JPS58873B2 - 酵素↓−担体複合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安定で活性な酵素−担体複合物並びにその製
造法を目的とする。

酵素と反応性の基を持つ担体上で酵素を不動化させるこ
とが既に提案された。

これは、例えば、必要な反応性基をもたらすように各種
の技術、例えば各種の化合物の吸着、重合体の被覆、シ
ラン化合物のグラフト化（付加）などによって変性され
たセルロース、多糖類又は無機の固体である。

しかし、セルロースや多糖類は機械的特性を持っていな
い。

それらは水や有機溶媒中で膨潤し、しかも耐温度及び圧
力性を何ら有しない。

他方、担体上に吸着され又は付着された化合物は、その
後の使用の過程で除去される恐れがある。

シランについては、これは高価な特別の製品であって、
必らずしも満足ではない。

これに対して、本発明の酵素−担体複合物は、特に安定
である。

それは、極めて良好な機械的性質を持っているグラフト
された無機担体を基にしており、溶媒、温度及び圧力に
敏感ではなく、しかもそのグラフトが通常の有機化合物
であるものを基材としている。

安定であって酵素的に活性なこの酵素−担体複合物は、
グラフトされた無機担体に共有結合によって固定された
酵素から成り、その酵素が、少なくとも１個のエステル
結合によって担体にグラフトされた有機基の少なくとも
１個の反応性官能基に結合していることを特徴としてい
る。

有機基は、特に、直鎖若しくは分枝鎖状脂肪族残基（そ
の炭素数１〜８の脂肪族鎖は１個の窒素原子及び（又は
）１個の硫黄原子及び（又は）１個のフェニル基を含有
できろ）、シクロ脂肪族残基、アリール又はアルキルア
リール残基（その核又は鎖は１個又はそれ以上の窒素原
子を含有できる）により表わされろ。

酵素と反応性の官能基としては、特に、アミン、ハロゲ
ン、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシル官能基
をあげることができる。

本発明に従う複合物は、ヒドロキシル基を持つ不溶性無
機担体を少なくとも１個のアルコール又はフェノール官
能基及び少なくとも１個の反応性官能基を持つ有機基で
形成される化合物と反応させ、次いでこれに酵素を結合
させることによって製造される。

用いられる無機担体は、水に実質上不溶であり、そして
その表面にヒドロキシル基を持っていなければならない
。

それらは、表面が多孔質又は非多孔質の塊状体、小片、
救状体、ビード、粉末、繊維、織物として提供される。

担体の選択は複合物の用途に依存する。

例えば、酵素−担体複合物が連続式に機能するカラムに
用いられる場合には、微粒状担体は５μｍ〜５ｍｍの間
の粒度を有することが有益である。

担体の多孔性に関しては、それは複合物の酵素活性に依
存する。

また、その活性は、利用できる内部表面積が大きいほど
大きい。

無機担体は、特に、レンガ；けい酸アルカリ及びアルミ
ノけい酸アルカリ；アルミナ及び二酸化チタンのような
金属酸化物；シリカで表わされる。

有機化合物は、酵素と反応性の官能基がアミン、ハロゲ
ン、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシルであり
且つその−ＯＨ官能基が下記の残基に結合しているアル
コール又はフェノールである。

（１）直鎖又は分枝鎖状脂肪族残基（その炭素原子数１
〜８の鎖は１個の窒素原子及び（又は）１個の硫黄原子
及び（又は）１個のフェニル基を含有していてもよい）
。

これらの化合物としては、モノエタノールアミン、アミ
ノプロパツール、アミノメチル−プロパツール、フェニ
ルアミノプロパツール、アミノブタノール、アミノペン
タノール、アミノメチル−へブタノール、アミノエチル
−エタノールアミン、メチオニノール、アミノメチル−
プロパンジオール、トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン、ヒドロキシメチルアニリン、トリプトファノールの
ようなアミノアルコール；クロルエタノール、クロルプ
ロパツール、クロルメチルプロパ／−ル、クロルブタノ
ール、クロルヘキサノール、クロルプロパンジオール、
クロルベンジルアルコール、ブロムエタノール、ブロム
プロパツール、ブロムプロパンジオール、ブロムベンジ
ルアルコール、ブロムベンズヒドロール、ヨードエタノ
ールなどのようなハロゲノアルコール：メルカプトエタ
ノール、チオグリセリン、ジチオエリトリットのような
メルカプト−アルコール；グリセルアルデヒドのような
アルデヒド−アルコール；ヒドロキシプロピオン酸、ヒ
ドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン
酸、ヒドロキシオクタン酸、ヒドロキシメチル安息香酸
のような酸−アルコールをあげることができる。

（ｉｉ）シクロ脂肪族残基、例えばアミノンクロヘキサ
ノール。

（ｉｉｉ）アリール又はアルキルアリール残基（その核
及び（又は）鎖は１個又はそれ以上の窒素原子を含有し
ていてもよい）。

これらは、例えば、アミノフェノール、アミンクレゾー
ル、アミノ−ヒドロキシピリジン、アミノ−ヒドロキシ
ピリジン、アミノ−ジヒドロキシピリジン、アミノ−ヒ
ドロキシ−メチルピリミジンのようなアミンフェノール
類；クロルフェノール、クロルクレゾール、クロルジメ
チルフェノール、フロムフェノール、ブロムナフトール
、ヨードフェノールのようなハロゲノフェノール類；メ
ルカプト−フェノール類；ヒドロキシベンズアルデヒド
、ジヒドロキシベンズアルデヒド、ジヒドロキシメトキ
シベンズアルデヒド、ヒドロキシナフトアルデヒドのよ
うなアルデヒド−フェノール類；ヒドロキシ安息香酸、
フロレチン酸、ヒドロキシマンデル酸、ヒドロキシナフ
トエ酸のような酸−フエノール類である。

無機担体と少なくとも１個のアルコール又はフェノール
官能基及び少なくとも１個の酵素と反応性の官能基を持
つ有機化合物との、エステル結合を与えるための反応は
、存在させる物質の反応性に従って、周囲温度から媒質
の沸騰温度までの間の温度で行なわれる。

生成する水は不都合なく媒質中に残留させてもよいし又
は除去することもできる。

反応が非常に速くて水の除去を伴なう場合には好ましく
は沸点で行なうが、これが反応時間を調節せしめる。

有機化合物が液体である場合には、担体の分散体を得る
ためには過剰量の有機化合物、即ち、担体１００ｇにつ
き４０ｍ１よりも多い量の有機化合物を用いることが必
要である。

有機化合物が固体又は同じく液体である場合においては
、有機化合物に対する溶媒の存在下で反応を実施するこ
とができる。

この溶媒は、担体及び有機化合物に対して化学的に不活
性であるべきであり、そして場合によっては、沸点にお
いて反応の過程で生成する水と共沸物を与えるべきであ
る。

例としてはジメチルホルムアミド、キシレン、ジオキサ
ンなどをあげることができる。

有機化合物の量は、担体のヒドロキシル基１個に対して
１個のアルコール又はフェノール官能基に相当するよう
な最少量であり、そして溶媒の量は無機担体を湿らすの
に十分であるべきである。

溶媒の存在下又は不在下で行なわれようとも、反応後、
グラフトされた担体は媒質から分離され、有機化合物の
溶媒によって洗い、そして場合によって保存しようとす
るときは乾燥される。

担体上であらゆる種類の酵素を不動化させることができ
る。

特に、グルコースオキシターセ、ｄ−アミノ酸オギシク
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ベルオキシターゼ、カタ
ラーゼなどのような酸化還元酵素；アスパラギン酸アミ
ントランスフェラーゼ、アスパラギン酸アセチルトラン
スフェラーゼ、ヘキソキナーゼのような転移酵素；リパ
ーゼ、ホスホリパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、
ペクチナーゼ、ホフファターゼ、アミツール、マルター
ゼ、セルラーゼ、インベルターゼ、アシラーゼ、ペプシ
ン、パパイン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、
アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、アルギナーゼ、リボヌ
クレアーゼ、ラクターゼ、ブロメリン、ペニシリンアミ
ターゼなどのような加水分解酵素；アスパルターゼ、フ
マラーゼなどのようなリアーゼ；グルコースイソメラー
ゼ、乳酸ラセマーゼなどのようなインメラーゼ；アスパ
ラギンシンセクーゼ、グルタミンシンセターゼ、ピルビ
ン酸カルボキシラーセのようなリガーセがあげられる。

酵素は、グラフトの反応性官能基に応じて、直接に又は
全く知られた方法によってグラフトを活性化した後に反
応させることができる。

例えば、アミノグラフトはジアゾ化によって、或いはポ
リアルデヒド又はカルボジイミドとの反応によって活性
化させることができる。

スルフヒドリルグラフトは２，２′−ジチオジピリジン
との反応によって活性化することができる。

カルボキシルグラフトは、カルボジイミドとの反応によ
って活性化することができる。

これらの活性化は、一般に、グラフトされた担体を、活
性化すべき基に関して過剰量の反応体の水溶液中に、反
応と両立できるｐＨ及び温度で分散させ、次いで担体を
分離し、乾燥することによって実施される。

酵素の固定は、全く知られた方法によって、即ち、フラ
ンス国特許第２，２７８，７０２号の方法に従って酵素
と最も適合できるｐＨに緩衝された水溶液中で冷却して
、或いは脂肪族、シクロ脂肪族又は芳香族炭化水素中で
加熱して実施される。

得られた酵素−担体混合物は、安定であり、変性、ｐＨ
１温度などの要因に抵抗し、そしてその酵素活性を失な
うことなく断続的でも連続的でも用いることができる。

この複合物は、親和クロマトグラフィーに、酵素触媒、
分析用触媒又は工業用触媒として、特に食品、医薬品又
は植物衛生工業で用いることができる。

以下に、本発明の実施例を示すが、これら本発明を何ら
制限するものではない。

例１ 粒度が１００〜２００μｍ、比表面積が２５ｍ２／ｇ、
平均軸孔直径が１２５０Å、そして細孔容積が１ｍｌ／
ｇである５０．９の微球状シリカを３００ｍ１のモノエ
タノールアミンに加える。

その分散体を沸点まで加熱し、次いでこの温度に３時間
保って１５０ｍ１のエタノールアミン及び生成水を除去
する。

冷却後、シリカを沢過し、３００ｍ１のアセトンで洗い
、次いで８０℃でオーブン乾燥する。

得られた生成物は、微量分析で定量して、０，２１重量
楚の炭素と０．１重量％の窒素を含有する。

得られたグラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ８のり
ん酸塩緩衝液中の４重量％のグルクルアルデヒドの溶液
２５０ｍ１により周囲温度でかきまぜながら２時間処理
する。

それからシリカを泥過し、次いで１００ｍ１の０．１Ｍ
、ｐＨ８のりん酸基緩衝液で洗う。

次いで、処理されたグラフトされたシリカを４００ｍ１
の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で洗い、次い
で４重量％のラクターゼを溶液状で含む２５０ｍ１の０
．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中に分散させる。

この分散体を周囲温度でかきまぜながら１５時間保持す
る。

形成された酵素−担体複合物を炉別し、次いで２５０ｍ
１の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で洗う。

この複合物の酵素活性は、１ｇの複合物を０．０５Ｍ、
ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中の４０ｇ／ｌのラクトース
溶液１０ｍ１と５５℃で接触させ、１０分間かきまぜる
ことにより決定される。

複合物を炉別し、そして生成したグルコースをＰ液中で
定量する。

この複合物の酵素活性は７８Ｕ／ｇである（単位Ｕは１
分間に１マイクロモルのラクトースを加水分解する複合
物の量である）。

溶液状の酵素の固定前及び固定後の酵素活性は、１ｍｌ
の酵素溶液を０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中
の４０ｇ／ｌのラクトース溶液１０ｍ１に５５℃で加え
、かきまぜながら５分間保ち、次いで容器を沸騰水中に
５分間入れて反応を停止させることにより決定される。

冷却後に、生成したグルコースを定量する。

二つの活性の差から、固定の過程で失なわれた活性が求
められた。

不動化された酵素の活性と溶液の消失した活性との比か
らラクターゼの不動化収率が与えられ、これは５５％で
ある。

比較のために、下記のようにして得られたアミノシラン
でグラフトされた担体を用いて例１を繰り返す。

５０ｇの例１と同じシリカ球状体を５ｇのγ−アミノプ
ロピルトリエトキシシランを含有する２５０ｍ１のキシ
レン中に分散させる。

この懸濁液を３時間沸点まで加熱する。

冷却後、シリカを戸別し、３００ｍＡのアセトンで洗い
、次いで８０℃で乾燥する。

分析により、得られた生成物は０．７０重量％の炭素と
０．１８重量％の窒素を含有することが決定される。

ラクターゼを固定化させた後、形成された複合物は８０
Ｕ／ｇの酵素活性を有し、そしてその不動化収率は２２
％である。

これらの二つの複合物はほぼ同じ活性であるが、しかし
、その活性を得るためには本発明の担体では２．５倍少
ない酵素が必要であることがわかる。

複合物の使用 １０ｇの例１の複合物を５５℃に保った直径２．５ｃｍ
のカラムに装入する。

０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中の４０ｇ／ｌ
のラクトース溶液を２００ｍ１／ｈの割合で連続的にパ
ーコレーションする。

カラムから流出する溶液について測定してラクトースか
らグルコースへ加水分解率は８０％である。

５００時間連続操作した後、加水分解率は依然として８
０％である。

このことは、本発明のラクターゼ−担体複合物の良好な
安定性を示している。

例２ 例１を繰り返えすが、ただしエタノールアミンの一部も
、またグラフトされた担体の製造中に生じる水も除去し
ないで行なう。

このグラフトされた担体は０．２重量％の炭素と０．１
重量％の窒素を含有する。

媒質中に残留する水はグラフト化に影響しないことが認
められる。

得られたラクターゼ−担体複合物は８０Ｕ／ｇの酵素活
性を有し、そしてその不動化収率は５５％である。

例３ 例１のように実施するが、ただし粒度２００μｍ〜Ｉｍ
ｍのシリカを用いてラクターゼ−担体複合物を製造する
。

この複合物の酵素活性は６４ｕ／ｇであり、不動化収率
は５５％である。

例４ 例１のように実施するが、ただしシリカを１００〜２０
０μｍの粒度、１５４ ｍ２／ｇの比表面積、３５０Å
の平均細孔直径及び１．１８ｍ１／ｇの細孔容積を有す
るアルミナで代える。

分析により、グラフトされたアルミナは１．９８重量％
の炭素と０．８７重量％の窒素を含有することが示され
る。

得られたラクターゼ担体複合物は、９０Ｕ／ｇの酵素活
性を有し、その不動化収率は３５％である。

例５ １００〜２００μｍの粒度、２５ｍ２／ｇの比表面積、
１２５０Åの平均細孔直径及び１ｍｌ／９の細孔容積を
有する。

５０９のシリカを、２０ｇの５−アミノ−１−ペンタノ
ールを溶解した３００ｍ１のジメチルホルムアミドに分
散させる。

その分散体を沸点まで加熱し、この温度に３時間保って
１５０ｍ１のジメチルホルムアミドと生成する水を漸次
除去する。

冷却後、シリカを炉別し、３００ｍ１のジメチルホルム
アミド、次いで１５０ｍ１のアセトンで洗い、最後に８
０℃で乾燥する。

分析により、得られた生成物が０．３５重量％の炭素と
０．０９重量％の窒素を含有することが示される。

得られたグラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ８のり
ん酸塩緩衝液中の４重量％のグルタルアルデヒド溶液２
５０ｍ１によりかきまぜながら周囲温度で２時間処理す
る。

それからシリカを濾過し、次いで１００ｍ１の０．１Ｍ
、ｐＨ８のりん酸塩緩衝液で洗う。

次いで、処理されたグラフトされたシリカを４００ｍ１
の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で洗い、次い
で４重量係のラクターゼを溶液状で含有する２５０ｍ１
の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中に分散させ
る。

その分散体を周囲温度で１５時間かきまぜ続ける。

形成された酵素−担体複合物を炉別し、次いで２５０ｍ
１の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で洗う。

これは４０Ｕ／９の酵素活性を有し、そして不動化収率
は４５％である。

例６ グラフトされた担体を製造するために、１００〜２００
μｍの粒度、１００ｍ２／９の比表面積、３００Åの平
均細孔直径及び１ｍｌ／ｇの細孔容積を持つシリカを用
いて例１におけるように実施する。

得られたグラフトされたシリカは０．９５重量％の炭素
と０．３８重量％の窒素を含有する。

例１さの比較から、より大きい比表面積のシリカの使用
はより多くのグラフトを可能ならしめることが認められ
る。

得られたグラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ８のり
ん酸塩緩衝液中の４重量％のグルタルアルデヒド溶液２
５０ｍ１により周囲温度で２時間かきまぜながら処理す
る。

濾過後、得られた変性されグラフトされたシリカを１０
０ｍ１の０．ＩＭ、ｐＨ８のりん酸塩緩衝液で洗う。

次いでこのシリカの１０ｇを４００ｍ１の０．０２Ｍ、
ｐＨ７のりん酸塩緩衝液で洗い、次いで１重量％のペニ
シリンアミダーゼを溶液状で含有する５００ｍＡの０．
０２Ｍ、ｐＨ７のりん酸塩緩衝液中に分散させる。

この分散体を周囲温度で１５時間かきまぜ続ける。

形成されたペニシリンアミダーゼ−担体複合物を炉別し
、次いで５０ｍ１の０．０２Ｍ、ｐＨ７のりん酸塩緩衝
液で洗う。

このペニシリンアミダーゼ−担体複合物の酵素活性は、
０．５ｇの複合物を０．１Ｍ、ｐＨ７，５のりん酸塩緩
衝液中の２０９／ｌのペニシリンＧ溶液４０ｍ１と３０
℃で３０分間接触させることにより決定される。

次いで複合物をろ別し、形成された６Ａ、ＰＡをろ液中
で定量する。

複合物の酵素活性は５０Ｕ／ｇである（単位Ｕは１分間
で１マイクロモルのペニシリンＧを加水分解する複合物
の量である）。

溶液状の酵素の固定前後での酵素活性は、１ｍｌの酵素
溶液を０．１Ｍ、ｐＨ７，６のりん酸塩緩衝液中の２０
ｇ／ｌのペニシリンＧ溶液１０ｍ１に加え、３０℃で３
０分間かきまぜ続け、次いで生成した６Ａ、ＰＡを定量
することによって決定される。

酵素の不動化収率は７０％である。

複合物の使用 １ｇの複合物を１ｃ、ｃ、の直径のカラムに装入する。

０．１Ｍ、ｐＨ７，６のりん酸塩緩衝液中の２０９／ｌ
のペニシリンＧ溶液を５０ｍ１／ｈの割合で周囲温度で
連続的にパーコレーションする。

カラムを流出する溶液について測定して、ペニシリンＧ
の６Ａ、ＰＡへの加水分解率は４０％である。

３００時間の実施後に、加水分解率は依然として４０％
である。

このことは、ペニシリンアミダーゼ−担体複合物の良好
な安定性を示している。

例７ １００〜２００μｍの粒度、２５ｍ２／９の比表面積、
１２５０Åの平均細孔直径及び１ｍｌ／９の細孔容積を
持つ５０ｇのシリカを２１のｐ−アミンフェノールを溶
解した３００ｍ１のジメチルホルムアミド中に分散させ
る。

この分散体を沸点まで加熱し、この温度で３時間保って
１５０ｍ１のジメチルホルムアミドと生成水を漸次除去
する。

冷却後、シリカを濾過し、３００ｍ１のジメチルホルム
アミドで洗い、次いで１５０ｍ１のアセトンで洗い、最
後に８０℃で乾燥する。

分析により、得られた生成物が０．３１重量％の炭素と
０．０６重量％の窒素を含有することが示される。

グラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ８のりん酸塩緩
衝液中の４重量％のグルタルアルデヒド溶液２５０ｍ１
で周囲温度で２時間かきまぜながら処理し、次いで濾過
し、最後に１００ｍ１の０．１Ｍ、ｐＨ８のりん酸塩緩
衝液で洗う。

ペニシリンアミダーゼ−担体複合物を例６におけるよう
に製造する。

これは１６Ｕ／ｇの酵素活性を有し、その不動化収率は
６５％である。

例８ 例７と同じグラフトされたシリカの１０９を２００ｍ１
のＮ／１０の埴酸及び１００ｍ１のＭ／１０のＮａＮＯ
２により０℃で３時間かきまぜながら処理する。

濾過し、５００ｍ１の冷水で洗った後、ジアゾ化された
グラフトシリカを０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝
液中の４重量％のラクターゼ溶液５０ｍ１中に分散させ
る。

この分散体を４℃で３時間かきまぜ続ける。

形成されたラクターゼ−担体複合物を戸別し、次いで同
じ酢酸緩衝液で洗う。

得られた複合物の酵素活性は７１Ｕ／ｇであり、その不
動化収率は２０％である。

例９ 例８と同じジアゾ化されたグラフトシリカのＩｏｇを０
．１Ｍ、ｐＨ８のＴＲ１５緩衝液中の１重量％のアシラ
ーゼ溶液２００ｍ１に分散させる。

この分散体を４℃で一夜かきませながら保つ。

形成されたアシラーゼ−担体複合物を炉別し、次いで同
じＴＲ１５緩衝液で洗う。

この複合物の酵素活性は、５００ｍｇの複合物を５．１
０−４Ｍの塩化コバルトを含有する０、１Ｍ、ｐＨ８の
ＴＲ１５緩衝液中の０．４重量％のＮ−アセチル−ＤＬ
−メチオニン溶液５０ｍ１と３７℃で３０分間かきまぜ
ながら接触させることにより決定される。

複合物を沖過し、生成したＬ−メチオニンは涙液中で定
量する。

この複合物の酵素活性はＩＯＵ／ｇである（単位Ｕは１
分間に１マイクロモルのＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニ
ンを転移させる複合物の量である）。

溶液状のアシラーゼの固定前後での酵素活性は、５．１
０−−４Ｍの塩化コバルトを含有する０、１Ｍ、ｐＨ８
のＴＲ１５緩衝液中の０．４重量％のＮ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニン溶液５ｍｌに０．１ｍｌの酵素溶液を加
えることによって決定される。

その混合物を３７℃で３０分間保ち、次いで容器を沸騰
水中に３分間浸漬することによって反応を停止させる。

冷却後、生成したし一メチオニンを定量する。

アシラーゼの不動化収率、即ち複合物の活性と失なわれ
た活性との比は５０％である。

例１０ 例９におけるのと同じ方法であるが、ただし粒度３０〜
１００μｍのシリカを用いてアシラーゼ−担体複合物を
製造する。

この複合物の酵素活性は１０．５Ｕ／９であり、その不
動化収率は５０％である。

複合物の使用 ３０９の複合物を直径１ｃｍ及び高さ９０Ｃｍのカラム
に装入する。

そのカラムに周囲温度で３００ｍ１の０．１Ｍ、ｐＨ８
のＴＲ１５緩衝液を２時間で通し、次いで１０μモルの
ＤＬメメチニンを含有する２ｍｌの同一緩衝液を注入し
、最後に０．１Ｍ、ｐＨ８のＴＲ１５緩衝液を１０ｍ１
／ｈの割合で通じる。

カラムを流出する液体のＵＶ分光分析は、Ｄ−メチオニ
ンとＬ−メチオニンが分離していることを示す。

３ｍｌのＤ−メチオニン含有画分、４ｍｌのＤ−メチオ
ニンとＬ−メチオニンとの混合物を含有する画分、及び
３ｍｌのＬ−メチオニン含有画分を順次に回収する。

例１１ 粒度が１００〜２００μｍ１比表面積が２３ｍ２／ｇ、
平均細孔直径が１３３０Å及び細孔容積がＱ、９６ｍ１
／Ｅｌである５０９のシリカ球状体を３０９の２−クロ
ルエタノールを含有する２００ｍ１のキシレンに加える
。

沸点まで加熱し、次いでこの温度を４時間保つ。

冷却後、シリカを濾過し、３００ｍ１のアセトンで洗い
、次いでオーブンで８８０℃で乾燥する。

微量分析により、得られた生成物は０．１６重量％の炭
素と０．２０重量％の塩素を含有することが定量される
。

得られたグラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ６，５
のりん酸塩緩衝液中の１重量％のウレアーゼ溶液４００
ｍ１に分散させ、周囲温度で２０時間かぎませ続ける。

形成されたウレアーゼ−担体複合物を濾過し、２５０ｍ
１の０．１Ｍ、ｐＨ６，５のりん酸塩緩衝液で洗う。

この複合物の酵素活性は、１００ｍ９の複合物を０．１
Ｍ、ｐＨ７のりん酸塩緩衝液中の３０９／ｌの尿素溶液
２０ｍ１と３７℃で接触させ、３分間かきまぜることに
よって決定される。

それから複合物を炉別し、分離された溶液に２０ｍ１の
０．１Ｎ端酸を加えて生成アンモニアを中和する。

過剰の酸を０、ＩＮか性ソーダで定量する。

複合物の酵素活性は１５００Ｕ／９である（単位Ｕは１
分間に１μモルのアンモニアを遊離させろ複合物の量で
ある）。

溶液状のウレアーゼの固定前後での酵素活性は、０．１
Ｍ、ｐＨ７のりん酸塩緩衝液中の３０ｇ／ｌの尿素溶液
４ｍｌに０．５ ｍｌの酵素溶液を３７℃で加え、かき
まぜながら３分間保ち、次いで５ｍｌの０．１Ｎ端酸を
加えて反応を停止させることによって決定される。

次いで過剰の酸を０．ＩＮか性ソータで定量する。

二つの活性の差から、酵素の固定の過程で失なわれた活
性が求められる。

不動化された酵素の活性と溶液の失なわれた活性との間
の比からウレアーゼの不動化収率が与えられるが、これ
は６０％である。

例１２ 例１１と同じグラフトされたシリカ５ｇを１００ｍｇの
カタラーゼを溶液として含有する５０ｍ１の０．０５Ｍ
、ｐＨ７のりん酸塩緩衝液中に分散させ、次いで得られ
た分散体を周囲温度でかきませながら４時間保つ。

形成されたカタラーゼ−担体複合物を濾過し、次いで５
０ｍ１の０．０５Ｍ、ｐＨ７のりん酸基緩衝液で洗う。

この複合物の酵素活性は次のように決定される。

ｉｏｍｇ複合物を０．０５Ｍ、ｐＨ７のリン酸塩緩衝液
中の０．０２Ｍの過酸化水素溶液５ｍｌに加え、次いで
２５℃で２分間かきまぜながら分散状態を保つ。

３滴の濃硫酸を加えて過酸化水素の分解反応を停止させ
、過剰の過酸化水素を５．１０−３Ｍの過マンガン酸カ
リウム水溶液で定量する。

この複合物の活性は２２８０Ｕ／９である（単位Ｕは１
分間に１マイクロモルの過酸化水素を分解させる複合物
の量である）。

同様に、溶液状の酵素の活性を固定の前後で決定する。

０．２ｍｌの酵素溶液を０．０５Ｍ、ｐＨ７のりん酸塩
緩衝液中の０．０２Ｍ過酸化水素溶液５ｍｌに加え、次
いでその混合物を２５℃で２分間かきまぜる。

次いで３滴の濃硫酸を加えて反応を停止させ、過剰の過
酸化水素を５．１０−３Ｍ過マンガン酸カリウム溶液で
定量する。

カタラーゼの不動化収率、即ち複合物の活性と失なわれ
た活性との比は、１１％である。

例１３ 粒度が１００〜２００μｍ、比表面積が２３ｍ２／ｇ、
平均細孔直径が１３３０Å及び細孔容積が０．９６ｍ１
／ｇである５０ｇのシリカ球状体を１５ｇの４−ヒドロ
キシベンズアルデヒドを含有する２５０ｍ１のジメチル
ホルムアミドに加える。

得られた分散体を沸点まで加熱し、次いでこの温度に４
時間保つ。

冷却後、シリカを炉別し、２５０ｍ１のジメチルホルム
アミドで洗い、次いで１５０ｍ１のアセトンで洗い、最
後にオーブンで８０℃で乾燥する。

微量分析により、得られた生成物が０．２０重量％の炭
素を含有することが決定される。

このグラフトされたシリカ上で、例１１に記載のように
してウレアーゼを不動化させる。

このウレアーゼ−担体複合物は１４００Ｕ／ｇの酵素活
性を有し、その不動化収率は５５％である。

例１４ 例１３と同じグラフトされたシリカ上で、例１２と同じ
方法でカタラーゼを不動化させる。

得られたカタラーゼ−担体複合物は２２５０Ｕ／ｇの酵
素活性を有し、その不動化収率は１０％である。

例１５ 例１３と同じグラフトされたシリカ５ｇを０．１Ｍ、ｐ
Ｈ７，８のＴＲ１５緩衝液中の１％トリプシン溶液２０
０ｍ１に分散させる。

次いで、得られた分散体を周囲温度にかきまぜながら４
時間保つ。

形成されたトリプシン−担体複合物を沖過し、次いで５
０ｍ１の０．１Ｍ、ｐＨ７、８のＴＲ１５緩衝液で洗う
。

この複合物の酵素活性は次のように決定される。

ｉｏｍｇの複合物を２５ミリモル／ｌの塩化カルシウム
を含有する１０ｍ１の０．２Ｍ、ｐＨ７，８のＴＲ１５
緩衝液及び１２ミリモル／ｌのベンゾイルアルギニン−
ｐ−ニトロアニリド溶液０．２ｍｌと２５℃でかきまぜ
ながら２分間接触させる。

複合物を瀘過し、そして生成してＦ液中に含まれるｐ−
ニトロアニリンを比色分析により定量する。

複合物の酵素活性は１３．８Ｕ／ｇである（単位Ｕは、
２５℃、ｐＨ７，８において１分間に１マイクロモルの
ベンゾイルアルキニン−ｐ−ニトロアニリドを加水分解
する複合物の量である）。

溶液状のトリプシンの固定前後での酵素活性は、０．１
Ｍ、ｐＨ７，８のＴＲ１５緩衝液中の酵素溶液０．２ｍ
ｌを２２ミリモル／ｌの塩化カルシウムを含有する２ｍ
ｌの０．２Ｍ、ｐＨ７，８のＴＲ１５緩衝液に加え、次
いでこれに１２ミリモル／ｌのベンゾイルアルギニン−
ｐ−ニトロアニリン溶液０．２ ｍｌを加え、得られた
溶液を２５℃で１５分間保持し、次いで生成したｐ−ニ
トロアニリンを定量することによって決定される。

非移動化された酵素の油清と溶液の失なわれた活性との
比からトリプシンの不動化収率が求められ、これは７８
％であった。

例１６ 例１３と同じグラフトされたシリカ５０ｇを４重量％の
ラクターゼを溶液状で含有する２５０ｍ１の０．０５Ｍ
、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中に分散させる。

この分散体を周囲温度で１５時間かきまぜ続けろ。

形成された酵素−担体複合物を戸別し、次いで２５０ｍ
１の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で洗う。

例１におけるように決定された酵素活性及び不動化収率
は、それぞれ８５Ｕ／ｇ及び４５％である。

複合物の使用 ５ｇの複合物を直径２５ｃｍのカラムに装入する。

０．１Ｍ、ｐＨ８のりん酸塩緩衝液中の２重量％グルク
ルアルテヒド溶液を１００ｍ１／ｈの割合で３時間、周
囲温度でパーコレーションし、次いで１００ｍ１のりん
酸塩緩衝液を１時間通す。

次いで、０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液中の４
０ｇ／ｌのラクトース溶液を１００ｍ１／ｈの割合で５
５℃で連続的にパーコレーションする。

カラムから出る溶液について測定して、ラクトースから
グルコースへの加水分解率は６９％である。

２００時間連続操作した後に、加水分解率は不変である
。

このことは、ラクターゼ−担体複合物の良好な安定性を
示している。

例１７ 粒度が１００〜２００μｍ、比表面積が２３ｍ２ｍ２／
ｇ、平均細孔直径が１３３０Å及び細孔容積が０．９６
ｍ１／ｇである３０ｇのシリカ球状体を１００ｍ１のメ
ルカプトエタノールに加える。

得られた分散体を沸点まで加熱し、次いでこの温度に４
時間保つ。

冷却後、シリカを濾過し、２００ｍ１のアセトンで洗い
、次いで８０℃で乾燥する。

微量分析により、得られた生成物が０．２５重量％の炭
素と０，３２重量％の硫黄を含有することが決定される
。

得られたグラフトされたシリカを１ミリモルのＥＤＴＡ
を含有する０、１Ｍ、ｐＨ８のＴＲ１５緩衝液中の０．
３Ｍ塩化ナトリウム溶液２５０ｍ１により周囲温度で洗
い、次いでシリカを濾過し、次いで３０ミリモルの２，
２′−ジチオジピリジンを含有する５００ｍ１のＴＲ１
５／ＮａＣ１／ＥＤＴＡ緩衝液と周囲温度で３０分間接
触させ、かきまぜる。

次いでシリカを濾過し、次いで２５０ｍ１の０．１Ｍ、
ｐＨ７のりん酸塩緩衝液で洗う。

次いで、グラフトされたシリカを０．１Ｍ、ｐＨ６，５
のりん酸塩緩衝液中の１重量受のウレアーゼ溶液２５０
ｍ１に分散させ、次いで周囲温度で２０時間かきまぜ続
ける。

形成されたウレアーゼ−担体複合物を濾過し、次いで１
５０ｍ１の０．１Ｍ、ｐＨ６，５のりん酸塩緩衝液で洗
う。

例１１におけるように決定された複合物の酵素活性及び
不動化収率はそれぞれ１５００Ｕ／９及び５２％である
。

例１８ 粒度１００〜２００μｍ、比表面積２３ｍ２／ｇ、平均
細孔直径１３３０Å及び細孔容積０．９６ｍ１／ｇのシ
リカ球状体３０．９を２５ｍ１の３−ヒドロキシプロピ
オン酸を含有する１００ｍ１のジオキサンに加える。

得られた分散体を沸点まで加熱し、次いでこの温度に４
時間保つ。

冷却後、シリカを濾過し、２００ｍｇのアセトンで洗い
、次いでオーブンで８０℃で乾燥する。

得られた生成物は０．１０重量楚の炭素を含有する。

得られたグラフトされたシリカを６０ｍ１のカタラーゼ
を溶液状で含有する３００ｍ１の０．０５Ｍ、ｐＨ５，
５のりん酸塩緩衝液中に分散させる。

かきまぜた分散体を周囲温度で４時間保つ。

形成されたカフラーゼ−担体複合物を濾過し、次いで２
５０ｍ１の０．０５Ｍ、ｐＨ５，５のりん酸塩緩衝液で
洗う。

複合物の酵素活性は１５００Ｕ／ｇであり、その不動化
収率は１０％である。

例１９ 例１８と同じグラフトされた乾燥シリカ３０ｇを、３ｇ
の１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）
カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートを溶液
状で含有する３００ｍ１の０．０５Ｍ、ｐＨ４，５の酢
酸塩緩衝液中に分散させる。

この分散体を周囲温度でかきまぜながら３時間保つ。

次いでシリカを濾過し、次いで５００ｍＡの蒸留水で洗
う。

得られた生成物に、例１５と同じ方法でトリプシンを固
定させる。

形成された複合物は１３．８Ｕ／ｇの酵素活性を有し、
その不動化収率は７９％である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素が有機基上の少なくとも１個の該酵素と反応性
   の官能基に結合されており、そして前記有機基が無機担
   体のヒドロキシル基と該有機基のアルコール又はフェノ
   ール官能基との反応から生ずる少なくとも１個のエステ
   ル結合によって該担体にグラフト化されていることを特
   徴とする、グラフト化された無機担体に共有結合によっ
   て固定された酵素よりなる酵素−担体複合物。 ２ 有機基が直鎖若しくは分枝鎖状脂肪族残基（その炭
   素原子数１〜８の脂肪族鎖は１個の窒素原子及び（又は
   ）１個の硫黄原子及び（又は）１個のフェニル基を含有
   していてもよい）、シクロ脂肪族残基、アリール又はア
   ルキルアリール残基（その核及び（又は）鎖は１個又は
   それ以上の窒素原子を含有していてもよい）で表わされ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の複合物
   。 ３ 有機基の反応性官能基がアミン、ハロゲン、スルフ
   ヒドリル、アルデヒド、カルボキシル官能基で表わされ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の複合物
   。 ４ ヒドロキシル基を持つ不溶性無機担体を少なくとも
   １個のアルコール又はフェノール官能基及び少なくとも
   １個の反応性官能基を持つ有機基で形成される化合物と
   反応させ、次いでこれに酵素を結合させることを特徴と
   する、酵素が有機基上の少なくとも１個の該酵素と反応
   性の官能基に結合されており、そして前記有機基が無機
   担体のヒドロキシル基と該有機基のアルコール又はフェ
   ノール官能基との反応から生ずる少なくとも１個のエス
   テル結合によって該担体にグラフト化されてなる無機担
   体に共有結合によって固定された酵素よりなる酵素−担
   体複合物の製造方法。 ５ 担体がレンガ、アルカリけい酸塩及びアルミノけい
   酸塩、金属酸化物、シリカで表わされることを特徴とす
   る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 有機化合物が、その反応性官能基がアミン、ハロゲ
   ン、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシル官能基
   で表わされ且つその−ＯＨ官能基が直鎖若しくは分枝鎖
   状脂肪族残基（その炭素原子数１〜８の脂肪族鎖は１個
   の窒素原子及び（又は）１個の硫黄原子及び（又は）１
   個のフェニル基を含有してもよい）、シクロ脂肪族残基
   、アリール又はアルキルアリール残基（その核及び（又
   は）鎖は１個又はそれ以上の窒素原子を含有してもよい
   ）に結合されているところのアルコール又はフェノール
   であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ７ 有機化合物がアミノアルコール、ハロケノアルコー
   ル、メルカフトーアルコール、アルデヒド−アルコール
   、酸−アルコール、アミンフェノール、ハロゲンフェノ
   ール、メルカプトーフエノル、アルデヒド−フェノール
   又は酸−フエノールであることを特徴とする特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８ 有機化合物が液体であり、そして反応が担体を過剰
   の有機化合物中に分散させることによって実施されるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。 ９ 有機化合物が固体又は液体であり、そして反応が有
   機化合物の溶媒の存在下で実施されることを特徴とする
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 １０ 有機化合物の量が担体のヒドロキシル基１個につ
   き１個のアルコール又はフェノール官能基に相当するよ
   うな最少量であることを特徴とする特許請求の範囲第９
   項記載の方法。 １１ 不動化させ得る酵素が酸化還元酵素、転移酵素、
   加水分解酵素、リアーセ、インメラーゼ及びリガーゼで
   表わされることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
   の方法。 １２ 有機化合物の反応性官能基に応じて、酵素が直接
   に又は該官能基の活性化後に反応させることができるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。