DK170175B1

DK170175B1 - Fremgangsmåde til immobilisering af enzymer på en bærere

Info

Publication number: DK170175B1
Application number: DK180686A
Authority: DK
Inventors: Guy Levesque; Jean-Louis Seris
Original assignee: Elf Aquitaine
Priority date: 1985-04-19
Filing date: 1986-04-18
Publication date: 1995-06-06
Also published as: FR2580666B1; DK180686D0; EP0199644A1; JPS61254190A; JPH0632616B2; DE3662057D1; BE904609A; CA1272149A; EP0199644B1; US4767706A; DK180686A; FR2580666A1; DE199644T1

Description

i DK 170175 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til immobilisering af enzymer på bærere med frie aminogrupper ved anvendelse af en dithioester som immobiliseringsmiddel.

5 Immobiliseringen af enzymer, d.v.s. deres fiksering til en fast bærer, eventuelt en formstofbærer, har udgjort et vigtigt fremskridt inden for denne gren af teknikken. Den har medført en betydelig forbedring ved, at den gør det muligt gentagne gange at genanvende et enzym, som ellers, i fri tilstand, praktisk taget ville gå tabt 10 fra én operation til en anden. Det at arbejde med et således immobiliseret enzym bidrager desuden til renheden af det behandlede miljø. Fikseringen af enzymer på faste bærere, hvad enten det sker ved adsorption eller gennem kovalente bindinger, er imidlertid en temmelig følsom operation, der nødvendiggør et godt undersøgt valg 15 af materialer. Immobiliseringen ved hjælp af kovalente bindinger fører til systemer, der er meget stabile, hvorved der undgås tab af enzymer under disses anvendelse. Men det enzymatiske system, der opnås på sidstnævnte måde, udviser almindeligvis en meget svagere aktivitet end det frie enzym alene, som følge af den steriske 20 hindring. Fikseringen af et proteinmakromolekyle på en stiv bærer begrænser faktisk adgangen til de aktive steder i makromolekylet for det substrat, som skal behandles. Man ved f.eks., at ribonuclease, som immobiliseres på saccharose, undergår en aktivitétsreduktion af størrelsen 10-75% i forhold til det frie enzym, afhængig af arten af 25 det behandlede substrat. For at afhjælpe denne ulempe kan man anvende en "bærerarm", d.v.s. en mel!emreaktant, som på den ene side er bundet til bæreren og på den anden side til enzymet. Selv med de kendte systemer af denne art ligger enzymaktiviteten alligevel almindeligvis under det frie enzyms aktivitet. Ydermere er valget af 30 midler, der kan spille rollen som "arm", ret begrænset, idet mange af de eventuelle reagenser ændrer enzymets aktivitet, eller fordi de reaktionsbetingelser, som de indebærer, ikke er kompatible med bevarelsen af den katalytiske aktivitet. De midler, som oftest anvendes på nuværende tidspunkt, er midler som glutaraldehyd, 35 cyanogenbromid og nogle andre, der er omtalt nedenfor.

DK 170175 B1 2

Funktionel gruppe ________. Aktiveringsmetode

Enzym Bærer 5___ ~NH2 -NH2 glutaraldehyd “NH2 -COOH acylcarbodiimidazote- ring 10 "NH2 -OH cyanogentriazinbrome- ring -COOH -NH2 carbodiimid NH2 diazoniumsalt -SH -SH disvovlbro.

20

Anvendelsen af størsteparten af disse midler er vanskelig, og de har de ovenfor omtalte ulemper.

Fra en artikel af V.C. Borlaza et al. i "Carboxylate Research" 79, 25 (1980), side 125-132, kendes der dog yderligere en fremgangsmåde til immobilisation af enzymer på cellulose ved anvendelse af dithio-bis-thioformiat eller S-methyldithiocarbonat som immobiliseringsmidler, men ved denne immobilisation genfindes kun 5% af den oprindelige aktivitet, når der er tale om Γα-amylase, og 17%, når der er tale 30 om trypsin.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til immobilisering af enzymer, hvilken fremgangsmåde indebærer et » markant fremskridt i forhold hertil. Denne fremgangsmåde gør brug af 35 et nyt middel, der tjener som "bærerarm", og hvis anvendelse er , lettere og mere pålideligt end anvendelsen af de kendte midler, som er omtalt ovenfor, og den medfører desuden den vigtige fordel, at den tilvejebringer en forøget grad af enzymaktivitet efter immobiliseringen af enzymet, hvilken aktivitet er praktisk taget den DK 170175 B1 3 samme som aktiviteten inden immobiliseringen. Desuden er de enzymatiske systemer, som tilvejebringes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, meget stabile og lette at opbevare ved normale temperaturer.

5

Dette opnås med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til immobilisering af et enzym på en bærer med frie aminogrupper ved anvendelse af en dithioester som immobiliseringsmiddel, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en dithioester, 10 hvis to thiosyregrupper er forbundet med hinanden via en carbon-hydrid- eller ethergruppe, og at bis-dithioestermolekylet i begge sine ender har en nukleofob gruppe, som er i stand til at reagere med en aminfunktion.

15 Sagt med andre ord bindes enzymet til bæreren via bis-di thi oestere, hvis thiosyregrupper er indbyrdes forbundet med hinanden via en carbonhydrid- eller ethergruppe, og som bærer to nukleofobe atomer eller grupper, der er i stand til at reagere med N^-grupper på bæreren og enzymet.

20

Ved anvendelse af de omhandlede bis-dithioestere lettes fikseringen i høj grad, både til bærerne og til enzymerne, uden at der kræves en speciel aktivering, som det er tilfældet med navnlig di syrer og deres anhydrider.

25

Midlet, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan gengives ved formlen:

X-R'-S-C-R-C-S-R'-X

30 " " (1)

S S

hvori R betegner en carbonhydridkæde eller -ring med et variabelt antal carbonatomer, men fortrinsvis med 1 til 20 carbonatomer. Det 35 samme gælder grupperne R'. Hvad angår X, betegner det et atom eller en gruppe, som kan begunstige reaktionen med -NH eller -NH2, som f.eks. et halogen, en carboxylsyre-, sulfinsyre-, sulfonsyre-, phosphorsyrling-, phosphonsyrling-, phosphorsyre- eller phosphonsyregruppe, aktivt H, SH, en amid-, hydroxygruppe o.s.v. Når DK 170175 B1 4 R betegner en al ifati sk kæde, kan den være mættet eller umættet og omfatte fra 2 til 18 carbonatomer, navnlig fra 6 til 12 carbon-atomer. Denne kæde kan bære substituenter, specielt arylgrupper, alkylethergrupper og/eller halogenatomer. Da R kan være en cyklisk 5 gruppe, kan den udgøres af cycloal kaner, cycloalkener og/eller arylgrupper med 1 til 2 ringe, men især 5 til 12 carbonatomer og navnlig phenyl, al kyl phenyler, diphenyl eller sådanne cykliske forbindelser med substituenter.

10 En foretrukket X-gruppe til realisering af opfindelsen er en carboxyl syregruppe COOH, som gør det muligt at få "armen" til at reagere med bæreren og enzymet under tilstrækkeligt milde betingelser og dog effektivt.

15 I det følgende er der angivet nogle eksempler på bis(carboxy-alkyldithioestere) eller carboxyl al kyltetrathioalkandithioater.

i hooc-ch2-s-c-ch2-c-s-ch2cooh

II II

s s 20

II H00C-CH2S-C-(CH2)6-C-S-CH2C00H

II II

s s 25

III HOOC-CH2CH2CH2-S-C-(CH2)3-C-S-CH2CH2CH2COOH

II II

s s

30 IV H00C-CH2CH2-S-C-(CH2)10-C-S-CH2CH2C00H

II II

s s 4

V H00C-(CH2)6-S-C-CH2CH2-C-S-(CH2)6C00H

II II

35 * s s DK 170175 B1 5

VI H00C-CH2-S-C-(CH2)12-C-S-CH2-C00H

II II

s s 5 VII H00C-CH2CH2-S-C-r Vc-s-ch2ch2-cooh

II / II

s s CH, CH, 10

VIII H00C-(CH2)3-S-C----HC-C \ -CH----C-$-(CH2)3-C00H

II \_/ II

S / \ s * CH2 ch2 ύ 15

IX H00C-CH2-S-C-CH2~ /q\-CH2-C-S-CH2-C00H

5 R" 6 20

X H00C-CH2-S-C-CH2CH2-0-CH2CH2-C-CH2-C00H

II II

s s

25 XI HOOC-CH2CH-CH2-SC-(CH2)8-CS-CH2CHCH2-COOH

/ II II /

Cl S S Cl I forbindelsen IX kan R" være fraværende eller udgøres af en substituent, såsom halogen, nitro, al kyl, alkoxy o.s.v. Der kan i øvrigt være flere af sådanne substituenter R".

Blandt andre dithioestere, som kan anvendes til immobilisering af enzymer, kan nævnes følgende typiske forbindelser: xii h2noc-ch2-s-c-(ch2)8-c-s-ch2conh2

II II

s s 35 DK 170175 B1 6 XIII Cl3CCH2-S-C-(CH2)4-C-SCH2CCl3

II H

S s

5 XIV H02S-(CH2)4-S-C-(Ph)-C-S-(CH2)4-S02H

ii n

S S

* XV H03S-CH2-S-C-(CH2)10-c-s-ch2-so3h 10 s s

XVI H0CH2CH2-S-C-(CH2)6-C-S-CH2CH20H

Il 11 s s 15 5 XVII -s-c-(ch2,6.c-s-(^- 20 R'" R"' XVIII (^)^ -S-C-(CH2CH2CH20)n-C-S- R'" S S R''' 25 XIX (CH3)2N-CH2CH2-S-C(CH2)3-C-S-CH2CH2-N(CH3)2

η II

s s

30 XX HS8CH2)3-S-C-(CH2)3-C-S-(CH2)3-SH

II II

s s

Disse forskellige forbindelser kan fremstilles ved metoder, som er 35 beskrevet af LEVESSON (Act. Chem, Scand. part B, 29, 539, 1975), af » MARVEL et al (J. Am, Chem. Soc. 77, 5997-1955) og/eller af GRESSIER og LEVESQUE (Europ. Polymer, 16, 1093-1980).

Ifølge ovenstående ses det, at det er muligt som fikseringsmiddel at DK 170175 B1 7 udvælge en dithioester, som udgør en mere eller mindre lang kæde.

Man kan således betjene sig af en "arm", der er så lang, som det er nødvendigt for at reducere eller undertrykkke den steriske hindring under det immobil i serede enzyms indvirkning på et givet substrat.

5 Desuden kan fikseringsmidlets egenskaber modificeres i afhængighed af de påtænkte anvendelser. Dette kan gøres ved passende valg af grupperne R, R', R", R'" og X. En aromatisk kerne i R bibringer f.eks. bærer-"armen" stivhed. En alifatisk kæde tilvejebringer blødhed. Alkoxygrupper, såsom -(CH2CH20)n og ethergrupper, fører til 10 en mere eller mindre udtalt hydrofilicitet, medens lange kæder af CH2 eller aryler, såsom diphenyl, bidrager til hydrofobicitet.

Man kan også modificere dithioesterens nukleofobe aktivitet således, at denne gøres kompatibel med det givne enzyms sarthed.

15

Det hidtil ukendte intermediære middel, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan først kombineres med bæreren eller med enzymet, uden at dette undergår en denaturering.

20 Basissubstans for de bærere, som kan anvendes, er i princippet alle sådanne, som på den ene eller den anden måde er i stand til at fiksere NH2~grupper, eller også sådanne, som i deres opbygning allerede indeholder NH2-grupper, der er disponible for reaktion med dithioesteren. Således kan man anvende stoffer som kieselsyre, 25 forskellige silikater,, bl.a. zeolitter, glas, aluminiumsilikater, bentonit samt aluminiumoxider og aktivt carbon behandlet på passende måde med en amin. På samme måde egner sig cel lul oser og derivater heraf, specielt aminerede celluloser, chitosan og især proteiner, der er tilstrækkeligt stive og bærer NH eller NH2~grupper, som er i 30 stand til at reagere med X-grupperne i midlet, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I sidstnævnte kategori er det også muligt at udvælge en passende bærer blandt stoffer, såsom f.eks. casein, lactoglobulin, ovalbumin, serumalbumin o.s.v., eventuelt hærdede ved opvarmning eller ad kemisk vej. En anden 35 gruppe af meget interessante bærere er syntetiske polymerer, som bærer frie eller delvis bundne NH2-grupper, såsom navnlig polyaminopolystyren, polyacrylamid, aminerede polyacrylater, glycidylpolymethacrylat (eller -polyacrylat), der er amineret ved åbning af epoxybroerne under indvirkning af en amin eller af DK 170175 B1 8 ammoniak (FR patentskrift nr- 2 442 244).

Hvad angår enzymer, henhører de generelt set til alle grupper, d.v.s. til hydro!aser, specielt proteaser, carbohydraser og ester-5 aser, såvel som oxidaser, deshydrogenaser, isomeri seringsenzymer og polymerisationsenzymer o.s.v. Man kan således ved hjælp af dithio-etherne immobilisere amylaser, arginase, dipeptidase, enolase, * aldolase, adenosin, desaminase, lipaser, catalaser, peroxidaser, glucoseoxidase, galactoseoxidase, lactatoxidaser, oxalatoxidase, 10 pyruvatoxidase, nuclease, ribonuclease, lysozym, trypsin, chymotrypsin, osteløbe, invertase, maltase, pectinase, alkohol-deshydrogenaser, lactatdeshydrogenase, formiatdeshydrogenase, glucosedeshydrogenase osv.

15 Immobiliseringen ifølge opfindelsen af enzymer kan udføres ved simpel kontakt ved lav temperatur, oftest ved en temperatur mellem 0 og 30°C og især mellem 0 og 10°C, mellem det givne enzym og bæreren aktiveret med di thi oesteren i en puffer med en pH-værdi, der er passende for enzymet.

20

Den forudgående aktivering af bæreren udføres almindeligvis ved at holde bæreren i en opløsning af dithioester i et opløsningsmiddel for denne. Afhængigt af dithioesterens affinitet over for -^-grupperne på bæreren finder denne operation sted i kold tilstand eller i 25 varm tilstand, almindeligvis ved en temperatur mellem 0 og 100°C og oftest ved omgivelsernes temperatur eller mellem 10 og 35°C.

Når bæreren fra naturens hånd ikke indeholder NHg- eller -NH-grup-per, behandles den før aktivering med en amin. I det tilfælde, hvor 30 der f.eks. anvendes kieselsyre eller silikater, underkastes den faste bærer to successive behandlinger; først en amineringsbehandling, derpå fraskillelse af amineringsreaktanten og tørring af jt bæreren. Derpå bringes sidstnævnte i kontakt med en opløsning, almindeligvis organisk, af dithioesteren.

For så vidt angår den forudgående aktivering af enzymet er denne hovedsagelig rettet mod den "bløde" modifikation af lysinrester, som forekommer på proteinets yderside.

35 DK 170175 B1 9

Almindeligvis finder podningen af bis-dithioetheren på enzymet sted i et pufret miljø ved en pH-værdi, som er lig med eller som ligger tæt ved neutralitetspunktet. Når enzymet imidlertid uden ulemper kan tåle en svagt basisk pH-værdi, er det imidlertid af interesse at 5 gennemføre operationen i et sådant miljø. Man accelererer herved podningsreaktionen ved katalyse som følge af OH-ioner. I en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres operationen således i en puffer med en pH-værdi på 7-9, fortrinsvis mellem 8 og 9.

10

Efter fikseringen af et enzym på bæreren ved hjælp af bis-dithio-esteren er der oftest en vis mængde dithi ogrupper tilbage, som ikke har reageret. Til dette formål er det tilstrækkeligt at lade disse grupper reagere med små molekyler af typen H2N-R-Y, hvor R er en 15 al ifati sk carbonhydridgruppe eller en arylgruppe med en ringe molekylmasse, fortrinsvis indeholdende 1 til 8 carbonatomer, og Y er en funktionel gruppe udvalgt under hensyntagen til de egenskaber, som det drejer sig om at bibringe enzymets omgivelser. Y kan f.eks. være -C00H, -CH20H, -CH3 eller en anden gruppe, som er ugiftig, for 20 så vidt angår enzymets aktivitet.

En måde at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen på består i først at aktivere aminfunktionerne på enzymet ved hjælp af bis-dithioesteren, før denne bringes i kontakt med den aminerede 25 polymer. I dette tilfælde optimaliseres på forhånd den mængde reaktant, som er nødvendig og tilstrækkelig til denne aktivering, for at undgå et overskud af bis-dithioester. Denne måde at gennemføre fremgangsmåden på er fordelagtig i forbindelse med visse opløselige aminerede bærere, idet der undgås en tværbinding, som 30 kunne frembringes under den direkte aktivering af sidstnævnte.

Et særligt fordelagtigt eksempel på en immobiliseringsfremgangsmåde består i at behandle en renset, porøs siliciumoxidgel med en opløsning af en silan i et passende opløsningsmiddel. Silanen kan 35 være en al kyl sil an, en al kyl hal ogens il an og fortrinsvis en al kyl ami nos il an. I det tilfælde, hvor man ikke har udnyttet en aminosil an, behandles produktet med en amin eller med ammoniak, hvorefter det faste stof fraskilles, vaskes og tørres. Det således præaktiverede siliciumdioxid bringes i suspension i en organisk DK 170175 B1 10 opløsning af en dithioester. Opløsningsmidlet kan f.eks. være en alkohol, en keton osv. eller en blanding af opløsningsmidler. Der anvendes oftest fra 0,1 til 10'6 og navnlig fra 10"^ til 10"® mol dithioester pr. gram tør bærer. Denne mængde bestemmes på basis af 5 indholdet af -Nl^-grupper i bæreren, idet der i princippet anvendes 1 mol dithioester pr. tilstedeværende mol NHg-gruppe.

t

Efter den nødvendige tid, som almindeligvis er på mellem 6 og 60 timer, fraskilles bæreren fra opløsningsmidlet, skylles med 10 sidstnævnte og derpå med destilleret vand og suspenderes i en pufferopløsning med en pH-værdi, som er hensigtsmæssig for det enzym, som man har til hensigt at fiksere på bæreren. Denne suspension kan iøvrigt opbevares i lang tid, indtil den skal anvendes.

15

For at gennemføre immobiliseringen indfører man det ønskede enzym i suspensionen af opløsningen i en pH-puffer. Det hele får lov til at henstå, almindeligvis i 4 til 40 timer, oftest i 10 til 30 timer, ved den ovenfor nævnte temperatur, fortrinsvis omkring 4-8°C.

20

Derpå fraskilles bæreren ved filtrering eller centrifugering, vaskes med en vandig elektrolytopløsning, derpå med en puffer med en passende pH-værdi. Bæreren er herefter parat til anvendelse men kan også opbevares i den valgte pufferopløsning.

25

Som følge af, at bis-di thi oesterne, som er beskrevet ovenfor, egner sig til fiksering af enzymer på plastiske eller formbare bærere, hvoraf der er angivet flere eksempler ovenfor, egner de sig godt til fremstilling af enzymatiske membraner eller opfangningsorganer. Til 30 denne anvendelse kan membranen f.eks. opnås ved netdannelse mellem et enzym og en gel af proteincellulose eller en amineret cellulose-ester eller en acryl-styren- eller vinylpolymer, som bærer Moeller NH-grupper, ved hjælp af en bi s-dithioester ifølge den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen skal herefter beskrives nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

35 DK 170175 B1 11

Immobilisering af qlucoseoxidase på en bærer af siliciumdioxid 100 g Siliciumdioxid, kendt i handelen under betegnelsen "XOB 30D", med en middel poredi ameter på 650 A og et specifikt overfladeareal på 2 5 50 m /g, behandles først med en blanding af sulfo og salpetersyre og skylles derpå godt i destilleret vand. Siliciumdioxidet tørres derefter til eliminering af alle spor af vand og behandles derpå i 6 timer ved omgivelsernes temperatur med 300 ml af en toluenopløsning indeholdende 15 g tri methoxypropyl aminos il an, (CHgOJgSiCHgC^CI^NHg.

10 Det således silanerede og aminerede siliciumdioxid skilles fra opløsningen, vaskes grundigt i toluen og hexan til eliminering af overskydende sil an. Det tørres til slut.

EKSEMPEL 1 15 5 g Af dette tørrede, aminerede siliciumdioxid bringes i suspension i 50 ml af en ethanol opløsning af 0,177 g, dvs. 0,0005 mol (10-2 mol/liter) carboxymethyltetrathiooctandithioat med formlen: 20 hooc-ch2-s-c-(ch2)6-c-s-ch2-cooh

S S

(M-354).

25 Suspensionen, som omrøres fra tid til anden, henstilles ved omgivelsernes temperatur i 48 timer. Siliciumdioxidet fraskilles derpå opløsningen, skylles i alkohol, dernæst i destilleret vand og indføres i en phosphatpufferopløsning med en pH-værdi på 7, hvori det opbevares.

30 1 g Siliciumdioxid opbevaret på denne måde tilsættes sammen med 10 ml puffer tilsættes 0,020 g glucoseoxidase (GOD) af en kendt type, der forhandles under betegnelsen "II" (sigma). Podningen får lov til at ske ved en temperatur på 5-6°C. Efter en kontakttid på 24 timer 35 fraskilles siliciumdioxidet ved filtrering, vaskes med 20 ml af en opløsning af 1M NaCl, derpå med 20-40 ml destilleret vand, og endelig skylles det med pufferopløsningen, hvori podningen har fundet sted. Vaskningen med NaCl (eller 1 M urinstofopløsning, som anvendtes i de øvrige eksempler) havde til formål at eliminere den DK 170175 B1 12 del af enzymet GOD, som alene blev tilbage ved adsorption. Til måling af aktiviteten af GOD og herved bekræfte enzymets fiksering bringes det podede siliciumdioxid i kontakt med en glucoseopløsning med en koncentration på 1 g/1, og aktiviteten bestemmes ved 5 spektrofotometri. ~ EKSEMPEL 2 t

Bestemmelse af den enzymatiske aktivitet af alucoseoxidase immobil i -10 seret ifølge eksempel 1 Først bestemmes aktiviteten af samme mængde enzym som den, der anvendes ved podningen, men i fri tilstand i en pufferopløsning.

Denne aktivitet af fri glucoseoxidase (GOD) bestemmes ved en 15 temperatur på 34-35°C i fri luft under let omrøring ved simpel kontakt mellem enzymet og en glucoseopløsning. Aktiviteten af GOD podet på siliciumdioxid bestemmes under samme driftsbetingelser.

Frit GOD Podet GOD

20 20 mg GOD 1 g siliciumdioxid podet med 20 10 ml puffer, mg GOD, X ml glucoseopløsning 10 ml puffer, X ml glucoseopløsning.

25

Aktiviteten følges i det ene tilfælde såvel som det andet spektrofotometri ske doseringer ifølge hexokinasemetoden.

Antallet af ml glucoseopløsning, X, kan varieres, men er identisk 30 ved sammenligning af aktiviteten af frit GOD og podet GOD.

Aktiviteten af immobil i seret GOD er praktisk taget den samme som for frit GOD bestemt under samme betingelser.

35 EKSEMPEL 3 >

Aktivitet af immobiliseret enzym som funktion af tiden

Forskellige bestemmelser af den enzymatiske aktivitet er blevet udført efter flere måneder på samme prøve af glucoseoxidase DK 170175 ΒΊ 13 immobil i seret på 1,00 g siliciumdioxid aktiveret med carboxymethyl-tetrathiododecanthioat podet med 20 mg 60D i 10 ml puffer med pH-værdi på 7. En opløsning af Ø-D-glucose i en mængde på 5 g/1 tilsattes på tidspunktet 0. Efter 1 minut bestemtes mængden af 5 glucose i suspensionen ved at fratrække mængden af substrat, der var blevet omdannet i dette tidsrum. Efter 6 måneders opbevaring ved omgivelsestemperatur var aktiviteten uændret.

EKSEMPEL 4 10 Forudgående aktivering af enzymet

Til en opløsning af glucoseoxidase i en phosphatpuffer som angivet i eksempel 1 sættes stigende mængder af en opløsning af de nedenfor _2 angivne bis-dithioestere i en koncentration på 10 M: 15

(a) HOOCH2C-S-C-(CH2)10-C-S-CH2-COOH

S S

(b) H00C-CH9S-C-CH9CH,0-CH,CH,,-C-SCH,C00H

Z II Z Z Z Z II z

20 SS

I hvert tilfælde følges dithioesterfunktionens forsvinden ved spektrofotometri ved 310 nm til sikring af, at reaktionen med de på giucoseoxidasen tilgængelige NH2-grupper har fundet sted.

25

Der iagttages en forskel i reaktivitet for de to forbindelser (a) og (b). Henført til det aktive proteinmolekyle, som er til stede i opløsningen, kan man anslå antallet af aminfunktioner, der er aktiveret af forbindelsen (a), til 5, og af forbindelsen (b) til 30 3,8.

Efter at have opretholdt kontakten mellem opløsningen af glucoseoxidase og bis-dithioester (a) i 48 timer måles aktiviteten af enzymet efter tilsætning af substrat, og der iagttages ingen 35 formindskelse af aktiviteten i forhold til en referenceopløsning opbeveret under de samme betingelser men uden tilstedeværelse af bis-dithioester.

Eksemplet viser, at man i første omgang lige så godt kan aktivere DK 170175 Bl 14 enzymet som den aminerede bærer, hvilket gør det muligt til hver slags enzymtype at vælge den vej, som er bedst egnet til opnåelse af et optimalt udbytte.

5 EKSEMPEL 5

Immobilisering af al kohol dehydrogenase c 10 g Siliciumdioxid amineret efter metoden, der er beskrevet i eksempel 1 og aktiveret ved hjælp af carboxymethyltetrathiooctandi-10 thioat, holdes i 48 timer i suspension i 100 ml phosphatpuffer, 50 mM, pH 7, indeholdende 100 mg al kohol dehydrogenase med en gæraktivitet på ca. 70 Ul/mg.

Der anvendes således et stort overskud af enzym for at forøge 15 præparatets aktivitet, Overskudet af enzym i opløsning kan efter fraskillelse af den aktiverede bærer recirkuleres til en yderligere immobilisering.

Efter 48 timers kontakt ved 4"C fraskilles siliciumdioxidet, som 20 successivt skylles med phosphatpuffer, destilleret vand og derpå med 1M NaCl og bringes igen i suspension i phosphatpufferen.

Suspensionen af siliciumdioxid podet med al koholdehydrogenase inkuberes derpå i en glycinopløsning, 0,1 M, pH 7,5, for at 25 deaktivere de dithioestergrupper, som er til stede på siliciumdioxidet, og som ikke har reageret med enzymet. Der foretages på ny en vask af det immobil i serede enzympræparat med phosphatpuffer, pH=7. 1 35

Dette præparat udviser en specifik aktivitet på 11,3 UI pr. gram siliciumdioxid. Denne aktivitet er bemærkelsesværdigt stabil, som det fremgår af nedenstående resultater, der er opnået efter opbevaring af immobiliseret enzym i phosphatpuffer ved pH 7 og en temperatur på 4eC.

DK 170175 B1 15

Præparatets alder Specifik aktivitet (dage) Ul/g siliciumdioxid 5 1 dag 11,6 5 dage 10,9 10 dage 11,4 10 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til immobilisering af enzymer på bærere med frie aminogrupper ved anvendelse af en di thi oester som immobil i serings- 5 middel, kendetegnet ved, at der anvendes en dithioester, * hvis to thiosyregrupper er forbundet med hinanden via en carbonhydrid- eller ethergruppe, og at bis-dithioestermolekylet i t begge sine ender har en nukleofob gruppe, som er i stand til at reagere med en aminfunktion. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bis-dithioesteren har følgende formel: X-R'-S-C-R-C-S-R'X (I) »in

15 SS hvor R og R' betegner alifatiske, cycloalifatiske eller aromatiske carbonhydridgrupper, som kan bære substituenter, og hvor X betegner en aktiv gruppe eller et aktivt atom, der er i stand til at reagere 20 med en aminfunktion.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner en alifatisk kæde, fortrinsvis indeholdende 2 til 20 carbonatomer, som kan indeholde oxygenatomer. 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner en aryl eller en alkaryl, hvis ring kan have én eller flere substituenter, navnlig halogen, nitro-, hydroxyl- eller al kyl substituenter. 30

5. Fremgangsgmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R betegner eller omfatter en cycloal kylgruppe, specielt en cyclohexyl- eller cyclopentylgruppe, som kan bære én eller flere substituenter, v især alkylgrupper, halogener, nitro- eller hydroxylgrupper. 35

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 2 til 5, kendetegnet ved, at R' betegner en -(CHg^-kæde, hvor n fortrinsvis er på fra 2 til 18, hvilken kæde kan have substituenter, navnlig alkyl-, hydroxyl-, nitro- eller halogengrupper. DK 170175 B1

7. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 2 til 5, kendetegnet ved, at R' betegner en aryl-, oxyaryl- eller alkarylgruppe, hvis ring kan have substituenter, især halogener, al kyl-, nitro-, sulfo-, hydroxy-, oxy- eller thiolgrupper. 5

8. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 2 til 7, kendetegnet ved, at X betegner en carboxyl syregruppe.

9. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 2 til 7, kendeteg-10 net ved, at X udgøres af én eller flere halogener, hydroxyl-, sulfonyl-, sulfinyl-, phosphoryl- eller andre oxygenholdige phosphorgrupper, di al kyl amino- eller mercaptogrupper.

10. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav 1-9, kende-15 tegnet ved, at enzymet, der immobiliseres, er en hydrolase, oxidoreduktase, transferase, lyase, isomerase og/eller ligase, som bindes til en plastisk eller formbar, fast bærer af uorganisk eller organisk art med aminogrupper med henblik på anvendelse af det således immobil i serede enzym i en reaktor eller i en enzymatisk 20 membran.

11. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav 1-10, kendetegnet ved, at en forudgående aktivering med bis-dithioesteren udføres på enzymet. 25 1 35