CN86108306A

CN86108306A - 新的固相生物催化剂及其制备和应用

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Publication number: CN86108306A
Application number: CN86108306.7A
Authority: CN
Inventors: 哈尔德·阿布拉哈姆; 迪·哈恩·本·鲁多尔夫; 万·迪尔·普拉特·约翰尼斯·伯图斯
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-11-15
Filing date: 1986-11-15
Publication date: 1987-10-28
Anticipated expiration: 2001-11-15
Also published as: ATE86299T1; FI873084A; EP0222462A1; IE59798B1; KR880700854A; WO1987003005A1; KR950012803B1; DE3687882T2; JPS63501334A; IE863027L; US5137818A; CN1029987C; ES2054614T3; PT83746A; FI95044C; EP0222462B1; DK366087A; GR3007372T3; DK366087D0; CA1337282C

Abstract

颗粒形的固定化水不溶生物催化剂含有活细胞，特别是酵母，分散在交联的明胶剂中。颗粒中可以共同定有酶，特别是淀粉葡萄糖苷酶。这种颗粒的制备是将活细胞悬浮于明胶水溶液中，将该悬液光散到不能与水混溶的有机液中以在水液中形成悬浮颗粒，该颗粒含活细胞和明胶剂。发现当活细胞如细菌细胞特别是酵母细胞以这种方式固定后，令人惊奇的是不仅保留了它们的存活力，而且酵母细胞在连续发酵条件下生产乙醇的能力也得到极大的改善。也描述了适于固定化的特异性酿酒酵母。

Description

本发明是关于含有活细胞的颗粒形式的新的水不溶性固相生物催化剂及其制备和应用。

在美国专利3，838，007号中揭示了一种制备半固体或固体颗粒形式的水不溶性酶组合物的方法，即将非蛋白水解酶悬浮在胶凝蛋白水溶液中，将得到的混合物与一种微混溶于水或不混溶于水的有机液体合并制成一种颗粒形式的悬浮液，处理该悬浮液实现胶凝蛋白的凝胶化并使生成的胶化蛋白颗粒与交联剂接触。胶凝蛋白最好是明胶，它对使酶成为具有所需大小的水不溶性的颗粒形式是必不可少的并且它也可使酶稳定。尤其揭示了产生颗粒形式的酶-胶凝蛋白是具有四个或更多的碳原子的脂族醇，例如丁醇，醇酯和低级脂肪酸酯，如乙酸乙酯，乙酸丁酯和丙酸乙酯。最后，提到几种非蛋白水解酶，它们可成为不溶性的颗粒形式。上述颗粒形式的组合物可用于酶促反应的柱和床反应器并且特别有助于那些不允许最终产物含有所用酶的反应。

本领域技术人员会意识到活细胞，例如面包酵母（酿酒酵母）的细胞可迅速地被在美国专利3，838，007号所揭示的方法中所用类型的有机溶剂杀死。据报道几种有机溶剂可引起酵母的自溶。例如，用乙酸乙酯处理面包酵母制备结晶细胞色素C（见Nature 178（1956），629-630）和β-呋喃果糖苷酶（见J.Bacteriol，112（1972），1346-1352）。

Hough和Lyons在Nature 235（1972）389中特别提到共价连接酶的固相法对活的有机体来说是相当猛烈的，因此他们认为如果用这些活的有机体作为载体的话是极不可能存活的。然后他们揭示了一种用钛盐和其它无机盐作为偶联剂将某些酶与活的载体，即几株酿酒酵母共价偶联起来的技术。该偶联技术是Barker等人最初在Process Biochem.6，（1971），11中所揭示的技术的改进。

在德国公开专利2805607，第9页，第13～17行，提及了Processes Biochem.No.7（1972），9-12，其中建议用甲苯或二氯甲烷作为溶剂使微生物附着在三乙酸纤维素丝状体上。上述德国公开专利中特别提到这些溶剂是很有毒的，因此通过在载体间质内培养而使微生物再生几乎是不可能的。

最近，Haegerdal和Mosbach在Food Process Eng.，Proc.Int.Congr.，Znd 1979（1980年出版）Z，129-32，（参见Chemical Abstracts 94（1981）119457K）中描述了面包酵母与β-葡萄糖苷酶的共固定化物，为了由纤维素二糖生产乙醇在一个小的反应柱中研究了这种共固定化物。将酶共价结合到藻酸盐上，然后将面包酵母与该制剂一起共附着在藻酸盐凝胶上，但有机溶剂和交联剂都不能用于这些活细胞。

藻酸钙的缺点是在磷酸盐离子或其它螯合剂存在时不稳定。在活细胞中，磷酸盐是必需营养物，因此这种藻酸盐载体不能适用于大多数含有活细胞的固相系统。

欧洲专利申请EP-A-O 041610揭示了酵母与酶的共固定化物，其中将酶偶联到具有发酵能力的活酵母细胞上以便直接圈住它们。这些共固定化物的制备方法是使酵母细胞脱水，用酶的水溶液复水，加入一种不影响酵母细胞发酵的酶沉淀剂并且最好随后加入交联剂。在制备这些共固定化物时有机溶剂和分散剂都不能使用。共固定化物不适用于反应柱等，因为它们缺乏载体间质。

所有这些参考文献都谈到在制备保持其发酵和增殖能力的固相活细胞组合物的过程中不用有机溶剂，特别是甲苯、丁醇、乙酸丁酯和乙酸乙酯一类的溶剂。

本发明的一个目的是提供含有活细胞的具有所需大小的颗粒形式的水不溶性固相生物催化剂，它们可用于各种各样的目的，例如用于柱填充物，流化床反应器和搅拌釜反应器。

本发明的另一个目的是提供一种在相当温和的条件下制备上述水不溶性固相颗粒的方法，（即颗粒内部的情况与使悬浮体成形的周围有机溶液相反），以便大量活细胞在固定化期间或之后可以生存或增殖。

从下面详尽的描述中可显见本发明的这些目的和其它目的以及优点。

在广泛的研究和实验之后，出人意料地发现了活细胞并且特别是活的微生物细胞的存活力，例如当使活细胞与微混溶于水或不混溶于水的有机溶剂接触时如果将活细胞悬浮在胶凝剂水溶液中，酵母就不会受到不利的影响。

因此，本发明提供一种含有分散在交联用的胶凝剂中的活细胞的颗粒形式的水不溶性固相生物催化剂。

在本说明书中所用的“活细胞”一词可理解为能够执行广泛的代谢（或合成）反应的细胞，这些反应仅在上述细胞保持其结构实体时才是可能的。这种反应的例子是能量（ATP）的产生，细胞成分的再循环，和细胞增殖。

在本说明书中所用的“颗粒形式”一词应在广义上解释。颗粒形式可为球形或近球形的颗粒形式，但，虽然说明书一般涉及那些球形或近球形的颗粒，颗粒形式也可以是纤维的形式，例如挤压纤维，铸型薄膜，容器涂面和浸渍薄棉纸或纸。总之，“颗粒形式”是指一种按照本发明规定的所需大小的组合物的形式。

本文所用的“胶凝剂”一词是指通过特殊处理可将水溶液转变成固体或半固体状态的试剂，例如当使用明胶或琼脂时通过冷却实现这种转变。例如，适于本发明目的的胶凝剂是明胶;胶凝多糖的混合物，如琼脂;能与合适的双官能或多官能交联剂交联的含有游离氨基的聚合物，如壳聚糖;和明胶混合物以及类似化合物。明胶及明胶和壳聚糖的混合物是最好的胶凝剂。

适用本发明目的的交联剂的例子是戊二醛和单宁酸，最好的是戊二醛。

根据本发明适合于水不溶性固相生物催化剂的活细胞是微生物细胞和动物及高等植物的细胞。在合适的活微生物细胞中，最好的是酵母和细菌，例如酿酒酵母（如面包酵母）和醋杆菌种（如巴氏醋杆菌），梭菌种和乳杆菌种（如Lactobacillus bavaricus）。例如，合适的活的植物细胞是属于Tagetes minuta种的细胞。

根据本发明的后续方面，水不溶性固相生物催化剂也可包含一种或多种酶，特别是非蛋白水解酶。当使酶在生物催化剂中混合时，它当然应该是与活细胞和胶凝剂相容的酶。在本发明生物催化剂中可能包括的酶的例子是淀粉葡萄糖苷酶，乳糖酶，麦芽糖酶、淀粉酶、葡萄糖异构酶，支链淀粉酶，蔗糖酶，脂肪酶，酯酶，葡萄糖氧化酶和脱氢酶。也可使用酶的混合物。

在某些条件下可使用蛋白水解酶，这些条件对本领域技术人员来说应该是清楚的。例如，当胶凝剂是明胶这样的蛋白时应避免使用蛋白水解酶，因为有蛋白水解活性的酶会使胶凝蛋白分解并且本身产生极不稳定的产物。

根据本发明的另一方面，水不溶性固相生物催化剂可包含两种或多种类型的活细胞，以及任意一种或多种酶。

根据本发明颗粒形式的水不溶性固相生物催化剂特别适用于柱反应器，例如进行连续催化反应的流化床反应器和搅拌釜反应器。相对地，这些生物催化剂可用于某些碳水化合物的转化，例如由液化淀粉产生的低聚糖转化为乙醇，乳糖（例如在乳清里）转化为乳酸或乙醇和纤维素二糖转化为乙酸，衣康酸或柠檬酸。根据本发明最好的水不溶性固相生物催化剂是含有酿酒酵母，以及任意一种或多种淀粉酶，特别是淀粉葡萄糖苷酶的生物催化剂。这种组合物特别有助于用液化淀粉，如糊精发酵生产乙醇和低热量啤酒的生产。

根据本发明的另一方面，上述水不溶性固相生物催化剂可用包括下列步骤的方法制成：

（a）将活细胞悬浮在胶凝剂水溶液

（b）将所得混合物与一种微混溶于水或不混溶于水的有机液体合并，含有活细胞和胶凝剂的含水颗粒在有机液体中形成悬浮液。

（c）处理该悬浮液使颗粒中的胶凝剂胶凝。

（d）用双官能或多官能的交联剂处理在步骤（c）中所得到的颗粒而使存在于颗粒中的聚合物交联，

（e）必要时，使在步骤（d）中所得到的颗粒干燥。

本发明所述的方法具有许多优点，这些优点使它在工业上使用有极大的吸引力。例如，该方法简单，因此可精确控制操作。得到的颗粒整齐而均一。由于在乙酸丁酯或甲苯中挤压成形，所以该固相法也是无菌的。最后，该方法是相当便宜的。

胶凝剂最好是明胶或主要由明胶和壳聚糖的混合物，它也可使混入生物催化剂中的酶稳定。

颗粒形式的活细胞，酶和胶凝剂的混合物最好通过下列方法形成，即将活细胞和任意酶悬浮在胶凝剂的水溶液中并将该混合物与一种微混溶于水或不混溶于水的有机液体合并以获得颗粒形式，通过实现胶凝剂的凝胶化来处理该颗粒形式的悬浮液，例如当明胶是胶凝剂时要冷却。含有活细胞，任意酶和胶凝剂的混合物与有机液体的合并可通过在控制搅拌下混合或通过活细胞，酶和胶凝蛋白的混合物于液内喷雾到有机液体中来实现。后一种程序可在一根垂直柱上进行，在垂直柱中形成的颗粒在含有交联剂的有机液体中向下移动。

活细胞，任意酶和胶凝剂的混合物的交联可通过将颗粒形成的混合物与有机液体分离并用双官能或多官能交联剂处理该混合物来实现。在某些情况下，例如用梭菌细胞，悬浮在有机液体中的颗粒形式混合物可造用上述试剂处理当需要使酶在生物催化剂中混合时，可在交联步骤中将酶引入到胶化悬浮液中。必要时，可使固定化活细胞再活化并生长。

最好使交联步骤后所得到的颗粒干燥，以便使它们便于贮存和包装。用前一般将颗粒复水并使固定化活细胞任意生长。

在操作中用作起始物的活细胞，酶和胶凝剂的混合物可通过将活细胞和任意酶悬浮在胶凝剂的水溶液中而制成。胶凝水溶液的温度应能获得液体形式的活性混合物，因此，温度最好是大约25℃到40℃，最高温度取决于所用活细胞的耐热性。

溶液中的明胶取决于所用的特效明胶并且可在重量约占所用水的0.1～25%的范围之内，最好在重量比约为5～10%的范围之内变化。活细胞和酶的浓度取决于使用不溶性生物催化剂的目的以及不溶性生物催化剂的活性。当使用明胶和壳聚糖混合物时，壳聚糖的浓度可在重量约占所用水的0.05～10%范围内，最好在重量比约为0.1～1%的范围内变化。溶液的PH最好是在此PH下细胞具有最大的稳定性，但是，在明胶也存在的情况下，PH应在大约2-12的范围内，为了使明胶胶化，最好在3-10的范围内。对于其它胶凝剂，PH范围可以不同。

在制备活细胞，酶和胶凝剂混合物的过程中，可加入稳定剂，除了胶凝剂之外当该稳定剂存在时可使活细胞和/或酶稳定。可用于本发明所述过程的稳定剂的例子是山梨醇，甘油，它们系所使用的活细胞和酶的非代谢产物。

用来产生活细胞，酶和胶凝剂的颗粒形式的水溶液或悬浮液的有机液体是一种微混溶于水或不混溶于水的有机液体。例如适宜的有机液体为具有四个或多个碳原子的脂族醇，例如象丁醇，醇酯和低级脂肪酸酯这样的链烷醇;如象乙酸乙酯，乙酸丁酯和丙酸乙酯这样的C_1-4链烷酸;象石蜡油，汽油和石油醚这样的支链或直链脂族烃;象苯及其同系物这样的芳香烃;象二氯甲烷和三氯乙烯这样的氯化烃;以及两种或多种上述液体的混合物。在这些液体中，乙酸丁酯是最好的，尤其是因为它简单，经济，便于回收。

在含水活细胞-任意酶-胶凝剂混合物和有机液体的合并过程中所用的搅拌类型和该悬浮液的冷却操作（当使用明胶时）的类型可以是任何一种可使含水活细胞-任意酶-胶凝剂混合物分散成所需大小的颗粒的类型。所得到颗粒的大小取决于搅拌的强度，液体的比重，液体的表面张力和粘度的不同，并在某些情况下取于冷却的速度，温度和起始含水活细胞-酶-胶凝剂溶液或悬浮液的浓度。一般来说，搅拌就足够了，但也可用其它方法，诸如将活细胞-酶-胶凝剂混合物喷雾到有机液体中形成悬浮液。含有有机液体中的活细胞-酶-明胶混合物的冷却，如冷却到10℃或更低，甚至冷却到上述混合物的冰点以下，可在与有机液体中混合物形成悬浮液的同时或之后进行，并且可迅速或缓慢地进行冷却。

交联一步是用双官能或多官能交联剂与含有氨基的聚合物形成共价键而完成的。适宜的双官能交联到的例子是戊二醛和单宁酸。

本发明的一个实施例包括在交联步骤之前颗粒的脱水。脱水可使得到的颗粒变小，并且当将这些缩小的颗粒引入到双官能或多官能的交联剂水溶液中时使交联反应更好。

脱水步骤最好通过颗粒的渗透收缩实现。例如用山梨醇或甘油脱水。在脱水步骤以后可将双官能或多官能交联剂加入到该液体中进行交联。在颗粒与用于悬浮步骤的有机液体分开后可进行脱水步骤。

可将水不溶性填料加入到在此过程中所用的细胞-任意酶-胶凝剂的混合物中，因为它们可改进最终颗粒的物理性质。适宜的不溶性填料的例子是细碎的硅酸盐或氧化硅，诸如KETJENSIL（一种合成氧化硅），白色硅藻土载体（HYFLO，DICALITE），硅藻土等。

最后，用这种方法获得的颗粒形式的细胞-任意酶-胶凝剂制剂最好经过洗涤，例如适宜的洗液是水或缓冲液，其PH取决于生物活性物质，一般说来，最好使颗粒形式的制剂干燥。

在本发明中所用的胶凝剂，如明胶，是一种聚电解质，它可能影响酶的表现最适PH，即酶显示其最高活力时的PH值。此外，影响酶的表现最适PH的其它化合物可包含在颗粒中，如颗粒中其它聚电解质的例子是鱼精蛋白硫酸盐和聚丙烯酸，从而使活细胞-酶-胶凝剂颗粒的表现最适PH适合于其未来的目的。

酿造工业对连续发酵的应用有极大的兴趣并且更多的研究和有进展性的工作直接有利于能够用于长时间连续发酵的固定化酵母的生产。出现的问题一方面关系到延长反应期固定化酵母的完整性，也关系到到延长反应期酵母可由所需糖原料生产可接受的高的和恒定的浓度的乙醇的能力。在连续发酵过程中所遇到的另一个问题是在固定化酵母床中产热的问题。酿造工业所感兴趣的许多酵母在批量发酵中是非常令人满意的，而同样的酵母，当用于连续床发酵时还有不利地影响其特性的热量问题，这对于连续床发酵桶来说又必须有复杂的条件和昂贵的冷却机制。

考虑到这些目的，为了鉴定对本发明所述的固定化充分嗜热和用于连续发酵的菌株我们已经筛选了也可改善乙醇耐受性的各种耐热酵母。

从我们的筛选试验中出现的一种酵母是于1913年首次描述定名为越南酵母的酵母（Saccharomyces anamensis）。从那以后的工作人员已决定该酵母不是酵母属的一个独立种，事实上它是酿酒酵母的变种，在第一和第二版的Lodder and Kreger van Rij，The yeasts，North Holland Publ.Co.，Amsterdam，中写明了两者之间的相同性，在随后由Kreger van Rij编辑，由Elsevier出版的该书中也写明了。

我们检验了从日本大阪获得的酿酒酵母越南酵母变种，IFO 0203，并且惊奇地发现，当按本发明固定后，它发酵如葡萄糖的能力意外地并且非常有利地改变了。在我们的筛选试验中，IFO 0203菌株在各种试验中与在英国以Fermipan“red”名字出售的British Fermentation Products Ltd.（Fermipan是商标名）的产品常规面包酵母227 Ng菌株进行了比较。我们发现在我们的40℃或更高温的耐热试验中，IFO 0203为阳性而277Ng为阴性。在进一步以37℃6小时确定乙醇生产的试验中，在相同的条件下IFO 0203产生2.67%v/v而227 Ng产生基本相同的乙醇，为2.54%v/v。

在起始细胞浓度高的成批发酵中也比较了两种酵母，发现在相同的条件下，IFO 0203在16小时产生15%v/v的乙醇，在24小时产生16.5%，而227Ng在16小时产生18%乙醇而在在24小时产生18.5%。进行这些试验的条件是使发酵不因缺乏可可发酵的糖而停止。

还进一步比较了两种酵母以确定糖的D值。这是在民主德国专利DD216480-A号中提出的概念，并且认为D值大于25秒的酵母是耐受醇的。D值代表在58℃杀死90%酵母细胞所需的秒数。D值低于25秒的酵母被认为是醇敏感性的。在这个试验中，IFO0203的D值为50秒而227Ng的D值为26秒，两者在此试验中均被认为是醇耐受性的。

基于以上述常规发酵之上的各种比较试验，没有理由认为当依本发明固定并用于连续发酵时，这两种酵母菌会有任何明显的差异。但当进行了比较之后，十分令人惊奇地发现，IFO 0203表现了非常重大的改进。当依照本发明用淀粉葡萄糖苷酶共固定227Ng后，颗粒原料装入柱中，糊精连续地装入柱中并连续放出产乙醇产物流，发现当发酵达到稳定进行装态时，产物流含有8.5-9.5%v/v乙醇。对IFO 0203重复该过程时，得到了11-12%的乙醇水平并且保持达6个月之久。

我们的研究显示出，IFO 0203在由最初的分离者和第一版Lodder所报道的发酵能力上有了一些变化，与公开的性质相反，我们发现了，在进行上述实验中所用的IFO 0203菌株不能发酵麦芽糖。这就向我们指出自从原始保藏以来已发生了突变，而且我们保藏了不能发酵麦芽糖的酿酒酵母IFO 0203菌株，保藏在CBS，时间是1986年5月7日，保藏号CBS 25286

此外，我们研究了菌株IFO 0203（CBS 25286）的人工突变菌株。我们试图用亚致死剂量的已知诱变剂去处理酵母细胞来诱变出该菌株。我们所用的诱变剂包括亚硝酸钠和甲基磺酰乙酯。用亚硝酸钠和甲基磺酰乙酯处理IFO 0203菌株所获的特殊突变体已被发现显示出了甚至比其亲代更优异的某些性质。我们称该菌株为2490-KI13，并且于1986年5月7日将2490-KI13突变菌保藏于CBS，获得的储存号为CBS 25386。简言之，我们倾向将该保藏的突变菌作为菌株13。突变体13包括本发明的进一步的实施方案。

对突变菌13已作了上述对亲代IFO 0203菌所作的各种试验。在耐热生长试验中，发现突变菌13比其亲代CBS 25286的耐热性差，但比227Ng耐受性强。用Klett-Summerson光密度分析仪以66滤器测得其先密度值，以3次读数的平均值得到下面的结果。

菌株 40℃ 41.5℃ 42.5℃

IFO-0203（CBS 25286） 408 357 345

突变菌13（CBS 25386） 383 338 305

227Ng 325 113 100

2103Ng（CBS 6131） 171 149 99

在常规的37℃发酵培养中，突变菌13产生了3.61%v/v的乙醇，相对比，CBS 25268产生2.67%v/v，227Ng为2.54%。

在16和24小时后确定醇生产的试验中，突变菌13在16小时产生13.25%v/v的醇，在24小时产生15.5%的醇，就生产醇来讲比其亲代和227Ng菌株均高。

然而，当突变菌13按本发明用淀粉葡萄糖苷酶于交联明胶中共固定化并装载于连续发酵罐的柱中时，在产物流中的乙醇水平为11%-12%v/v，也就是说，它具有比其亲代CBS 25286优良的性质，即它可连续6个月维持高的醇水平，此外，则以更快的速度达到相等的醇生产水平。

本发明生物催化剂的主要用途在于糖的转化，然而，依据生活细胞的性质，该生物催化剂还可用于其他可利用固定化细胞的微生物学方法中。

在活细胞是酵母细胞时，本生物催化剂的一个主要用途是对可发酵糖进行发酵来生产乙醇，特别是在连续发酵条件下。如上所示，本发明的生物催化剂已被发现是在连续发酵罐中表达酵母细胞的一种特别优良的方法，其中将生物催化剂放入固定床，流动床或（连续）搅拌的罐式反应器中。

在本发明的一个优选实施方案中，生物催化剂是放入流动床反应器中，反应混合物的输入方式是使反应器内的流化为均匀的。更好地是在反应空间的顶部设置一个多功能分离室，以彻底地进行气-液-固体混合物的分离，使其离开反应空间，并将生物催化剂完全返送到反应室内。这种带多功能分离室的流动床反应器已经在EP-A-0090450中描述了，那是用于附有生物质的颗粒与废水的分离。令人惊奇地是现在发现同种的反应器可以很好地用于制备乙醇，特别是是用根据本发明的生物催化剂时。本专业领域的技术人员可以依所用的细胞来确定具体的最优条件，而考虑细胞的停留时间/活细胞生长（如酵母细胞）的原则与所述欧洲专利申请揭示的相似。

向反应器内连续输入可发酵的糖，含有乙醇的产物流就连续地流出。当然，必须调整酵母与入料的可发酵糖的量，根据本发明的一个特别优异的实施方案，生物催化剂可以含有我们保藏的酿酒酵母CBS 25286或25386以及淀粉葡萄糖苷酶，而入料中含糊精。糊精可以是用酶降解淀粉而制成的，例如用α-淀粉酶，得到的糊精的平均聚合度为7-10，而最终降解糊精得到一种葡萄糖入料，这是生物催化剂自身用淀粉葡萄糖苷酶而获得的。

在以下的实施例中给出了一些优选的实施方案以说明本发明。然而，应当理解的是，本发明并不受具体实施方案的限定。

实施例1

40克干的制备好的酵母（酿酒酵母）2103Ng，CBS No6131，96.5%干固体，悬浮于960毫升含60克明胶的约40℃的水溶液中，调PH5.5。将预先加热至40℃的乙酸正丁酯在搅拌条件下加入到该酵母-明胶悬浮水液中至4000毫升。将所获的悬浮液迅速冷却至10℃，则形成含酵母-明胶的颗粒。倾析除去乙酸正丁酯。在30克戊二醛（50%v/v溶液）于2000毫升水中并在50℃调至PH6.5为1小时的溶液中将颗粒（1公司湿颗粒）与其交联。水洗颗粒直至丁酸正丁酯的气味再也察觉不到时为止。所获的颗粒具良好的物理稳定性并且不溶于水。被包埋的酵母在有氧条件下于3000毫升培养基中成批量地过夜培养。用0.1N NaOH保持PH为4.5，用从热稳定水浴中来的水在套层中循环保持温度为35℃。

在含（%w/v）22%葡萄糖，2%NH₄Cl，0.5%KH₂PO₄，0.1% NaCl，1%MgSO₄·7H₂O，0.2% CaCl₂·2H₂O，Tween 80（1ml/l），麦角甾醇（6.5ml/l），0.1%酵母膏，维生素B（7.5mg/l）和消泡剂（0.5ml/l）的培养基中使选择的酵母培养物生长。

表1中总结了在固定化过程中后几步中包埋于颗粒中的成活细胞量（在麦芽膏琼脂平板上记数）。没有检测出乙酸正丁酯对包埋于明胶中酵母的影响。

表1

过程中的步骤活细胞量/珠粒干重克细胞（%）

酵母-明胶悬浮液 4×10⁹100

加乙酸丁酯后 4×10⁹100

交联后 5×10⁸40

再生后 6×10⁹150

实施例2

用与实施例1相同的方法，只是起始物为40克干的制备好的酵母（酿酒酵母2031Ng，CBSNo6128，96.5%干固体）和8毫升淀粉葡萄糖苷酶（AMIGASE LX，26000 AGI单位/毫升，Gist-brocades）来替代原来的只是酵母，得到交联的一酵母-淀粉葡萄糖苷酶-明胶颗粒，其在水中不溶且具有良好的物理稳定性。

实施例3

用实施例1的方法，以不同的酿酒酵母1777Ng，CBS No.4877，96.5%干固体制成酵母-明胶颗粒，当倾析除去乙酸正丁酯后将所获的颗粒在有可溶性淀粉葡萄糖苷酶存在的条件下与戊二醛交联。

30克戊二醛（50%v/v溶液）和200毫升淀粉葡萄糖苷酶（AMIGASE，见实施例2）于200毫升水中的溶液与1000克湿颗粒在5℃PH6.5条件下交联1小时。

弃去溶液后，淀粉葡萄糖苷酶包被的酵母-明胶颗粒洗几次直至彻底去除了交联剂。乙醇发酵按实施例20进行。与按实例2方法制备的颗粒相比较，该淀粉葡萄糖苷酶-酵母-明胶颗粒表现出了更高的操作稳定性。

实施例4

对于不溶性微生物的连续生产，该方法要作以下修饰。含微生物的明胶溶液通过数个细管用泵抽入到含乙酸正丁酯并处于5℃的柱中。管道的下边末端低于乙酸丁酯平面，该管子将稳定的微生物-明胶流传送过去，该流到达乙酸正丁酯时变为小液滴。液滴的大小依据泵入的速度而变化。乙酸正丁酯含有戊二醛。柱长5米，所以滴下来的液滴有足够的时间明胶化并与交联剂反应。从柱的底部连续收集所获的珠粒，与乙酸正丁酯相分离并用水洗。在补足消耗的戊二醛后将乙酸正丁酯在循环到柱中。柱的内径约为4Cm，每小时产生8升不溶性微生物珠粒。

实施例5

以与实施例4相同的方式连续产生共固定化微生物-酶颗粒，不同点在于含有酶和微生物的明胶溶液挤到乙酸正丁酯溶液中。

实施例6

在一系列的实验中，按实施例1制备酵母-明胶颗粒，不同点在于依次用下述的有机溶剂代替乙酸正丁酯：

甲苯

汽油

石油醚（高沸点部份 70/110）

环己烷

正戊烷

在所有情况下，在这些有机溶剑中至少过一小时培养后的细胞量为100%。

实施例7

用与实施例4相同的方法，但是用巴氏醋杆菌ATCC 9325取代酵母菌，获得不溶性颗粒。

在固定化过程中的后几步封入颗粒的活细胞量（在B.H.I.琼脂Difco平板上计数，pH7.4）总结与表2。乙酸正丁酯对明胶包埋的醋杆菌细胞没有不良影响，也没检测到戊二醛对细胞的损害。

表2

方法中的步骤活细胞量（%）

醋杆菌-明胶悬浮液 100

挤入乙酸丁酯后 100

交联后 100

实施例8

在40℃将20克蟹壳壳聚糖溶于450ml的稀乙酸中，再用30克乙酸钠调至pH6.0。然后将250克湿的巴氏醋杆菌悬浮于壳聚糖溶液中并保持温度在40℃。另外将20克琼脂溶于500ml自来水并加热至100℃。

将琼脂溶液冷却至45℃并加到醋杆菌-壳聚糖悬浮液中。按实施例4所述在5℃将该悬浮液挤入到乙酸正丁脂中。按实施例3所述。水洗所获的颗粒并与戊二醛交联，只是交联剂的浓度大一倍。

该颗粒不溶于水并有良好的物理稳定性。

实施例9

250克细菌浆液（植物乳杆菌，3.5%干固体）悬浮于40℃的含60克明胶的750ml水溶液中。

在该细菌-明胶悬浮水液中搅拌条件下加入预热至40℃的乙酸正丁酯4000ml。所得的悬浮液迅速冷却至10℃并形成含细菌-明胶的颗粒。倾去乙酸正丁酯。在5℃的由30克戊二醛（50%v/v溶液）于2000ml水并调pH6.5至1小时的溶液中交联该颗粒（1公斤湿珠粒）。水洗颗粒直至乙酸正丁酯的气味察觉不到时为止。所获颗粒悬良好的物理稳定性并不溶于水。在微需氧条件下于3000ml培养基中成批培养包埋了的细菌细胞。用10N NaOH保持pH6.0，用从热稳定器中来的水在套层中保持30℃温度。在含10g/l胨，8g/l Lab-Lemco，4g/l酵母膏，20g/l葡萄糖，1g/l Tween80，2g/lK₂HPO₄，3g/l乙酸钠，2g/l柠檬酸三铵，0.2g/l MgSO₄·7H₂O，0.038g/l MnSO₄·H₂O和60g/lGISTEX的培养基上培养所选择的细菌培养物。

表3中总结的是在固定方法的后几步中封入颗粒的活细胞量〔在MRS AGAR（OXOID CM359）平板上计数〕。没检测到乙酸正丁酯对明胶包埋细菌细胞的不良影响。

表3

方法中的步骤活细菌细胞量（%）

细菌-明胶悬浮液 100

加乙酸丁酯后 100

交联后 1

再生后 10^＊

^＊9×10⁸个细菌细胞/珠粒干重克

实施例10

活跃生长的丙酮丁醇梭菌ATCC824（Clostridium acet-obutylicum Weizmann菌株）接种表4中所述的培养基，并在氮气下以37℃不控制PH的条件下培养。2周后，收获发酵罐中的成分并用无菌去离子水洗孢子两次。典型的产率为0.43克孢子（湿重）/葡萄糖克。1毫克孢子相当于2.3×10¹⁰个孢子。在所选条件下的最大生长率为0.36（μmax）/小时。将洗过的孢子再悬浮至最终浓度为15g/l（约5g/l干重），在≤5℃并有戊二醛（高至1%W/W）存在条件下培养等分样品1小时。用无菌去离子水洗过之后，一个接种到含葡萄糖（10g/l）脑心融合中的稀释系列给以热冲击（2分钟，80℃）并在37℃培养。没观察到戊二醛对孢子存活力的影响。以根据标准方法过程用于酵母/淀粉葡萄糖苷酶交联有戊二醛（0.2%W/W）的明胶（6.0%W/W）固定孢子（0.2%W/W）。在处理过程中间隔检测孢子的存活力。用蛋白水解酶悬浮液水解明胶后，在热活化孢子后将稀释系列涂板于含葡萄糖（10g/l）和二硫苏糖醇（0.08%W/W）的BHI琼脂上。在无氧罐中以37℃培养一周后的成份被获得，并且显示出丙醇丁醇梭菌孢子的存活力不受所用固定化方法的影响。

表4

培养基成分（每升蒸馏水）

磷酸钾缓冲液 15mM

MgSO₄·6H₂O 0.2g

NH₄Cl 0.65g

酵母膏 5.0g

胰胨 5.0g

维生素溶液 0.5ml

微量元素溶液 9.0ml

刃天青（0.1%） 1.0ml

Na₂S-半胱氨酸HCl（5%） 10.0ml

葡萄糖 30.0g

维生素：

生物素 40mg/l

PABA 100mg/l

维生素Bc 40mg/l

Ca pantothenate 100mg/l

烟酸 100mg/l

维生素B₁₂2mg/l

硫胺素·HCl 10mg/l

维生素B₆·HCl 100mg/l

硫辛酸 100mg/l

维生素B₂10mg/l

微量元素：

次氮基三乙酸 12.8g/l

FeSO₄·7H₂O 0.1g/l

MnCl₂·4H₂O 0.1g/l

CoCl₂·6H₂O 0.17g/l

CaCl₂·2H₂O 0.1g/l

ZnCl₂0.1g/l

CuCl₂0.02g/l

H₃BO₃0.01g/l

NaMoO₄·2H₂O 0.01g/l

NaCl 1.0g/l

Na₂SeO₃0.02g/l

NiCl₂0.1g/l

实施例11

如例9所述将植物乳杆菌（Lactobacillus，plantarus）固定化，用白明胶（6%W/W），壳聚糖（chitosan）（sigma公司产品，C-3646，（0.5%W/W）的混液固定植物乳杆菌细胞。表5总结了固定化程序后将有活力细胞包入颗粒中的量（根据例9所述方法平板计数）。

表5

^＊1%＝2×10⁶细胞/克珠粒干重

实施例12

重复例11所述程序，但混液用白明胶（6%W/W）和氮丙啶（SP-200 Nippon Shokubai），（2%W/W）混合，来固定酵母细胞。表6总结了固定化程序后将有活力细胞包入颗粒中的量（根据例1所述方法平板计数）。

表6

实施例13

重复例9所述程序，混液用白明胶（4%W/W）和藻酸胺（2%W/W）。上述藻酸胺衍生物按下列步骤制备：将含20克海藻盐稠化剂Manucol E/RE，pH3.5的溶液迅速地加入到750ml蒸馏水中，再加含23克（0.2摩尔）1，6-己二酰二胺的一个小体积溶液和200毫升蒸馏水，再用浓醋酸将混液的pH调至10.0。在室温下搅动4小时，再用1.0升甲醇稀释混液。将沉淀过滤，用200ml甲醇洗两次。50℃于真空下干燥后，得到一白色粉末，它可用作酶和微生物的支持材料。用戊二醛交联后（见例1），得到不溶的颗粒，它具有良好的稳定性和可与表6资料相比拟的活力细胞计数。

实施例14

将75克植物细胞浆液（Tagetes minuta）（含1.5%W/W干重）悬浮在175毫升含17克白明胶的水溶液中，温度为40℃，pH5.0。通过数条细管将含白明胶的植物细胞浆液泵入保持在5℃的含n-基醋酸酯的层析柱。管子的下端要低于丁基醋酸酯的水平，从而能使植物细胞浆液-白明胶混液以稳定液流逐滴进入n-丁基醋酸酯。液滴的大小取决于泵的速度。柱长为5cm，从而使液滴有充分的时间进入凝胶。连续收集柱底出来的与n-丁基醋酸酯分开的珠粒，用水洗之。n-丁基醋酸酯被循环使用于柱。柱内直径为约4cm，每小时生产约8升不溶的植物细胞珠粒。然后将这些珠粒在5℃，pH6.0与不同浓度的戊二醛交联一小时。用自来水充分洗涤得到的珠粒。它们不溶于水，显示出很好的机械稳定性。

实施例15

用石海代替n-丁基醋酸酯重复例14的步骤。也可得到良好机械稳定性和不溶于水的颗粒。

实施例16

在一系列实验中，根据例4的程序制备出各种酵母-白明胶颗粒，但要在进入冷n-丁基醋酸酯前将氧化锆粉末（325目）加入酵母-白明胶悬液，好像加的ZrO₂量越多，所得湿颗粒的密度越大。典型的实验结果示在图1。

实施例17

例4所述的实验中，将少量卵磷脂加入丁基醋酸酯。从而产生小纤维而不是小颗粒。

实施例18

用例2所述方法制备20克共固定化的淀粉葡萄糖苷酶和酵母的湿颗粒。为增加贮存的稳定性，将酵母-淀粉葡萄糖苷酶-明胶颗粒置于实验室间歇式流化器上干燥20～30分钟。要注意酵母粒化的温度不超过40℃。更要注意的是空气流化及开始干燥过程进行的快，而在起始阶段要手工搅动或振摇颗粒。所得颗粒含85～93%干物质。当贮藏在5℃，真空中时，12个月以后酵母细胞及共固定的淀粉葡萄糖苷酶都没失去任何活性。

实施例19

将根据例1方法得到的酵母-明胶颗粒用于生物反应器（CSTR）中（工作体积为800毫升）。装入350克湿颗粒，将天菌的20%（W/V）葡萄糖液加入生长基质中（pH4.5），将其以不同流速通过反应器。温度保持为32℃。生物反应器连续运行四个月。为测定乙醇，葡萄糖和甘油，在此期间从流出物中取样。没有特别的方法使其维持无菌，但没有出现可观察到的污染。

所得结果表明乙醇平均浓度为8.0～8.5%（V/V）时固定化酵母细胞在操作上的高度稳定性。

实施例20

根据例2所述方法所得的酵母-淀粉葡萄糖苷酶-明胶颗粒以与例19所述同样的方式再生和应用，但要用起始DE值为15（Snowflake）的20%（W/V）麦芽糊精溶液代替葡萄糖。

结果示在图2，表明共固定的淀粉葡萄糖苷酶和所用酵母细胞具有高的操作稳定性。从而可能在一步操作中将DE-15麦芽糊精底物转化成酒精。酒精平均浓度是8.5%（v/v）。

例21：

将按例7方法得到的含醋杆菌-白明胶的颗粒用于生物反应器（工作体积为800ml）（CSTR），填入80克湿粒和720ml含5%（w/v）葡萄糖液，2%（w/v）酵母萃取液的天菌的培养基。培养基用pH7.0的磷酸盐缓冲。30℃下温育16小时后，取出样品，分析含葡萄糖和醋酸的量。

醋酸的终浓度为0.5g/l，产酸率为每小时每克细胞（干重）含21毫克醋酸。

用酒精代替葡萄糖进行与上述同样的实验。后者，醋酸终浓度为0.8g/l，产率为每小时每克细胞（干重）产生31毫克醋酸。

例22：

将例9所述方法得到的植物乳杆菌-白明胶颗粒用于生物反应器（CSTR）（工作体积为800ml），填入140克湿颗粒和例9所述的培养基300ml。

在开始发酵时，将352毫升48%（w/w）的葡萄糖溶液以16ml/hr的速度在22小时内加入。温度保持在30℃，用10N的NaOH保持pH为6.0。每批发酵的总时间为6天，在此期间要取出样品测定葡萄糖和乳酸的含量。没有特别保证无菌的措施，但不能发现污染。结果表明有高的乳酸产量，最终可高达96%。发酵终了时乳酸的浓度如图3所示可达17.8%（w/v）。

例23：

物反应器CSTR（培养体积为0.5升）充N₂，将表4所示培养基用于例10所述固定化梭菌的发酵。根据Krouwel的方法（见Biotechnol letts 3期（1981）158-159），用酒精水溶液（50%w/w）给珠粒天菌（含2g/l孢子的0.251），并催芽。加培养基前用无菌生理盐水洗除去酒精。然后菌发芽和生长。图4所示开始160小时的发酵结果。葡萄糖转化为丁醇、丁酸、乙酸酯和乳酸。偶而也可见微量的丙酮（没有表示出）。当葡糖产率为5g/h时，丁醇的最大产率为0.76g/h。

培养不同阶段的珠粒用电子显微镜扫描，表明孢子和一些残存的细胞已分布在白明胶基质中，7天内得到珠粒的完全的群落。

例24：

如例14和15所述，在Mnrashige和Skoog基质中测定固定化的植物细胞对氧气的消耗，该基质中含2%（w/v）的蔗糖。结果示在图5。固定化的Tagetes minuta以与细胞悬液同样的数量级消耗氧。

实例25：

酿酒酵母IFO 0203（CBS 252.86）的突变

该方法是基于在酵母菌进行连续培养，在培养过程中通过生长相关的pH值的变化来控制向发酵罐（the“Phauxostas”）中加入新鲜培养基的速率。该方法已被G.A.Martin和W.P.Hempfling叙述过〔Arch Microkiol 107（1976）41-47）。将基本微量培养基装入一升Gallenkamp发酵罐中，该培养基的组成见下面。乙醇的水平在开始控制在3%（v/v）。所有操作都是在无菌条件下进行，且含有0.5升复合培养基的发酵罐预先生长的酿酒酵母IFO 0203（CBS252，86）接种。起始pH控制在4.5，该发酵罐有一个氢氧化钠的进口，以便必要时用它来控制pH在4.5。发酵罐也有一个新鲜培养基的进口，它通过phauxostat控制，从而使葡萄糖浓度不再受限制。起始温度为32℃。当发酵罐进入稳定工作状态后，温度增至40℃。发酵罐连续运转七个月。

按照下面提出的方案，当乙醇浓度成为有限时，酵母量就随突变剂而波动。且在随后每当乙醇浓度变为有限时，酵母量再次随突变剂而变化。开始时，甲基磺酰乙酯（EMS）是以注入后使发酵罐中EMS的浓度达到下面所示的w/v百分数的量加入，接着就加进亚硝酸钠的水溶液，使发酵罐中的亚硝酸钠的浓度（mM/L）如下所示。

基本培养基的浓度如下：

g/l

NH₄Cl 2.5

KH₂PO₄0.25

MgSO₄·7H₂O 0.1

NaCl 0.05

孢子成分 0.1（ml）

维生素 0.5（ml）

麦角固醇 1.72（mg）

吐温80 0.25

葡萄糖 100g

诱变剂变化方案如下：

接种后的时间（小时）诱变剂的变化

160 0.01EMS

460 0.1EMS

650 1.0EMS

1200 0.1mM NaNO₂

1430 0.5mM NaNO₂

1600 1.0mM NaNO₂

1820 2.0mM NaNO₂

1960 3.0mM NaNO₂

间隔一定时间进行取样且在总共2490小时之后，取出的样品进行稀释且涂布在含有6%乙醇的麦芽琼脂上。16个生长良好的菌落在37℃培养6小时后，用乙醇产生试验进行进一步地分析，如前所述，当发现在37℃培养6小时后，分离的各种突变菌株提高乙醇的浓度至2.53%和3.61%v/v。升高至3.61%值的突变菌株鉴定为突变株2490 KI13，也是上面所述的储存突变株CBS 253.86。

继续进行主要培养物的发酵，且在总共培养4860小时后进一步取样。

当发现获得的突变株能够产生2.69%至3.56%v/v之间的乙醇时，用前面已叙述过的方法对分离的各种样品在37℃培养6小时后，再一次进行产乙醇检测。产生3.56%乙醇的样品被称作突变株4860 KI1，而产生3.31%乙醇的突变株被称作突变株4860 KI6。

实例26：

发酵是在图6所示的流动床反应器中进行的。

发酵罐的基本构成是：一个内部直径为6cm高度为1500cm的柱形流动部分（1），其顶部为一个内部直径为14cm的固定部分（2），在固定部分（2）的内部是气体隔离区（3）。流动部分（1）是通过一个原料管（12）从下面进料。固定部分（2）带有一个出口（14）和一个再循环口（15）流动部分（1）被一个可控恒温水套（4）环绕。水套（4）是通过管（6）进料且其温度是通过温度控制装置（7）和冷却水槽（11）来控措。流动部分（1）内部的pH是通过一个pH记录仪（10）来控制，它是通过进料管（5）来控制碱的进量。原料是通过进口（12）从原料库（16）供给流动柱（1）的，进口（12）带有温度显示仪（8）和pH显示仪（9）。通过管道（15）离开固定部分（2）的循环作用物通过泵（13）从进口（12）又循环回来。

制备具有下列组成的作用物。

A.麦芽糊精（DE.8-10） 1.60g/l

NH₄Cl 2.5g/l

KH₂PO₄0.25g/l

B.基础盐

CaCl₂·2H₂O 2.0g/l

MgSO₄·7H₂O 10.0g/l

NaCl 1.0g/l

C.孢子成分

柠檬酸 0.250g/l

FeSO₄（NH₄）₂SO₄·6H₂O 0.450g/l

ZnSO₄·7H₂O 0.084g/l

CuSO₄·5H₂O 0.013g/l

MnSO₄·4H₂O 0.010g/l

H₃BO₃0.010g/l

Na₂MoO₄·2H₂O 0.010g/l

KI 0.005g/l

D.维生素

肌醇 0.200g/l

烟酸 0.010g/l

Ca-D-penthothenate 0.010g/l

维生素B1 0.010g/l

P-氨些苯甲酸 0.006g/l

维生素B6 0.001g/l

D-生物素 0.04×10^-3g/l

麦角固醇 0.001g/l

吐温-20 0.250ml/l

抗气泡剂 0.25ml/l

麦芽糊精溶液，基础盐培养基，维生素溶液和孢子溶液都在120℃单独灭菌20分钟。灭菌后用所述的组合物将四种溶液加在一起。

用小颗粒（平均直径：1.8mm）填入流动床反应器工作体积（1）的50%（E＝0.5）。这些颗粒由反应过的酵母细胞和固定到例2所详述的交叉连结的白明胶支持物上的淀粉葡萄糖苷酶组成。本实例提出的实验是用下列类型酵母菌株进行的：

1、酿酒酵母（面包酵母，227Ng）

2、酿酒酵母CBS 252.86

3、酿酒酵母CBS 253.86

麦芽糊精的溶液以特定速率从（11）连续加到发酵罐中，以便所有的多聚糖能够糖化且转化成乙醇。温度保持在32℃，pH是通过加4.0N NaOH保持在4.15。

作用物在上面的条件下进行连续发酵。为了帮助颗粒的流动，反应混合物的线速度通过在循环管（12）上的泵（13）调整到0.15cm/sec。流动混合物的乙醇浓度，糖（如麦芽糊精，麦芽糖和葡萄糖）的浓度以及甘油的浓度作用HP×07 C Biocad型碳水化合物柱通过高压液相层析每天进行测定。

图7表示了用3种不同类型酵母时，反应器中的作用物的稀释率和乙醇的最终浓度的关系。每一稳定期保持一星期。令人吃惊的是，只有酵母菌CBS 252.86和CBS 253.86能够达到大于体积的10.5%的，终乙醇浓度和小于2%的甘油浓度，而对于面包酵母，乙醇的最终浓度小于9%，甘油的浓度大于3%v/v。另外，达到了乙醇产物的平衡水平。

实例27

酿酒酵母CBS 253.86被固定白明胶上（如实例1所述）且在氧气存在下用例1的发酵培养基进行培养。颗粒中的酵母细胞的生长通过平板计数按时进行测定。图8表示了与培养时间相关的每克干颗粒中的活细胞的平均浓度。

能够获得至少4×10⁹细胞/每克干颗粒的最终浓度。通过用这些活性颗粒填充实例26的流动床反应器，能够达到高浓度的酵母细胞。图9表示了与反应器中的颗粒装载量相对的每立方米反应器中酵母细胞的数目。酵母细胞的浓度至少是未固定化的反应器系统（如细胞循环反应器）中得到的浓度的十倍。

实例28

带有共固定化淀粒葡萄糖苷酶和酿酒酵母CBS 253.86（见例2）的高活性颗粒用于例26所述的三个流动床反应器的发酵系统，但相互之间成串连接。每一反应器用颗粒填充到其操作体积的40%v/v。第一、二、三期的体积是各不相同的：V₁＝500ml;V₂＝400ml;V₃＝200ml。原料在这些反应器中的居留时间是：T₁＝2.63小时;T₂＝2.53小时;T₃＝4.21小时。乙醇的最终浓度和淀粉葡萄糖苷酶的残存活性的结果在图10中给出。这个图表明了产生乙醇的一个稳定的反应器系统，其第三期的平均乙醇浓度为10.4%（体积）。

表7概括了三个时期特定反应的平均速率，乙醇浓度，产量和产率。

表7

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