JPH0632616B2 - 酵素を担体に固定する方法 - Google Patents
酵素を担体に固定する方法Info
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- JPH0632616B2 JPH0632616B2 JP61088447A JP8844786A JPH0632616B2 JP H0632616 B2 JPH0632616 B2 JP H0632616B2 JP 61088447 A JP61088447 A JP 61088447A JP 8844786 A JP8844786 A JP 8844786A JP H0632616 B2 JPH0632616 B2 JP H0632616B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
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- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は酵素を固体担体上に固定する方法の新規な改良
に関する。
に関する。
すなわち本願発明は、固定方法および得られた固定され
た酵素から成る。
た酵素から成る。
酵素の固定、すなわち酵素の、たとえばプラスチックの
ような固体担体への取り付けは、この技術分野における
重要な発展をなすものである。
ような固体担体への取り付けは、この技術分野における
重要な発展をなすものである。
もしも酵素が固定されていない、遊離状態では、実際に
一回の操作で失なわれてしまうが、この著るしい改善に
よって、酵素を何回も繰り返し使用することが可能とな
った。
一回の操作で失なわれてしまうが、この著るしい改善に
よって、酵素を何回も繰り返し使用することが可能とな
った。
また、このようにして固定された酵素による作用は処理
された媒体の純度に依存する。
された媒体の純度に依存する。
しかしながら、吸着または共有結合による固体担体への
酵素の固定は、極めてデリケートな操作であり、極めて
注意深い物質の選択を必要とする。
酵素の固定は、極めてデリケートな操作であり、極めて
注意深い物質の選択を必要とする。
共有結合による固定では、より安定な系がもたらされ、
その使用中の酵素の消失が回避される。
その使用中の酵素の消失が回避される。
しかしながら、この共有結合で得られた酵素系は、立体
障害のために遊離酵素単独の場合よりも一般に活性が低
い。
障害のために遊離酵素単独の場合よりも一般に活性が低
い。
事実、硬い担体上にタンパク質性の巨大分子が固定され
ると、巨大分子の活性点で処理されるべき基質が接近し
にくくなる。
ると、巨大分子の活性点で処理されるべき基質が接近し
にくくなる。
たとえば、アガロース(agarose)上に固定されたリボヌ
クレアーゼは、処理された基質の性質に応じて遊離酵素
に比較して10〜75％程度活性が低下することが知られて
いる。この欠点を解消するために、担体と酵素とを連結
する“支持架橋(suppoting bidge)”、すなわち担体と
酵素を連結する中間反応剤の使用がこころみられた。し
かしながら、この種の既知の系でさえも、酵素活性は遊
離酵素よりも一般に低い。
クレアーゼは、処理された基質の性質に応じて遊離酵素
に比較して10〜75％程度活性が低下することが知られて
いる。この欠点を解消するために、担体と酵素とを連結
する“支持架橋(suppoting bidge)”、すなわち担体と
酵素を連結する中間反応剤の使用がこころみられた。し
かしながら、この種の既知の系でさえも、酵素活性は遊
離酵素よりも一般に低い。
一方、架橋(bidge)として作用の薬剤の選択は、著るし
く制限される。なぜならば、多くの可能性のある反応剤
は、酵素の活性を変化させたり、或いは固定された酵素
系に要求される操作条件が酵素系の触媒活性の維持と両
立しないからである。
く制限される。なぜならば、多くの可能性のある反応剤
は、酵素の活性を変化させたり、或いは固定された酵素
系に要求される操作条件が酵素系の触媒活性の維持と両
立しないからである。
現在、最もしばしば使用されている架橋剤は、下記の表
に示すグルタルアルデヒド、シアノゲンブロマイドおよ
び種々の他の薬剤である。
に示すグルタルアルデヒド、シアノゲンブロマイドおよ
び種々の他の薬剤である。
これら薬剤の大部分は使用方法が極めてデリケートであ
り、上述したような欠点を有している。
り、上述したような欠点を有している。
本発明は酵素の固定技術に重要な、進歩した工程を提供
するものである。
するものである。
すなわち本発明は支持架橋として役立つ新規な薬剤を使
用し、かかる薬剤の使用は上述したような既知の薬剤よ
りも使用がより容易であり、かつより確実性に富む。一
方、固定後に優れた活性を有する酵素を与えるという重
要な進歩をもたらす。
用し、かかる薬剤の使用は上述したような既知の薬剤よ
りも使用がより容易であり、かつより確実性に富む。一
方、固定後に優れた活性を有する酵素を与えるという重
要な進歩をもたらす。
本発明によって形成された酵素系は極めて安定であり、
通常の温度で容易に貯えることができる。
通常の温度で容易に貯えることができる。
本発明は共有結合によって酵素を固定する方法であり、
NH2基を含む担体および担体と酵素の両方のNH2基に固定
された中間剤を使用する。
NH2基を含む担体および担体と酵素の両方のNH2基に固定
された中間剤を使用する。
ここで中間剤または支持架橋はビスジチオ酸エステルに
よって構成され、二つのエステル官能基は親核基を末端
に有する。
よって構成され、二つのエステル官能基は親核基を末端
に有する。
換言すれば、担体および酵素の活性化剤は、担体および
酵素のNH2基と反応することができる二つの親核原子ま
たは基を有するビスジチオエステルである。
酵素のNH2基と反応することができる二つの親核原子ま
たは基を有するビスジチオエステルである。
本発明はジチオ基の存在によって、かかるビスジチオエ
ステルの担体および酵素の両方への固定が著るしく促進
されるという驚くべき発見にもとづくものであり、従来
の薬剤、特に二酸またはこれらの無水物のように特別の
活性化を必要としない。
ステルの担体および酵素の両方への固定が著るしく促進
されるという驚くべき発見にもとづくものであり、従来
の薬剤、特に二酸またはこれらの無水物のように特別の
活性化を必要としない。
本発明による反応剤は下記の式(1)で表わされる。
ここでＲは種々のＣ原子数、好ましくは１〜20のＣ原子
数を有する炭化水素鎖または環であり、これはＲ′基に
ついても同様にあてはまる。Ｘは-NHまたは-NH2と反応
することができる原子または基を示し、たとえばハロゲ
ン、カルボキシル、スルフィン酸基、スルホン酸基、亜
リン酸基、亜ホスホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、
活性水素、ＳＨ、アミド、ヒドロキシル等を挙げること
ができる。
数を有する炭化水素鎖または環であり、これはＲ′基に
ついても同様にあてはまる。Ｘは-NHまたは-NH2と反応
することができる原子または基を示し、たとえばハロゲ
ン、カルボキシル、スルフィン酸基、スルホン酸基、亜
リン酸基、亜ホスホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、
活性水素、ＳＨ、アミド、ヒドロキシル等を挙げること
ができる。
Ｒが脂肪族鎖のときには、飽和または不飽和であり、多
くの場合に炭素原子２〜18、特に６〜12である。
くの場合に炭素原子２〜18、特に６〜12である。
この鎖は置換基、特にアリール基、アルキルエーテルお
よび／またはハロゲンを有することができる。
よび／またはハロゲンを有することができる。
Ｒが環状基の場合、シクロアルカン、シクロアルケンお
よび／または一つまたは二つの環を有するアリールであ
り、とりわけＣ５〜Ｃ12、特にアルキルフエニル、ジフ
エニルおよび置換基を有するかかる総ての環である。
よび／または一つまたは二つの環を有するアリールであ
り、とりわけＣ５〜Ｃ12、特にアルキルフエニル、ジフ
エニルおよび置換基を有するかかる総ての環である。
本発明を実施するにあたって好ましいＸは、カルボキシ
ル基COOHであり、十分に温和かつ特に効果的な条件下で
担体および酵素と架橋(bidge)反応が可能である。
ル基COOHであり、十分に温和かつ特に効果的な条件下で
担体および酵素と架橋(bidge)反応が可能である。
非限定的な例としては、種々のビス（カルボキシアルキ
ル基のジチオエステル）またはカルボキシアルキルテト
ラチオアルカンジチオエートを下記に示す。
ル基のジチオエステル）またはカルボキシアルキルテト
ラチオアルカンジチオエートを下記に示す。
I II III IV V VI VII VIII IX X XI 化合物IXにおいて、Ｒ″は無くても良いし、またはハロ
ゲン、ニトロ、アルキル、アルコキシ等の置換基とする
こともできる。また、複数のＲ″置換基であっても良
い。
ゲン、ニトロ、アルキル、アルコキシ等の置換基とする
こともできる。また、複数のＲ″置換基であっても良
い。
酵素の固定に使用される他のジチオエステルの中では、
下記代表的な式を挙げることができる。
下記代表的な式を挙げることができる。
XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX これら種々の化合物は、Levesson(Act.Chem.Scand.part
B,29.539.1975)、Marvel et coll.(J.Am.Chem.Soc.77.
5997.1955)および／またはGressierおよびLevesque(Eur
op.Polymer.16.1093.1980)のような既知の方法によって
製造することができる。
B,29.539.1975)、Marvel et coll.(J.Am.Chem.Soc.77.
5997.1955)および／またはGressierおよびLevesque(Eur
op.Polymer.16.1093.1980)のような既知の方法によって
製造することができる。
上記から明らかなように、本発明によれば、より長い、
またはより短い長さの鎖を形成するジチオエステルの固
定剤を選択することができる。従って、極めて長い“架
橋”を選べば、与えられた担体上に固定された酵素の作
用における立体障害を低下または完全に抑制することが
できる。
またはより短い長さの鎖を形成するジチオエステルの固
定剤を選択することができる。従って、極めて長い“架
橋”を選べば、与えられた担体上に固定された酵素の作
用における立体障害を低下または完全に抑制することが
できる。
また期待される用途に応じて固定剤の性質を変化させる
ことができ、これは基Ｒ，Ｒ′，Ｒ″，ＲおよびＸを
適宜選択することによって達成される。
ことができ、これは基Ｒ，Ｒ′，Ｒ″，ＲおよびＸを
適宜選択することによって達成される。
たとえば、Ｒが芳香環の場合には支持架橋に硬さが与え
られ、脂肪族鎖では柔軟性が与えられ、−(CH2CH2O)nの
ようなアルコキシ基等では多少なりとも明白な親水性が
与えられ、一方、長いCH2鎖またはジフエニルのような
アリールは親油性を与える傾向がある。
られ、脂肪族鎖では柔軟性が与えられ、−(CH2CH2O)nの
ようなアルコキシ基等では多少なりとも明白な親水性が
与えられ、一方、長いCH2鎖またはジフエニルのような
アリールは親油性を与える傾向がある。
従ってジチオエステルの親核活性を与えられた酵素の脆
弱性に適用して変化させることができる。
弱性に適用して変化させることができる。
本発明による新規な中間剤は、まず担体または酵素と、
酵素の性質を変化させずに結合される。
酵素の性質を変化させずに結合される。
使用される担体は、本質的に全て一つの方法で、または
他の方法で、またはこれら両方の方法でNH2基を固定可
能であり、ジチオ剤と反応可能なNH2基を含む組成を有
している。
他の方法で、またはこれら両方の方法でNH2基を固定可
能であり、ジチオ剤と反応可能なNH2基を含む組成を有
している。
すなわち使用される担体は、たとえば、シリカ、ゼオラ
イト中の種々のシリケート、ガラス、アルミノシリケー
ト、ベントナイト、および活性アルミナ、アミンにより
適切な方法で処理された炭素である。
イト中の種々のシリケート、ガラス、アルミノシリケー
ト、ベントナイト、および活性アルミナ、アミンにより
適切な方法で処理された炭素である。
同様にセルロースおよび他の誘導体も好適であり、特に
アミン化されたセルロース、チトサン(Chitosane)およ
び十分に硬く本発明による薬剤のＸ基と反応可能なNHま
たはNH2基を有する全てのタンパク質が挙げられる。
アミン化されたセルロース、チトサン(Chitosane)およ
び十分に硬く本発明による薬剤のＸ基と反応可能なNHま
たはNH2基を有する全てのタンパク質が挙げられる。
この後者の種類としては、たとえばカゼイン、ラクトグ
ロブリン、オバルブミン、もしも必要ならば加熱または
化学的作用によって硬化された血清アルブミン等の物質
の中から適切な担体を選択することが可能である。
ロブリン、オバルブミン、もしも必要ならば加熱または
化学的作用によって硬化された血清アルブミン等の物質
の中から適切な担体を選択することが可能である。
極めて興味のある担体の他の種類としては、詳細にはポ
リアミノポリスチレン、ポリアクリルアミド、アミン化
されたポリアクリレート、アミンまたはアンモニアの作
用下に（フランス特許第2,442,244号）エポキシ環の開
環によってアミン化されたグリシジルポリメタクリレー
ト（またはポリアクリレート）のように遊離のNH2基ま
たは部分的に結合したNH基を有する合成ポリマーであ
る。
リアミノポリスチレン、ポリアクリルアミド、アミン化
されたポリアクリレート、アミンまたはアンモニアの作
用下に（フランス特許第2,442,244号）エポキシ環の開
環によってアミン化されたグリシジルポリメタクリレー
ト（またはポリアクリレート）のように遊離のNH2基ま
たは部分的に結合したNH基を有する合成ポリマーであ
る。
上述した全ての基に対して一般的方法で適用される本発
明の方法に好適な酵素および助酵素としては、ヒドロラ
ーゼ、特にプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびエス
テラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、異性化酵
素、および重合等を含む酵素である。
明の方法に好適な酵素および助酵素としては、ヒドロラ
ーゼ、特にプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびエス
テラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、異性化酵
素、および重合等を含む酵素である。
従って本発明によるジチオエステルの助けをかりて、ア
ミラーゼ、アルギナーゼ、ジペプチダーゼ、エノラー
ゼ、アルドラーゼ、アデノミン、デアミナーゼ、リパー
ゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ヌクレアーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、リゾツイム、トリプシン、チモトリプ
シン、レンニン、インバーターゼ、マルターゼ、ペクチ
ナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコー
スデヒドロゲナーゼ等を固定することができる。
ミラーゼ、アルギナーゼ、ジペプチダーゼ、エノラー
ゼ、アルドラーゼ、アデノミン、デアミナーゼ、リパー
ゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ヌクレアーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、リゾツイム、トリプシン、チモトリプ
シン、レンニン、インバーターゼ、マルターゼ、ペクチ
ナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ、ホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコー
スデヒドロゲナーゼ等を固定することができる。
本発明による酵素の固定は、低温で、とりわけ０〜30℃
で、特に０〜10℃で、希望する酵素を、ジチオエステル
によって活性化された担体と酵素に好適なpH緩衝液中で
単に接触させることによって行なわれる。
で、特に０〜10℃で、希望する酵素を、ジチオエステル
によって活性化された担体と酵素に好適なpH緩衝液中で
単に接触させることによって行なわれる。
担体の事前の活性化は、ジチオエステルのための溶媒の
ジチオエステル溶液中に担体を保持することによって一
般的に行なわれる。
ジチオエステル溶液中に担体を保持することによって一
般的に行なわれる。
担体のNH2基に対するジチオエステル親和力に依って、
この操作は冷時に、または加温時に、一般的には０〜10
0℃で、とりわけ室温下で、または10〜35℃で行なわれ
る。
この操作は冷時に、または加温時に、一般的には０〜10
0℃で、とりわけ室温下で、または10〜35℃で行なわれ
る。
担体が本来的に−NH2または−NH−を含まない場合に
は、担体は活性化前にアミンで処理される。
は、担体は活性化前にアミンで処理される。
この場合には、シリカおよびシリケートの例のように、
固体担体は二つの連続的処理にかけられる。
固体担体は二つの連続的処理にかけられる。
まずアミン化であり、アミン化反応物は分離の後に乾燥
される。次いでアミン化担体はジチオエステルの一般的
には有機溶媒溶液と接触される。
される。次いでアミン化担体はジチオエステルの一般的
には有機溶媒溶液と接触される。
酵素の予備的活性化としては、タンパク質の外部表面上
に存在するリジン残基の“軟化”修正(soft modificati
on)が主として含まれる。
に存在するリジン残基の“軟化”修正(soft modificati
on)が主として含まれる。
一般にビスジチオエステルの酸素へのグラフトは、中性
またはほぼ中性のpHの緩衝媒体中で行なわれる。しかし
ながら、酵素が弱塩基pHに不利益なく耐える場合には、
かかる媒体中で操作することも興味がある。この場合に
はＯＨイオンによる触媒によってグラフト化が促進され
る。
またはほぼ中性のpHの緩衝媒体中で行なわれる。しかし
ながら、酵素が弱塩基pHに不利益なく耐える場合には、
かかる媒体中で操作することも興味がある。この場合に
はＯＨイオンによる触媒によってグラフト化が促進され
る。
すなわち本発明の好ましい態様の一つは、pH７〜９、好
ましくはpH８〜９の緩衝液中の操作を含む。
ましくはpH８〜９の緩衝液中の操作を含む。
ビスジチオエステルの介在によって担体上への酵素の固
定の後には、通常ではある割合のジチオ基が未反応で残
っている。従って、これを失活させることが好ましい。
このために、本発明によれば、これら未反応基をH2N-R-
Y型の小分子と反応させることが好ましい。
定の後には、通常ではある割合のジチオ基が未反応で残
っている。従って、これを失活させることが好ましい。
このために、本発明によれば、これら未反応基をH2N-R-
Y型の小分子と反応させることが好ましい。
ここでＲは低分子量の脂肪族またはアリール炭化水素
基、好ましくはＣ２〜Ｃ８であり、Ｙは酵素の周囲事情
によって決定される性質によって選択される官能基であ
る。
基、好ましくはＣ２〜Ｃ８であり、Ｙは酵素の周囲事情
によって決定される性質によって選択される官能基であ
る。
たとえばＹは−COOH，−CH2OH，−CH3または酵素の活性
に無毒な他の基である。
に無毒な他の基である。
本発明の方法の操作の一つの様式は、アミン化されたポ
リマーと接触する前に、酵素によって保持されたアミン
化された官能基をビスジチオエステルによって活性化す
ることである。
リマーと接触する前に、酵素によって保持されたアミン
化された官能基をビスジチオエステルによって活性化す
ることである。
この場合には、この活性化に必要かつ十分な薬剤の量
は、ビスジチオエステルの過剰を避けるため、まず最大
の注意がはらわれる。この操作方法は、ある種の可溶性
アミン化担体の場合に有利であり、担体の直接活性化の
間に起こる交叉結合を避けることができる。
は、ビスジチオエステルの過剰を避けるため、まず最大
の注意がはらわれる。この操作方法は、ある種の可溶性
アミン化担体の場合に有利であり、担体の直接活性化の
間に起こる交叉結合を避けることができる。
本発明による固定化方法の詳細な、そして好ましい例
は、精製された多孔質シリカゲルを適切な溶媒中でのシ
ラン溶液で処理することである。シランは、アルキルシ
ラン、アルキルハロシランであり、好ましくはアルキル
アミノシランである。
は、精製された多孔質シリカゲルを適切な溶媒中でのシ
ラン溶液で処理することである。シランは、アルキルシ
ラン、アルキルハロシランであり、好ましくはアルキル
アミノシランである。
アミノシランが用いられない場合には、生成物はアミン
またはアンモニアで処理され、次いで固体を分離し、洗
浄し、乾燥する。
またはアンモニアで処理され、次いで固体を分離し、洗
浄し、乾燥する。
このように予め活性化されたシリカは、本発明によるジ
チオエステルの有機溶媒溶液中に懸濁される。
チオエステルの有機溶媒溶液中に懸濁される。
溶媒はたとえばアルコール、ケトン等、または溶媒混合
物である。
物である。
一般には乾燥担体のグラム当り0.1〜10-6、特に10-2〜1
0-5モルのジチオエステルが用いられる。
0-5モルのジチオエステルが用いられる。
この量は、担体のNH2基含有量によって決定され、原則
として存在するNH2基当り１モルのジチオエステルが使
用される。
として存在するNH2基当り１モルのジチオエステルが使
用される。
要求された時間の後に、一般的には６〜60分の後に、担
体が溶媒から分離され、溶媒で、次いで蒸留水で洗浄さ
れ、次いで固定されるべき酵素のために好適なpH緩衝溶
液中に懸濁される。この懸濁液は使用に先立って長期
間、貯蔵することができる。
体が溶媒から分離され、溶媒で、次いで蒸留水で洗浄さ
れ、次いで固定されるべき酵素のために好適なpH緩衝溶
液中に懸濁される。この懸濁液は使用に先立って長期
間、貯蔵することができる。
固定を効果的にするために、pH緩衝液中の担体懸濁液中
に望ましい酵素が導入される。
に望ましい酵素が導入される。
一般的には４〜40時間、最も頻度多くは10〜30時間、上
記した温度、好ましくは４〜８℃で放置される。
記した温度、好ましくは４〜８℃で放置される。
次いで、濾過または遠心分離によって担体が分離され、
電解質水溶液で、次いで適切なpH緩衝液で洗浄される。
電解質水溶液で、次いで適切なpH緩衝液で洗浄される。
このものは直ちに使用することができるが、しかし選択
された緩衝液中で貯蔵することもできる。
された緩衝液中で貯蔵することもできる。
上記したビスジチオエステルは、プラスチックまたはペ
ースト状支持体上に酵素を固定するのに好適であるの
で、上述したようなビスジチオエステルの幾つかの例は
酵素系膜またはキャプター(captor)の製造に、また好適
である。かかるビスジチオエステルの使用によって、た
とえばタンパク質ゲル、セルロースまたはアミン化セル
ロースエステルまたはNH2またはNH基を有するアクリ
ル、スチレンまたはビニルポリマーを、酵素と本発明に
よるビスジチオエステルによって共交叉結合させること
により膜が得られる。
ースト状支持体上に酵素を固定するのに好適であるの
で、上述したようなビスジチオエステルの幾つかの例は
酵素系膜またはキャプター(captor)の製造に、また好適
である。かかるビスジチオエステルの使用によって、た
とえばタンパク質ゲル、セルロースまたはアミン化セル
ロースエステルまたはNH2またはNH基を有するアクリ
ル、スチレンまたはビニルポリマーを、酵素と本発明に
よるビスジチオエステルによって共交叉結合させること
により膜が得られる。
本発明を下記に示す非限定的実施例によって説明する。
実施例１ シリカ担体上へのグルコースオキシダーゼの固定 ＸＯＢ 30Ｄの名称で市販され、平均孔径650Å、およ
び比表面積50m2/gを有するシリカ100ｇを、まず1/1スル
ホン酸−硝酸(sulpho-nitricmixture)混合物を処理し、
次いで蒸留水で十分に洗浄した。次いでシリカを乾燥し
て全ての微量の水を除去し、ついでトリメトキシプロピ
ルアミノ−シラン(CH3O)3SiCH2CH2CH2NH2 15ｇを含むト
リエン溶液300mlで室温下、６時間処理した。
び比表面積50m2/gを有するシリカ100ｇを、まず1/1スル
ホン酸−硝酸(sulpho-nitricmixture)混合物を処理し、
次いで蒸留水で十分に洗浄した。次いでシリカを乾燥し
て全ての微量の水を除去し、ついでトリメトキシプロピ
ルアミノ−シラン(CH3O)3SiCH2CH2CH2NH2 15ｇを含むト
リエン溶液300mlで室温下、６時間処理した。
このようにシラン化され、アミン化されたシリカを溶液
から分離し、次いで十分な量のトルエンで、更にヘキサ
ンで洗浄して過剰のシランを除去した。次いで乾燥し
た。
から分離し、次いで十分な量のトルエンで、更にヘキサ
ンで洗浄して過剰のシランを除去した。次いで乾燥し
た。
この乾燥したアミン化シランの５ｇを、次いで下記の式
カルボキシメチルテトラチオオクタンジオエートの0.17
7ｇまたは0.0005モルのエタノール溶液（10-2モル／
）の50mlに懸濁させた。
カルボキシメチルテトラチオオクタンジオエートの0.17
7ｇまたは0.0005モルのエタノール溶液（10-2モル／
）の50mlに懸濁させた。
この懸濁液を時々攪拌しながら、室温下に48時間、放置
した。
した。
次いで溶液からシリカを分離し、エタノールで、次いで
蒸留水で洗浄し、pH７のリン酸塩緩衝溶液中に導入し、
貯蔵した。
蒸留水で洗浄し、pH７のリン酸塩緩衝溶液中に導入し、
貯蔵した。
このように貯蔵したシリカの１ｇに、緩衝液10mlと共
に、名称II（シグマ）として知られているタイプのグル
コースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の0.020ｇを加えた。５
〜６℃の温度が好ましい。
に、名称II（シグマ）として知られているタイプのグル
コースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の0.020ｇを加えた。５
〜６℃の温度が好ましい。
接触時間24時間の後に、シリカゲルを濾過によって分離
し、NaClの１Ｍ溶液の20mlで、次いで蒸留水20〜40mlで
洗浄し、最終的にその中でグラフト化が行なわれた緩衝
液で洗浄した。
し、NaClの１Ｍ溶液の20mlで、次いで蒸留水20〜40mlで
洗浄し、最終的にその中でグラフト化が行なわれた緩衝
液で洗浄した。
NaCl溶液（または他の例で用いたモル尿素溶液）の洗浄
は、吸着によってのみ保持されたＧＯＤ酵素分を除去す
る目的を有する。
は、吸着によってのみ保持されたＧＯＤ酵素分を除去す
る目的を有する。
ＧＯＤの活性を測定し、ＧＯＤの固定を確認するため
に、処理されたシリカをグリコースの１ｇ／溶液と接
触させ、その活性を分光光度法により決定した。
に、処理されたシリカをグリコースの１ｇ／溶液と接
触させ、その活性を分光光度法により決定した。
実施例２ 実施例１によって固定されたグルコースオキシターゼの
酵素活性の決定 はじめに、遊離状態におけるグラフト化に用いた酵素の
同一量の活性を緩衝溶液中で決定した。この遊離ＧＯＤ
の活性は、34〜35℃の温度、大気中で酵素とグルコース
溶液を単に接触させ、ゆるやかに攪拌して決定した。
酵素活性の決定 はじめに、遊離状態におけるグラフト化に用いた酵素の
同一量の活性を緩衝溶液中で決定した。この遊離ＧＯＤ
の活性は、34〜35℃の温度、大気中で酵素とグルコース
溶液を単に接触させ、ゆるやかに攪拌して決定した。
シリカ上にグラフトされたＧＯＤの活性は、同様な操作
条件下で決定された。
条件下で決定された。
遊離ＧＯＤ グラフト化ＧＯＤ 20mgＧＯＤ グラフト化シリア１ｇおよび 10ml緩衝液 ＧＯＤ20mg,10ml xmlグルコース溶液 緩衝液，xmlグルコース溶液。
一方および他方の活性をヘキソキナーゼ(hexokinase)法
を用い分光光度量によってモニターした。
を用い分光光度量によってモニターした。
固定されたＧＯＤの活性は、同一条件下で測定された遊
離ＧＯＤのそれと実質的に同一であった。
離ＧＯＤのそれと実質的に同一であった。
実施例３ 時間の関数としての固定された酵素の活性 カルボキシメチルテトラチオドデカンジオエートで活性
化され、pH７緩衝液10ml中で20mgのＧＯＤがグラフトさ
れたシリカ1.00ｇ上に固定されたグルコースオキシダー
ゼの同一サンプルから出発して、酵素活性を数カ月間測
定した。
化され、pH７緩衝液10ml中で20mgのＧＯＤがグラフトさ
れたシリカ1.00ｇ上に固定されたグルコースオキシダー
ゼの同一サンプルから出発して、酵素活性を数カ月間測
定した。
時間ゼロにおいて、β-D-グルコースの５ｇ／溶液を
添加した。１分後に、懸濁液中に存在するグリコースの
量を測定して、この期間中に変換された基質の比率を推
論した。貯蔵６か月後も活性は変化しなかった。
添加した。１分後に、懸濁液中に存在するグリコースの
量を測定して、この期間中に変換された基質の比率を推
論した。貯蔵６か月後も活性は変化しなかった。
実施例４ 酵素の予備的活性化 下記したビスジチオエステルの溶液の量を10-2Ｍに増加
させて、グルコースオキシダーゼの溶液に実施例１に述
べたようなリン酸塩緩衝液と共に加えた。
させて、グルコースオキシダーゼの溶液に実施例１に述
べたようなリン酸塩緩衝液と共に加えた。
(a) (b) いづれの場合も、ジオチオエステル分の消失の後に310n
mで分光光度法により測定して、グルコースオキシダー
ゼにおけるNH2が反応しやすい基との間で反応が起った
ことを確認した。
mで分光光度法により測定して、グルコースオキシダー
ゼにおけるNH2が反応しやすい基との間で反応が起った
ことを確認した。
二つの化合物(a)および(b)の反応性の差を測定した。溶
液中に存在する活性タンパク質の分子に関連して、化合
物(a)によって活性化されたアミン官能基の数は５であ
り、化合物(b)によっては3.8と推定された。グルコース
オキシダーゼの溶液とビスジチオエステル(a)の間の接
触を48時間にして、基質の添加後の酸素の活性を測定し
たところ、同一条件下でビスジチオエステルの非存在下
で貯蔵された制御された溶液について観察された活性に
低下は認められなかった。
液中に存在する活性タンパク質の分子に関連して、化合
物(a)によって活性化されたアミン官能基の数は５であ
り、化合物(b)によっては3.8と推定された。グルコース
オキシダーゼの溶液とビスジチオエステル(a)の間の接
触を48時間にして、基質の添加後の酸素の活性を測定し
たところ、同一条件下でビスジチオエステルの非存在下
で貯蔵された制御された溶液について観察された活性に
低下は認められなかった。
この実施例は、酵素またはアミン化された担体が第１に
活性化され、最適収率を得るために夫々のタイプの酵素
に最適の媒体が選択されることを示している。
活性化され、最適収率を得るために夫々のタイプの酵素
に最適の媒体が選択されることを示している。
実施例５ アルコールデヒドロゲナーゼの固定 実施例１で述べた方法に従ってアミン化され、カルボキ
シメチルテトラチオオクタンジオエートで活性化された
シリカ10ｇを、約70IU/mgの活性を有する酵母からのア
ルコールデヒドロゲナーゼの100mgを含む、50mMのpH７
リン酸塩緩衝溶液の100mlに48時間懸濁状態に保った。
シメチルテトラチオオクタンジオエートで活性化された
シリカ10ｇを、約70IU/mgの活性を有する酵母からのア
ルコールデヒドロゲナーゼの100mgを含む、50mMのpH７
リン酸塩緩衝溶液の100mlに48時間懸濁状態に保った。
次いで製造物の活性を増大させるために、大過剰の酵素
を導入し、活性担体の分離の後に溶液中に過剰の酵素を
他の固定に循環した。
を導入し、活性担体の分離の後に溶液中に過剰の酵素を
他の固定に循環した。
４℃で48時間接触の後に、シリカを分離し、リン酸塩緩
衝液、蒸留水、１Ｍ NaClで連続的に洗浄し、次いで再
びリン酸塩緩衝液中に懸濁させた。
衝液、蒸留水、１Ｍ NaClで連続的に洗浄し、次いで再
びリン酸塩緩衝液中に懸濁させた。
次いで、アルコールデヒドロゲナーゼにグラフトされた
シリカの懸濁液をグリシンの0.1ＭpH7.5溶液に加え、酵
素と反応せずにシリカ上に存在するジチオエステル基を
失活させた。
シリカの懸濁液をグリシンの0.1ＭpH7.5溶液に加え、酵
素と反応せずにシリカ上に存在するジチオエステル基を
失活させた。
次いで固定酵素製造物を再びpH７のリン酸塩緩衝液で洗
浄した。
浄した。
この製造物はシリカのグラム当り11.3IUの比活性を有
し、pH７のリン酸塩緩衝液中に４℃で固定された酵素の
貯蔵中に得られた下記結果に示すように、この活性は著
るしく安定である。
し、pH７のリン酸塩緩衝液中に４℃で固定された酵素の
貯蔵中に得られた下記結果に示すように、この活性は著
るしく安定である。
製造物貯蔵期間 比活性 （日） IU/gシリカ １日 11.6 ５日 10.9 10日 11.4
Claims (11)
- 【請求項１】酵素および担体の両方と結合可能な薬剤に
よって酵素を担体に固定する方法において、前記薬剤が
ビスジチオエステルであり、その分子は両末端にアミン
官能基と反応しうる親核基を有することを特徴とする酵
素を担体に固定する方法。 - 【請求項２】ビスジチオエステルが下記の形状を有し、 ここでＲおよびＲ′は脂肪族、脂環族またはアリール炭
化水素基であって置換基を有することができ、Ｘはアミ
ン官能基と反応しうる活性基または原子である特許請求
の範囲第１項記載の酵素を担体に固定する方法。 - 【請求項３】ＲがＣ２〜Ｃ20の脂肪族鎖であり、酸素原
子を含むことができる特許請求の範囲第２項記載の酵素
を担体に固定する方法。 - 【請求項４】Ｒがアリールまたはアルカリールであり、
環が一つ以上のハロゲン、ニトロ、ヒドロキシルまたは
アルキル置換基を有することができる特許請求の範囲第
２項記載の酵素を担体に固定する方法。 - 【請求項５】Ｒがシクロヘキシルまたはシクロペンチル
であり、一つ以上のアルキル、ハロゲン、ニトロまたは
ヒドロキシル置換基を有することができる特許請求の範
囲第２項記載の酵素を担体に固定する方法。 - 【請求項６】Ｒ′が−(CH2)n−鎖でｎは好ましくは２〜
18であり、アルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはハロ
ゲン置換基を有することができる特許請求の範囲第２
項、第３項、第４項または第５項記載の酵素を担体に固
定する方法。 - 【請求項７】Ｒ′がアリール、オキシアリールまたはア
ルカリールであり、環がハロゲン、アルキル、ニトロ、
スルホ、ヒドロキシ、オキシまたはチオール置換基を有
することができる特許請求の範囲第２項、第３項、第４
項または第５項記載の酵素を担体に固定する方法。 - 【請求項８】Ｘがカルボキシルである特許請求の範囲第
２項、第３項、第４項、第５項、第６項または第７項記
載の酵素を担体に固定する方法。 - 【請求項９】Ｘが一つ以上のハロゲン、ヒドロキシル、
スルホニル、スルフイニル、ホスホリルまたはリンの他
の酸素含有基、ジアルキルアミノまたはメルカプトによ
って構成される特許請求の範囲第２項、第３項、第４
項、第５項、第６項または第７項記載の酵素を担体に固
定する方法。 - 【請求項１０】固定された酵素を反応剤に、または酵素
膜に使用するためにヒドロラーゼ、オキシドレダクター
ゼ、トランスフエラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよ
び／またはリガーゼが、アミノ基を有する無機または有
機固体、プラスチックまたはペースト状担体上に固定さ
れる特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、
第５項、第６項、第７項、第８項または第９項記載の酵
素を担体に固定する方法。 - 【請求項１１】酵素がビスジチオエステルによって予め
活性化される特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、
第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項また
は第10項記載の酵素を担体に固定する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8505939 | 1985-04-19 | ||
| FR8505939A FR2580666B1 (fr) | 1985-04-19 | 1985-04-19 | Perfectionnement a l'immobilisation d'enzymes |
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|---|---|
| JPS61254190A JPS61254190A (ja) | 1986-11-11 |
| JPH0632616B2 true JPH0632616B2 (ja) | 1994-05-02 |
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ID=9318416
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPH0632616B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1272149A (ja) |
| DE (2) | DE199644T1 (ja) |
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| FR (1) | FR2580666B1 (ja) |
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| DE3881774T2 (de) * | 1987-06-30 | 1993-11-18 | Elf Aquitaine | Verfahren zur chemischen Modifizierung von Protiden und so modifizierte Produkte. |
| US5010006A (en) * | 1988-08-11 | 1991-04-23 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The National Research Council Of Canada | Lipase immdoilized by cross-linking with inert protein for glyceride synthesis |
| JP2003012699A (ja) * | 2001-07-04 | 2003-01-15 | Japan Science & Technology Corp | 抗麻酔性貝毒抗体の製法、新規抗体、該抗体を用いるｅｌｉｓａ測定キット、該製法による系標識毒標品 |
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| US7674753B2 (en) | 2003-09-17 | 2010-03-09 | Halliburton Energy Services, Inc. | Treatment fluids and methods of forming degradable filter cakes comprising aliphatic polyester and their use in subterranean formations |
| US7833944B2 (en) | 2003-09-17 | 2010-11-16 | Halliburton Energy Services, Inc. | Methods and compositions using crosslinked aliphatic polyesters in well bore applications |
| US7829507B2 (en) | 2003-09-17 | 2010-11-09 | Halliburton Energy Services Inc. | Subterranean treatment fluids comprising a degradable bridging agent and methods of treating subterranean formations |
| US7195068B2 (en) | 2003-12-15 | 2007-03-27 | Halliburton Energy Services, Inc. | Filter cake degradation compositions and methods of use in subterranean operations |
| US7621334B2 (en) | 2005-04-29 | 2009-11-24 | Halliburton Energy Services, Inc. | Acidic treatment fluids comprising scleroglucan and/or diutan and associated methods |
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