JPS5963186A - 反応担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的触媒作用を有する組吸物による特定
化合物の分解または生成させるための反応担体Ｖｃ関す
る。

近年、穏々の工業分野において生体内触媒奢利用したよ
り反応特異性の高い反応を用いることが試みられている
。上記の生体内触媒は通常の化学触媒と異なり常温、常
圧という緩和な条件下に効率よく反応を触媒し、しかも
その反応特異性が高いことが知られている。しかしなが
ら上記の生体内触媒は生物の生命活動を維持するために
存在するものであり、生体外に取出すことで触媒活性の
著るしい低下！きたす場合が多い。また従来上記の反応
は生体内触媒を水に溶解した状態で用いるため工業的利
用に際して所謂バッチ法（ｂａｔｃｈｐｒｏｃｅｓｓ　
）で行われてきた。

そのため高価な生体内触媒の回収が難かしく生成物のコ
スト面で著るしい不利益性Ｚもつだ（Ｊでなく、生成物
中の生体内触媒の残存乞まねくという欠点乞も有してい
た。

この欠点を克服するため１９１９年Ｎｅ１ｇｏｌとＧｒ
ｉｆｆｉｎによって始めて骨炭に酵母から抽出した生体
内触媒の一種である酵素、インベルターゼン吸着し、触
媒活性が示され固定化酵素（ｉｍｙ＋ｏｂｉｌｉｚｅｄ
　ｅｍｚｙｍｅ　）の研究が開始された。更に１９５３
年にＧｒｕｂｈｏｆｅｒ　と５ｃｈｅｉｔｈがポリアミ
ノポリスチレン樹脂なジアゾ化し７一種々の酵素を固定
化し積極的な利用をはかった０その後ＸＫａｔｚｌｒ　
−Ｋｐ、ｔｃｈａｌｓｋｌ等により種々の固定化法の開
発が行われ１９６９年１ｃは子細等により世界初の固定
化酵素を用いたＤＬ−アミノ酸の光学分割の工案化に、
成功している。生体内触媒の固定化には種々の方法が知
られているがこれを大別すると包括型（ｅｎｔｒａｐｐ
ｅｄ　Ｔｙｐｅ　）と結合型（ｂｏｕｎｄ　Ｔｙｐｎ’
）に分けられ、更に前者は格子型（ｍａｔｒｉｘ　−ｅ
ｎｔｒａｐｐｅｄ　−Ｔｙｐｅ）、マイクロカプセル型
（ｍｌｃｒｏ　−ｅｎｃａｐｓｕ１９ｔｅｄ　Ｔｙｐｅ
）に、また後者は吸着型（ａｂｓｏｒｂｅｄ　Ｔｙｐｅ
　）、共有結合型（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｂｏｕｎｄ
　Ｔｙｐｅ　）、イオン結合型（ｔｏｎｉｃ　−ｂ’ｏ
ｕｎｄ　Ｔｙｐｅ　）　ＶＣ分けられる。

上記の種々の生体内触媒の固定化方法には下記の如き欠
点がある。

てゲルを架橋したり、ゲル濃度を上げる試みが行われて
いる。しかし多官能外薬はゲルのみならず生体内触媒と
の反応も起こし、触媒活性の低下をもたらす。またゲル
濃度を上げる試みは包括された該触媒の母に比してゲル
の体積が大きく相対的に大容量の固定化担体が必要とな
るという欠点を有している。

また、マイクロカプセル型はカプセルの壁が物理的外力
に対して比較的弱く十分包括ができないという欠点１有
している。

一方、物理的、化学的手法を用いた物理吸着法およびイ
オン結合型は外部の環境、例えばｐＨやイオン強度の変
化により脱離し易いという欠点Ｚ有し、また共有結合型
は官能基と該触媒の結合により触媒活性の低下を引き起
こす場合が多いという欠点を持っている。

これらの欠点に対して親水性ゲルマトリックスの表面を
半透膜としてのポリアミドで被覆した担体は良好な強度
を有する好ましい担体゛Ｃある。特にアルギン酸塩は取
扱いが容易であり、それ自体のゲル強度も強いことが知
られ”Ｃいる。しかしながら、半透膜としてのポリアミ
ド皮膜が比較的容易に剥離し易いという欠点を持つでい
ることも知られでいる。

本発明の目的は、生体内触媒の脱離が防止され、物理的
外力に強く、シかも半透膜皮膜の剥離も発生することの
ない反応担体を提供することにある。

本発明者等は種々の検討を重ねた結果　上記の目的は、
アルギン酸塩からなる親水性ゲルマ）　ＩＪノクス中に
流体中の特定化合物と相互作用を起こし、分解または生
成物を生成テる相互作用性組成物質を包括してなる反応
担体において１．−ヒ記反応担体内ニケリアルキレンイ
ミンを含有せしめると共に該反応担体表面を少なくとも
流体中の特定化合物および相互作用により生成した分解
物または生成物を透過させ、上記の相互作用性組成物質
を透過せしめない・半→１過→←ｂ→チ升→二半透膜で
被覆した反応担体により達成し得ることを見い出した。

すなわち、本発明による反応担体は相互作用性組成物質
を包括したゲル強度の強いアルギン酸塩からなる親水性
ゲルマトリックスの表面な流体中の特定化合物ならびに
相互作用による分解物または生成物を透過させるが、上
記相互作用性組成物質は透過ぎせない如き半透膜で被覆
さ゛せ、かつ上記担体内にポリアルキレンイミンを含有
せしめること江よって前記従来の欠点を改良したもので
ある。

以下、本発明を更ＶＣ詳細ｐこ説明する。

本発明の反応担体の親水性ゲルマトリックスにおいては
特に親水性ゲルとしてアルギン酸またはその塩が用いら
れる。一般罠上記親水性ゲルとしては、夕（部の環境す
なわちＰＨＳ塩濃度、温度等の変化てゾルーゲル変化奢
誘起する各種の高分子物質、多糖類、ポリペプチド等が
好ましく用いられているが、本発明においては特にこれ
らの中でゲル強度の強いアルギン酸またはその塩が好ま
しく用いられる。

上記アルギン酸またはその塩を不発明釦よる反応担体の
素材として用いた場合には、該担体内に前記の相互作用
性組成物短音包括する際に多官能性試薬、例えばグルタ
ルアルデヒド、ＮＩＮ％チレンビスアクリルアミド等を
添加する必要がな下２極力防止することができる。

本発明において用いられるアルギン酸またはその塩の溶
液は例えば２価のアルカリ土類金属溶液からなる凝固洛
中に滴下することにより容易にゲル化して固体となる。

本発明の反応担体は、上記により得られた凝固した小球
状体のアルギ′、−酸塩からなるゲルマトリックスを取
り出して、この球状体の表面暑ホ゛リアミド、ポリウレ
ア、ポリウレタンウレア、ポリウレタン等で被覆して半
透膜を形成せしめたものである。

本発明における上記の半透膜の被覆方法としては、例え
ばマイクロカプセル化法を挙げることができる。マイク
ロカプセル化法については例えば近郊　保、小石真純著
［マイクロカプセルＪ　（１９７７年三共出版）に詳細
に記載されているが、その目的に応じて界面重合法、液
中乾燥法、相分離法等から任意に選択される。

次に例えばポリアミドを用いて親水性ゲルマトリックス
小球状体表面に半透膜？被覆さける具体的な好ましい方
法を記載する。

ｆなわち、上記の親水性ハロヶンマトリンクス小球状体
アシアミン水溶液に浸漬した後、該小球状体を取り出し
、これビ有機溶媒中に分散した後、ジカルボン酸ジクロ
リド干溶液を添加する。この方法１ｃよると、容易かつ
相互作用性ｆｆｌ１成物質の失活なまねくことなく半透
膜を１１−ることができる。

このようＶこして彫成ぎれる本発明の反応担体の形状は
、必ずしも特定されないが、特に球状が好ましい。それ
は液体の接触面積ならびにカラム等の反応塔に充填した
ときのことを考慮した場合、好適であるからである。ま
たその大きさも目的によつ゛Ｃ任意ではあるが、約１０
μｍ〜１０ｍｍ　程度が好ましい。

上記本発明に係わる親水性ゲル７トリノクス中には相互
作用性組成物質が包括される。本発明？こおける上記の
ＩＮＮ佳作用組成物質とは、流体中の特定化合物と相互
作用を起こし、該特定化合物χ分解または他の化合物な
生成するための反応を誘起する如ぎ物質の総称乞いう。

例えば酵素、補酵素、Ａルガネジ、微生物等の菌体等が
包含される。

不発１１１Ｔにより包括される酵素が触媒となる反応な
彫式別（て分けると、ｎ多化還元反応、転移反応、加水
分解反応、不斉合成反応（リアーゼ反応）、異性化反応
等を挙げることができる。

以下余白 そこで次に上記醇化還元反応を触媒する酵素の一例を挙
げると、Ｌ−１ミノｍオキシグーゼ、チロシナーゼ等が
あり、また転移反応を触媒する酸ホスホリラーゼ 素としてはデキストランスフ）−丁７ミ事ア′ミン酔キ
ナーゼ等があり、また加水分解反応を触媒する酵素とし
ては、７ミノアシラーゼ、ゲルコ７ミラーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、ロイシン７ミノペプチダーゼ等があり
、不斉合成反応を触媒する酵素としては、Ｄ−オキシニ
トリラーゼ、アスパルターゼ等があり、さらに異性ｆヒ
反応を触媒する酵ヲことしては、グルコースイソメラー
ゼ等がある。

本発明においては前記の補酵素も同様に包括することが
できる。この補酵素としては、例えば酸化還元補酵素で
あるニコチンアミドジヌクレオシド（ＮＡＤ）、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドｔＲｍ　（ＮＡＤＰ）
　、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）等があり、ア
ミ７基転移補酵素であるビリドキザルリン酸（Ｐ　Ｌ　
Ｐ　）　、アシル基転移補酵素であるコエンザイムＡ等
を挙げることができる。

上記酵素および補酵素については日本牛用学会編集「生
化学ハンドブック、第■巻、消３頁〜第３０５頁（東京
化学同人列１９８０年）Ｋ詳細に記載されている。

本発明においては２種以上の酵素または酵素と補酵素と
を組み合わせた複合酵素系も用いることができる。特に
微生物を用いた発酵法と呼ばれるものは単一の酵素反応
で目的物が得られる場合は少なくて多くの種類の酵素お
よび補酵素が関与しているものが大部分である。これら
の複合酵素系を同一または分けて包括することもできる
。

また更には有用微生物あるいは該微生物中の特定器官す
なわちオルガネラを包括することもできる。

上記の有用微生物については例えばＧ、　Ｋ、　５ｋｒ
ｙ−ａｂｉｎｓ　Ｌ、　Ａ、　Ｍ、　Ｇｏ１ｏｖｌｅｖ
ａ著「Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｚ−ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉ
ｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　　（１９７６年、ナウカ
、モスクワ）に詳細に記載されている。

本発明において前記親水性ゲルマトリックス中のは酵素
、オルガネラおよび菌体等である。

本発明による前記アルギン酸またはその塩からなる親水
性ゲルマトリックスの中にはポリアルキレンイミン例え
ばポリエチレンイミンを含有せしめる。

本発明により含有される上記ポリエチレンイミンの濃度
はアルギン酸またはその塩に対して０．０５重量％〜３
０重量％、好ましくは０．５重量％〜１５重量％である
。

本発明において使用されるポリアルキレンイミンは直鎖
状のものでもよいが分岐構造を有する高分子重合体であ
ることが好ましい。

本発明によると上記のポリアルキレンイミンをアルギン
酸またはその塩からなる親水性ゲルマトリックス中に含
有せしめることにより、前記のポリ１ミド等の皮膜から
なる上記マトリックスの半透膜の剥離を防止することが
できる。

従っ゛〔本発明の反応担体は物理的外力に弾く、かつ半
透膜皮膜の剥離も防止され、生体内鉄ｆ＾の脱離を効果
的に改良することが可能にさ」ｔた。

また親水性ゲルマ）　ＩＩノクス中には上記の如き相互
作用性組成物質の他に種々の添加剤を加えることができ
る。

上記添加剤としては例えば緩衝剤を挙げるごとができる
。この緩衝剤は用いられろ酵素等の相互作用性組成物質
の性ｌｆｉ＋ｃより種類、ｐ■■、イオン強度を選択さ
れるべきであるが・例えばトリス−塩酸緩衝液や、Ｎ、
　Ｅ、　Ｇｏｏｄ　　等によっＣ合成され？ｌ！衝？￥
Ｌ例えばＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ
スルホン酸（ＴＢＳ）やＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ’−２−エタンスルポン酸（Ｉ（ＥＰＥＳ）
は酵素活性を阻害することが少ないものとして挙げるこ
とが可能である。

上記緩衝剤の他の添加剤としては２−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトール、フルコンビンｍ、ＩＡ元型
グルタチオン等の還元剤、グリセロール、ショ糖、エチ
レングリコール等のポリオール類、二価金属イオン（例
えばＭｇ２″−、Ｍｎ”＋、　Ｃａ２＋等）、キレート
試薬（エチレンジアミン四酢醗等）、基質、補ｅ素、ア
ロステリックエフェクター、エタノール、アセトン、ジ
メチルスルホキシド等の有機溶媒、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフル］
ロリン酸（ＤＦＰ）等のプロテアーゼ阻害剤および蛋白
質（例えばウシ血清アルブミン）が挙げられる。これら
は相互作用性組成物質の種類によって選択されるべきで
あり、またその使用量も上記種類により選択されるもの
である。

本発明の反応担体は医薬品工業、食品工業、化学工業の
分野における有用物質の生成ばかりでなく、医療分野に
おける人工臓器のための担体となり得るものである。例
えば無カタラーゼ症のためのカタラーゼ含有担体として
用いることもでき、また医療分析、例えば臨床検査のた
めのセンサーに用いる酵素担体としても有用である。

以下、実施例により本発明を具体的に記載するが、本発
明はこれらによって限定されるものではない。

実施例−１ ０．０５Ｍのトリス−塩醇緩衝液（ｐＨ７，０）　　１
００属に４．０．Ｐのアルギン爾ナトリウムを溶解し、
０，５ｇのポリエチレンイミン（東京化成Ｃｆｉ　製＼
Ｐ　３８１゜分校型重合体）を２０ｍ６の水に溶解した
溶液を添加し１次いでアシラーゼ４９．５０　ｍ９　（
１０８，９ｕｎｉｔ　）を０．０５Ｍのトリス−塩酸緩
衝液に溶解した溶液を加え攪拌した後脱泡を行なった。

この溶液を０．２　Ｍの塩化カルシウム水溶液に小液滴
として滴加して小球体を得た。この小球体を塩化カルシ
ウム水溶液中にか分間静１斤シ、完全にゲル化させた後
、濾別し’；Ｊ：）　ｒｖ６の０．２　Ｍへキサメチレ
ンジアミン水溶液に２分間浸漬した後、再び濾別し、ヘ
キサメチレンジアミンを含有する７セトンで小球体を洗
浄し小球体表面を乾燥した。

上記小球体を、’０：２Ｍのセバシン酸ジクロライドの
５ｐａｎ　８５　　（花王アトラス＠製）が１％含まれ
るクロロホルム／シクロヘキサン混合溶媒（容Ｆｉｔ比
で１：３）の溶液に加え３分間攪拌した後、直ちに小球
体を分増し、５０％のＴｗｅｅｎ　２０　（花王アトラ
ス■製）水溶液で洗浄し有機溶媒を除き、更に０．０５
Ｍの塩化カルシウム水溶液で洗浄した後、０．０５Ｍの
塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩
衝液に分散させて４℃で保存した。

比較試料としてポリエチレンイミンを含まずポリアミド
被覆を行なったもの、および同様にポリエチレンイミン
を含まず、またポリアミドの被覆も行なわなかったもの
を作製し、それぞれを比較担体１および２とした。

（測定方法） ７ＪＪ　ｍｌ、の０．０５Ｍ／／のＮ−７セチ）Ｉｉ−
Ｄ　Ｌ　−７ラニン水溶液ＶＣ２〜５　ｕｎｉｔ　　の
酵素もしくは同量の本発明になる反応担体または比較担
体を加えた。

この溶液をゆっくり攪拌しながら３７℃に３０〜６０分
間保ち、３０〜６０％の加水分解反応を行なわせた。

反応終了後、アルギン酸ゲル小球体は濾過して外部した
。反応液に７シラーゼが混入している場合には直らに反
応液を１００℃の熱水中に３分間漬けてアシラーゼを変
性させ、活性炭（ノーリットＡ）を０．２ｇ加えて除去
した。

この溶液を日本分光（４力のボラリメーターＤＩＰ−１
８１を用いて４３５ｎｍの波長、１０はのセル長で測定
した値から次式に従って初期活性保持率を計算しただし
上式において、 ［：Ｖ’］ＩＭ　；　１　ｒｒｐの７シラーゼを含む固
定化酵素の加水分解速度、 （Ｖ’ｌＮＡ　；　１　ｒｖの７シラーゼの加水分解速
度である。

上記による測定結果を下記第１表に示す。

（第１表） 上記の結果から明らかなように、本発明の反応担体は良
好な活性を保持していることがわかる。

これに対して比較担体（１）は操作過程で皮膜の剥離が
見られ、その上比較担体（１）および伐）では明らかに
アミノ７シラーゼの担体からの脱離が起こり１著るしい
活性低下が認められた。

実施例−２ 実施例１で用いた本発明による反応担体および比較担体
（１）および（２）を実施例１と同様の測定操作を６回
締返しアミノアシラーゼの活性を調べた。

測定結果を下記第２表に示したが、表においては上記測
定の第１回目を１００％としてそれぞれ相対活性値（％
）で示した。

（第２表） 上記表からも理解し得るように、本発明の反応担体は繰
返し操作によっても程んど活性の低下がみられず良好な
活性の維持を示したが、比較担体は何れもや■返し操作
の回数が増える毎に急速に活性低下が起った。

代理人　　桑　原　砂　美

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルギン酸塩からなる親水性ゲルマトリックス中に流体
   中の特定化合物と相互作用奮起こし、分解または生成物
   音生成する相互作用性組成物質を包括してなる反応担体
   （（おいて、上記反応担体内にポリｒルキレンイミンを
   含有せしめると共に該反応担体表面を少なくとも流体中
   の特定化合物および相互作用により生成しＩこ分解物ま
   たは生成物乞透過させ、上記の相互作用性組成物質？透
   過せしめない半透膜で被膜したことを特徴とする反応担
   体。