸光度小于0.20、更优选地，小于0.15，最优选地，小于0.10。
在另一种实施方式中，本发明包括在450nm处吸光度小于0.2，优选小于0.15，更优选小于0.1，更优选小于0.05的头孢拉定水合物。优选地，头孢拉定水合物具有0.001至0.2之间，优选为0.002至0.15之间，更优选为0.004至0.1之间，更优选为0.005至0.05之间，更优选为0.010至0.040之间的吸光度。根据本发明的头孢拉定水合物，在胁迫稳定性试验中具有高的颜色稳定性，即，在40℃、相对湿度75％下贮藏8周后，头孢拉定水合物的颜色为450nm处的吸光度小于0.20、更优选地小于0.15，最优选地小于0.10。
优选地，根据本发明的方法制备的头孢拉定水合物不含，或基本上不含二甲基甲酰胺。
下述实施例用于说明本发明，而非对本发明加以限制。
实施例
缩写
7-ADCA：7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸
CEF：头孢拉定
DH：D-二氢苯基甘氨酸
DHa：活化形式的D-二氢苯基甘氨酸
DHMe：D-二氢苯基甘氨酸甲酯
a)酶和固定
本文中使用的青霉素酰基转移酶是野生型Pen-G酰基转移酶和Pen-G酰基转移酶突变体Phe-24-Ala，如WO 98/20120所述。按照EP 222 462和WO-A-97/04086所述，用作为胶凝剂使用的明胶和壳聚糖以及作为交联剂使用的戊二醛来对酶进行固定。
b)头孢拉定的合成
对照实验A
在T＝20℃和pH＝6.9下，用Assemblase
TM
(被固定的野生型Pen-G酰基
转移酶)来合成头孢拉定
向酶反应器中装入10g净重的被固定的野生型Pen-G酰基转移酶(酶的装载量为20mg/g生物催化剂净重)，所述酶反应器具有175μm的纱布筛网底部。向制备反应器中装入40ml水(20℃)、0.03g亚硫酸氢钠、9.15g7-ADCA和9.07g DHMe。用25％的NH4OH溶液令pH增至6.9。随后，在5.0ml水(T＝20℃)的协助下，在t＝0时，将悬浮液转移至酶反应器。温度被保持为T＝20℃。用25％的NH4OH溶液将pH保持为6.90。
300分钟后，[DH]＝2.97质量(mass)％，转化率(nCEF/n7-ADCA)×100％＝68％，转化率(nCEF/nDHa)×100％＝68％，S/H＝1.8。
由于DH结晶，反应混合物变得高度粘滞。
实施例1
在T＝10℃和DH＝7.2→7.5下，用Assemblase
TM
(被固定的野生型Pen-
G酰基转移酶)来合成头孢拉定
向酶反应器中装入92g净重的被固定的野生型Pen-G酰基转移酶(酶的装载量为20mg/g生物催化剂净重)，所述酶反应器具有175μm的纱布筛网底部。向制备反应器中装入190ml水(10℃)、1.6g亚硫酸氢钠、36.6g7-ADCA(169.8mmol)和35.0g DHMe(171.2mmol)。用25％的NH4OH溶液令pH增至7.2。随后，在10.0ml水(T＝10℃)的协助下，在t＝0时，将悬浮液转移至酶反应器。温度被保持为T＝10℃。在反应的第一部分期间，用25％的MH4OH溶液将pH保持为7.20。在第二部分，pH缓慢增加，t＝90分钟时，pH＝7.20；t＝130分钟时，pH＝7.50。
130分钟后，[DH]＝0.84质量(mass)％，转化率(nCEF/n7-ADCA)×100％＝74％，转化率(nCEF/nDHa)×100％＝73％，S/H＝5.5。初始酶活性被计算为～0.73μmol CEF/(min·mg酶)。
实施例2
在T＝7℃和DH＝8.0→8.2下，用被固定的Pen-G酰基转移酶突变体
Phe-24-Ala来合成头孢拉定
向酶反应器中装入60.5g净重的被固定的Pen-G酰基转移酶突变体Phe-24-Ala(酶的装载量为40mg/g生物催化剂净重)，所述酶反应器具有175μm的纱布筛网底部。向制备反应器中装入70ml水(7℃)、0.6g亚硫酸氢钠、15.3g7-ADCA(71.0mmol)和13.9g DHMe(67.7mmol)。用25％的NH4OH溶液令pH增至8.0。随后，在10.0ml水(T＝7℃)的协助下，在t＝0时，将悬浮液转移至酶反应器。温度被保持为T＝7℃。pH缓慢升至8.20，并用25％的H2SO4保持于该值。
344分钟后，[DH]＝0.27质量(mass)％，转化率(nCEF/n7-ADCA)×100％＝85％，转化率(nCEF/nDHa)×100％＝89％，S/H＝15.5。初始酶活性被计算为～0.08μmol CEF/(min·mg酶)。
实施例3
在T＝20℃和DH＝6.9下，用被固定的Pen-G酰基转移酶突变体F24A来
合成头孢拉定
向酶反应器中装入40g净重的被固定的Pen-G酰基转移酶突变体Phe-24-Ala(酶的装载量为40mg/g生物催化剂净重)，所述酶反应器具有175μm的纱布筛网底部。然后，加入110.0ml水(20℃)、0.3g亚硫酸氢钠、36.6g7-ADCA(169.8mmol)、1ml25％ NH4OH溶液和0.04gEDTA。在T＝20℃，对悬浮液进行5分钟的搅拌。pH为6.90。
在单独的容器中，在T＝20℃的67.2ml水中溶解37.8g二氢苯基甘氨酸甲酯·HCl盐(DHME；174.7mmol)。在t＝0至t＝60分钟，以恒定加料速率，将该溶液加料到酶反应器中。温度被保持为T＝20℃。用25％的NH4OH溶液将pH保持为6.90。在反应的第二部分，pH缓慢增加，t＝0-240分钟时，pH＝6.90；t＝270分钟时，pH＝7.00；t＝350分钟时，pH＝7.10。
350分钟后，[DH]＝0.56质量(mass)％，转化率(nCEF/n7-ADCA)×100％＝98.4％，转化率(nCEF/nDHa)×100％＝95.6％，S/H＝13.8。t＝0至150分钟的平均酶活性被计算为～0.50μmol CEF/(min·mg酶)。
上述实验显示，当反应混合物中DH浓度小于2wt.％时，可获得高于70％的7-ADCA到头孢拉定的转化率以及高于70％的DHME到头孢拉定的转化率。
表1.在不同反应条件下比较野生型PenG酰基转移酶和经突变的PenG酰基转移酶Phe-24-Ala。
| 反应条件 | 野生型PenG酰基转移酶 | 经突变的PenG酰基转移酶Phe-24-Ala |
| 野生型/突变体 | 实施例1 | 实施例2 |
| T＝10/7℃pH＝7.2-7.8/8.0-8.2 | 7-ADCA转化率74％DHMe转化率73％S/H：5.5[DH]＝0.84％ | 7-ADCA转化率85％DHMe转化率89％S/H：15.5[DH]＝0.27％ |
| 对照实验A | 实施例3 | |
| T＝20℃pH＝6.9 | 7-ADCA转化率68％DHMe转化率68％S/H：1.8[DH]＝2.97％ | 7-ADCA转化率98.4％DHMe转化率95.6％S/H：13.8[DH]＝0.56％ |
7-ADCA转化率：(nCEF/n7-ADCA)×100％
DHMe转化率：(nCEF/nDHa)×100％
c)头孢拉定的结晶和分离
将如上所述获得的反应混合物用于结晶和分离过程。在t＝350分钟(从头孢拉定合成的起点开始，见上文)，将包含头孢拉定的混合物冷却至3℃，加入4.7ml水中的1.8g亚硫酸氢钠的悬浮液。然后，用25％的NH4OH溶液将pH增至8.6。
在t＝360分钟时，通过筛网底部将酶反应器排空。用2×30ml水(2℃)对筛网上的(被固定的)酶的湿滤饼进行洗涤。将滤液和洗出液合并，并过滤(连续通过孔径40μm、10μm和3μm的过滤器)。
向结晶反应器中装入3.0g头孢拉定和50ml水，加热至T＝52℃。之后立即将合并的滤液和洗出液以恒定加料速率在60分钟内加入。温度被保持为T＝52℃，并通过滴加25％的硫酸将pH保持为4.80。然后，30分钟内将温度降为25℃。将得到的悬浮液通过玻璃过滤器，对其进行过滤。用30ml的水和2×25ml80％丙酮(丙酮/水＝80/20v/v)对湿滤饼进行洗涤，并进行干燥。获得了47.0g水含量为3.4％的头孢拉定水合物。
对照实验B.头孢拉定的化学合成
1)制备混合酸酐
将二氯甲烷(980ml)中的N-甲基乙酰胺(21.7克；0.30摩尔)、D(-)-α-2，5-二氢苯基甘氨酸甲基邓钠盐(269.9克；0.987摩尔)、gamma-甲基吡啶(0.055ml；0.6毫摩尔)悬浮液冷却至-20℃，在-10℃用新戊酰氯(119.7克；0.991摩尔)进行10分钟的处理，然后冷却至-35℃。该体系被称为制剂A。
2)7-ADCA溶液
将二氯甲烷(697ml)冷却至5℃，加入7-ADCA(175克；0.817摩尔)。然后在搅拌下加入二氮杂双环(5，4，0)-7-十一碳烯(140克；0.920摩尔)，获得完全溶液。该体系被称为制剂B。
3)偶合(coupling)(酰基化)
将制剂B加入到制剂A中，温度保持于-35℃。对得到的反应混合物C进行3小时的搅拌。
4)水解
将水(980ml)和35％盐酸(210g；2.0摩尔)加入到反应混合物C中，温度被升至15℃。pH在1.5至2.0的范围内。然后，搅拌15分钟后，分离各层。
5)真空蒸馏
将步骤4中获得的水性(上)层立即加热至38℃，同时在真空条件下(初始压力为大约360mmHg；最终压力为150mmHg)蒸馏，以去除残余的二氯甲烷。当GC(气相色谱)显示出二氯甲烷含量为0.7％w/w时，停止真空蒸馏。获得稳定的(相对头孢拉定盐酸盐的未受控制结晶而言)、清澈的含有头孢拉定的溶液。
6)分离
将获得的溶液加热至大约55℃，通过加入三乙胺至pH＝5，使头孢拉定结晶出来。过滤后，获得了220g(0.60摩尔；73％产率)的头孢拉定(基于干重，测得为99％)。由此获得的头孢拉定的纯度符合ChinesePharmacopeia的规定。
d)头孢拉定的颜色
通过在450nm处的吸光度来测定头孢拉定水合物的颜色。对按照上文制备的头孢拉定水合物的吸光度和胁迫稳定性都进行了测定。
1.吸光度
将1g头孢拉定水合物溶于10ml10％碳酸钠水溶液中。在PerkinElmer 550S分光光度计上，在室温下测定450nm处的吸光度(＝A450)，其中用10％碳酸钠水溶液作为参比溶液。
2.胁迫稳定性试验1
将按照实施例3通过酶制备的头孢拉定水合物和按照对照实验B通过化学方法制备的头孢拉定水合物保持于40℃，相对湿度75％下。在0、2、4、6、8、10和12周后，按照上文所述对450nm处的吸光度进行测量。
表2.通过酶和化学方法制备的头孢拉定的颜色稳定性，A450，它们是在pH4.8-5.0时，52℃和55℃下结晶出来的。
| 通过酶制备的头孢拉定 | 通过化学方法制备的头孢拉定 | |
| 周 | 结晶温度T＝52℃ | 结晶温度T＝55℃ |
| 0246 | 0.0250.0430.058 | 0.0280.0650.0770.161 |
| 81012 | 0.0960.148 | 0.1420.211 |
表2中的结果清楚地显示，通过化学方法制备的头孢拉定的颜色不如通过酶制备的头孢拉定稳定。
3.胁迫稳定性试验2
将按照实施例3通过酶制备的、在不同温度下结晶出的(如表3所示)头孢拉定水合物在100℃下保持3小时。然后按照上文所述，对经过这样处理的头孢拉定晶体的A450进行测定。
表3中的结果清楚地显示，结晶温度会影响到头孢拉定晶体的颜色稳定性，在实验5中获得了优异的值。
表3.通过酶制备的、在不同温度下结晶出的头孢拉定水合物晶体的稳定性。结晶期间的pH被保持为4.80。
| 实验编号 | 结晶温度(℃) | t＝0时的A<sub>450</sub> | 胁迫稳定性试验后的A<sub>450</sub>(3小时，100℃) |
| 4 | 65 | 0.051 | 0.301 |
| 5 | 50 | 0.018 | 0.056 |
| 6 | 30 | 0.021 | 0.291 |
| 7 | 20 | 0.017 | 0.330 |
Claims (24)
1.制备头孢拉定的方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在青霉素酰基转移酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定，使得7-ADCA到头孢拉定的转化率为至少70％，其中，所述反应混合物中D-二氢苯基甘氨酸(DH)的浓度小于2wt.％。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的反应使得7-ADCA到头孢拉定的转化率为至少80％。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述反应使得活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)到头孢拉定(CEF)的转化率为至少70％，其中
DHa到CEF的转化率＝(nCEF/nDHa)×100％；
nCEF＝以摩尔计的所形成的头孢拉定的量；以及，
nDHa＝以摩尔计的加入到反应混合物中的DHa的总量。
4.如权利要求1所述的方法，其中，通过控制所述反应混合物的pH和/或温度，在整个反应期间将所述反应混合物中的DH浓度保持为小于2wt.％。
5.如权利要求1所述的方法，其中，加入到所述反应混合物中的7-ADCA和加入到所述反应混合物中的DHa的总量在每升反应混合物10至2000毫摩尔之间。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活化形式的D-二氢苯基甘氨酸是D-二氢苯基甘氨酸甲酯。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活化形式的D-二氢苯基甘氨酸是D-二氢苯基甘氨酸甲酯的HCl盐。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应在-5至35℃之间的温度下进行。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应在6至9之间的pH下进行。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的青霉素酰基转移酶被固定于载体上。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法是分批方法。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的青霉素酰基转移酶是比野生型E.coli青霉素酰基转移酶具有更高S/H比的青霉素酰基转移酶，并且其中，所述反应在至少15℃的温度和低于7.7的pH下进行。
13.如权利要求1所述的制备头孢拉定的方法，所述方法包括：在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-ADCA与DHa反应，形成头孢拉定，其中，所述的酶是野生型青霉素酰基转移酶，并且其中，所述的反应在低于15℃和至少为7.0的pH的温度下进行。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的青霉素酰基转移酶是经突变的青霉素酰基转移酶。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括从水溶液中结晶出头孢拉定。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法包括：
在反应混合物中，存在酶的情况下，使7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)与活化形式的D-二氢苯基甘氨酸(DHa)反应，形成头孢拉定；以及
从水溶液中结晶出头孢拉定，在所述水溶液中，mCEF/(m7-ADCA+mCEF)之比>0.7，并且其中，XDH在0至2wt.％之间，其中，
mCEF＝所述水溶液中头孢拉定的摩尔量；
m7-ADCA＝所述水溶液中7-ADCA的摩尔量；并且
XDH＝所述水溶液中DH相对所述水溶液总重的浓度。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述方法包括：在所述结晶之前，将所述的酶与头孢拉定分离。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液中7-ADCA的浓度在0至5wt.％之间。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述结晶在45至60℃之间的温度下。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述结晶在4.0至6.0之间的pH下。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所形成的头孢拉定中的部分在所述反应混合物中作为头孢拉定水合物存在，并且其中，所述方法包括将所述头孢拉定水合物的至少部分溶解。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述溶解在大于8的pH下进行。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述结晶在使得制备出的所述头孢拉定水合物在450nm处的吸光度小于0.050的pH和温度下进行。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应在存在亚硫酸氢钠的条件下进行。
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