JPH0430274B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 常温、常圧の条件で種々の反応を触媒する酵素
は微生物中の酵素あるいは抽出した酵素の形で利
用されている。 本発明は、この酵素を固定化して有効に利用す
るのに特に有効な担体及びこれに酵素を固定化し
てなる固定化酵素に関する。 （従来の技術） 酵素を利用した反応は常温常圧で反応が進行し
酵素に特異的な基質のみとしか反応しないため
種々の反応に応用されているが、一般的に酵素は
水可溶性であり一回反応に利用したのち目的生成
物からその酵素を取り除く必要があり、その工程
で、酵素は失活してしまう。従つて、次に反応す
るときは新たに酵素を加えなければならない欠点
を有している。酵素を使い捨てではなく繰り返し
て有効に使用する方法あるいは酵素反応を連続的
に行う方法として種々の酵素固定化方法が考案さ
れ例えば吸着法、担体結合法あるいはゲル包括法
によつて酵素を水不溶性担体に吸着、共有結合な
いし包括させる方法等が知られている。 （発明が解決しようとする問題点） このうち酵素を水不溶性担体に吸着固定する吸
着法による場合は比較的弱い結合（水素結合、疎
水結合、イオン結合）によつて保持されているた
め酵素の固定化あるいは基質との反応に際しては
高温、強酸、強アルカリなどの処理は避けねばな
らない。 これらの方法により酵素を水不溶性担体に固定
化した固定化酵素は基質濃度やイオン強度に影響
され、基質濃度又はイオン強度が高くなると酵素
が水不溶性担体から脱離しやすくおのずと基質濃
度又はイオン強度を高くできず、また活性の持続
が短かく安定性も低い欠点を有している。又、こ
れら欠点を補うためジアルデヒド等の蛋白質架橋
試薬により酵素を架橋処理することによつて酵素
の脱離を防止しようとする試みがなされている
（特開昭57−36986）が、使用する試薬濃度が低す
ぎると架橋が充分おこなわれないため酵素の脱離
を防止し得ず、またその濃度が高いと酵素の失活
が激しく架橋反応の設定条件が難かしいという欠
点を有する。又、吸着法及び高分子担体の格子中
に包括するゲル包括法は固定化の際の失活は少な
く初期の活性は高いが、その後のPHや緩衝液等の
外部環境によつて酵素の脱離が多く安定性に乏し
いという欠点を有している。 又、担体結合法としては例えばカルボジイミド
類の用いてカルボキシル基を有する担体と酵素の
アミノ基等を結合させる方法、臭化シアンを用い
て水酸基を活性化後、酵素と反応させる方法等の
共有結合法がある。共有結合法は担体と酵素が共
有結合によつて強く結合しているため高濃度の基
質溶液及び塩類溶液によつて酵素が脱離すること
が少ないが、イオン結合に比べて酵素を結合させ
る際の反応条件の設定が難かしく操作も複雑であ
り、場合によつては酵素活性の低下を来たすとい
う欠点がある。 このように、従来公知の方法で得られる固定化
酵素はその製法の点で又はその使用上の点で欠点
を有している。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記欠点を解決すべく鋭意研究
を重ねた結果、水不溶性の弱塩基性アニオン交換
体のアニオン交換基にエピハロヒドリンを反応さ
せてエポキシ基を導入した後、酵素溶液を作用さ
せるという簡単な操作により得られる固定化酵素
は、酵素と担体が強固に結合しており、高い基質
濃度やイオン強度においても酵素が脱離せず、そ
の結果、酵素活性が長期間に亘つて安定であるこ
とを見い出し本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は、 １ 水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基
にエピハロヒドリンを反応させることにより得
られる担体。 ２ 水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基
にエピハロヒドリンを反応させて得られる担体
に酵素を固定化してなる固定化酵素。 に関するものである。 本発明の担体及び固定化酵素は簡単に、例えば
次のようにして製造することができる。 即ち、水不溶性の弱塩基性アニオン交換体にエ
ピハロヒドリンを水中に分散あるいは溶解した状
態で又はアセトン、アルコール等の親水性溶媒あ
るいはこれと水の混合液に溶解した状態で又はエ
ーテル、トルエン等の溶媒に溶解した状態で作用
させるとエピハロヒドリンが交換基と反応しエポ
キシ基が弱塩基性アニオン交換体に導入される。
このようにして得られるエポキシ基を含有する担
体に酵素水溶液を作用させると容易に共有結合し
た固定化酵素が得られる。 本発明に用いる水不溶性の弱塩基性アニオン交
換体としては種々のものが使用でき特に限定され
ない。例えば、交換基として１級、２級又は３級
アミノ基を有する種々のイオン交換体が使用でき
る。 これらの例としてはアミノ基；メチルアミノ
基、エチルアミノ基、ヒドロキシルアルキルアミ
ノ基、アミノアルキルアミノ基等の２級アミノ
基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ビス
ヒドロキシエチルアミノ基等の３級アミノ基が挙
げられる。 イオン交換体としては水不溶性の弱塩基性アニ
オン交換体であれば種々の形体、用途、物質が使
用でき、例えば(1)イオン交換樹脂、(2)イオン交換
ゲルクロマトグラフイ用樹脂、(3)イオン交換膜又
はイオン交換繊維、(4)エマルジヨン、(5)無機系担
体、(6)カチオン性天然多糖類等があげられる。 更に具体的には (1) イオン交換樹脂（弱塩基性アニオン交換樹
脂）としては、例えば商品名アンバーライト
IRA−35、−45、−68、−93、−94、−99（ロームア
ンドハース社製）、商品名ダウエツクス−66、−
WGR−２（ダウケミカル社製）、商品名ダイヤ
イオンWA−10、−11、−20、−21、−30（三菱化
成工業社製）等がある。 (2) イオン交換ゲルクトマトグラフイ用樹脂とし
てはジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基
等を有するゲルクロマトグラフイ用樹脂が挙げ
られ、例えば商品名DEAEトヨパール650M（東
洋曹達社製）、商品名DEAEセフアデツクスＡ
−25、−50、DEAE−セフアローズCL−6B、
DEAE−セフアセル（フアルマシアフアインケ
ミカルズ社製）等がある。 (3) イオン交換膜又はイオン交換繊維としては弱
塩基性アニオン交換基を持つ膜であればいずれ
でもよく、例えばDEAE−セルロースペーパー
等がある。 (4) エマルジヨンとしては、例えばジアルキルア
ミノアルキル（メタ）アクリレートを単独で、
又はこれと共重合可能なエチレン系不飽和単量
体とを任意の割合で混合しエマルジヨン重合よ
り得られた重合体等が挙げられ、通常、水溶媒
中でポリオキシエチレンアルキルフエニルエー
テル等の乳化剤存在下で通常のラジカル重合法
より得られ乳化剤は透析等の処理により除くこ
とができる。 (5) 無機系担体としては多孔性ガラスあるいはシ
リカゲル等があり、担体表面に例えば１級、２
級又は３級アミノ基を有するシランカツプリン
グ試薬を作用させることによりアミノ基等の弱
塩基性アニオン交換基を導入し、弱塩基性担体
としたもの等が挙げられる。 (6) カチオン性天然多糖類としては例えばキトサ
ン等が挙げられる。 本発明に用いるエピハロヒドリンとしては例え
ばエピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、エ
ピヨードヒドリンが挙げられ特に経済性からもエ
ピクロルヒドリンが好ましい。 エピハロヒドリンと弱塩基性アニオン交換体の
交換基との反応は、単に弱塩基性アニオン交換体
とエピハロヒドリンを含む溶液又は分散液とを混
合するだけでよい。反応温度は特に限定されず、
弱塩基性アニオン交換体がこわれない温度ならか
まわないが、特に０〜50℃が好ましい。 弱塩基性アニオン交換体に反応させるエピハロ
ヒドリンは弱塩基性アニオン交換体のイオン交換
容量（Meq／ml）の0.25当量以上反応させるのが
好ましく、とりわけ0.75〜1.0当量が好ましいが、
反応時にエピハロヒドリンは過剰量使用すること
ができる。未反応のエピハロヒドリンは多量の水
で充分洗浄することにより除かれる。またメタノ
ール、アセトン等の親水性溶媒を用いてもよく親
水性溶媒を用いた場合は少量の使用でエピハロヒ
ドリンを除くことができ更に水洗することにより
親水性溶媒も容易に除くことができる。 本発明の固定化酵素は例えばバツチ法あるいは
カラム法により下記の如く製造することができ
る。即ちバツチ法による場合は、上記のようにし
てエポキシ基が導入された弱塩基性アニオン交換
体を水に懸濁又は浸して酵素溶液を加え適当な温
度例えば４〜50℃にて数時間振とう等によるかく
はんをつづけ反応させることにより製造される。
次いで適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）にて
充分洗浄し未反応の不純蛋白や色素等を除去す
る。 更に濃厚塩類（例えば１モル食塩）を含有する
緩衝液にて数回振とう等による洗浄を繰り返して
イオン結合等の弱い結合で吸着されている酵素を
除去し固定化酵素を精製する。 またカラム法による場合は、エポキシ基が導入
された弱塩基性アニオン交換体を水に懸濁又は浸
してカラムに詰めこれに酵素溶液を適当な速さで
流下させ、適当な温度（例えば４〜50℃）にて反
応させることにより製造される。次いで適当な緩
衝液にて充分洗浄し、更に濃厚塩類を含有する緩
衝液をカラムの上部または下部より通筒させ固定
化酵素を精製する。 精製された固定化酵素は酵素反応において酵素
の脱離がなく更に酵素活性も高く長期間の反応に
耐え、また酵素の脱離がないため酵素反応後の反
応生成物の精製に際し、除蛋白等の工程の必要が
ない等の特徴を有する。 本発明の固定化酵素において、酵素は特に制限
されず種々の酵素を用いることができる。例え
ば、アミノアシラーゼ、ブレオマイシン不活化酵
素、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、インベルタ
ーゼ、ウレアーゼ、ウロキナーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、トリプシン、キモトリプシン、
パパイン、ペプシン、ペニシリンアミダーゼ、リ
パーゼ、ホスフアターゼのような加水分解酵素、
グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ、カタラーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グル
コン酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
フエニルアラニンアンモニアアーゼ、グルタミン
酸デカルボキシラーゼ、アスパルダーゼのような
脱離酵素、グルコースイソメラーゼ、グルタミン
酸ラセマーゼのような異性化酵素、グルタミン酸
−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、グルタ
ミン酸−オキザロ酢酸アミノトランスフエラー
ゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、クレアチンホスホキナーゼのような転移
酵素をあげる事ができる。 （実施例） 実施例 １ 10mlのアンバーライトIRA−68（総交換容量
1.6Meq／ml以上の弱塩基性陰イオン交換樹脂、
ロームアンドハース社製）を蒸留水で洗浄後、
1.5ｇのエピクロルヒドリンを20mlの含水メタノ
ール（メタノール：水＝１：１、以下含水メタノ
ールと略す）に溶解したものを加え37℃で15時間
振とうした。反応後の含水メタノール中にはガス
クロマトグラフイーによる分析の結果エピクロル
ヒドリンは検出されなかつた。エポキシ化された
アンバーライトIRA−68に30mlのメタノールを加
えよく振とうし３回繰り返して洗浄した。次いで
蒸留水で同様操作を５回繰り返しメタノールを除
去した。次に600mgのアミノアシラーゼ
（18000u／ｇ天野製薬社製）を20mlのＭ／15リン
酸緩衝液（PH＝7.2）に溶解したものをこれに加
え、37℃、４時間振とうし固定化アミノアシラー
ゼ剤を得た。 得られら固定化アミノアシラーゼ剤をカラムに
詰め、50mlのＭ／15リン酸緩衝液（PH＝7.2）を
自然流下させ未反応のアミノアシラーゼを除去し
た。更に50mlの2MNaClを含有するＭ／15リン酸
緩衝液を同様な操作で流出させイオン結合等で吸
着されている未反応アミノアシラーゼ及び色素等
を除去し精製した。 実施例 ２ 10mlのダイヤイオンWA−30（総交換容量
1.5Meq／ml以上のスチレン系弱塩基性陰イオン
交換樹脂、三菱化成工業社製）を蒸留水で洗浄
後、1.388ｇのエピクロルヒドリンを含水メタノ
ールに溶解したものを加え37℃、15時間振とうし
実施例１と同様にして固定化アミノアミラーゼ剤
を精製した。 実施例 ３ 1.7ｇのDEAEセフアデツクスＡ−25（総交換容
量3.5Meq／ｇ以上の弱塩基性陰イオン交換担体
フアルマシアフアインケミカルズ社製）を30mlの
Ｍ／15リン酸緩衝液（PH＝7.2）に膨潤させ2.0ｇ
のエピブロムヒドリンを加え37℃、15時間振とう
し実施例１と同様にして固定化アミノアミラーゼ
剤を精製した。 比較例 １ 10mlのアンバーライトIRA−68を蒸留水で洗浄
後、600mgのアミノアシラーゼを20mlのＭ／15・
リン酸緩衝液（PH＝7.2）に溶解して加え、37℃、
４時間振とうし実施例１と同様にして固定化アミ
ノアシラーゼ剤を精製した。 比較例 ２ 10mlのダイヤイオンWA−30を蒸留水で洗浄
後、比較例１と同様にして固定化アミノアシラー
ゼ剤を精製した。 比較例 ３ 1.7ｇのDEAEセフアデツクスＡ−25を30mlの
Ｍ／15リン酸緩衝液（PH＝7.2）に膨潤させ比較
例１と同様にして固定化アミノアシラーゼ剤を精
製した。 試験例 １ ２mlの固定化アミノアシラーゼ剤を10mlのキヤ
ツプ付き試験管に採取し４ml0.05モルのＮ−アセ
チル−DL−フエニルアラニン水溶液（PH＝7.2、
５×10^-4モルCo含有）を加え反応温度37℃、
反応時間60分にて振とうしながら酵素反応をおこ
ない、生成するＬ−フエニルアラニンを定量し反
応率を求めた。また固定化アミノアシラーゼ剤を
繰り返し用いて同じ反応を繰り返し行い、３回
目、30回目、60回目、90回目における酵素活性を
求めた。本発明の固定化アミノアシラーゼ剤と従
来の技術による固定化アミノアシラーゼ剤の結果
は下記の如くである。

【表】 試験例 ２ ２mlの固定化アミノアシラーゼ剤を10mlのキヤ
ツプ付き試験管に採取し４mlの0.05モルＮ−アセ
チル−DL−メチオニン水溶液（PH＝7.2、５×
10^-4モルCo含有）を加え反応温度37℃、反応
時間60分にて振とうしながら酵素反応をおこな
い、生成するＬ−メチオニンを定量し反応率を求
めた。固定化アミノアシラーゼ剤を繰り返し用い
て同じ反応を繰り返し行い、３回目、30回目、60
回目、90回目における酵素活性を求めた。本発明
の固定化アミノアシラーゼ剤と従来の技術による
固定化アミノアシラーゼ剤の結果は下記の如くで
あつた。

【表】 試験例 ３ ２mlの固定化アミノアシラーゼ剤を10mlのキヤ
ツプ付き試験管に採取し４mlの0.05モルＮ−アセ
チル−DL−バリン水溶液（PH＝7.2、５×10^-4モ
ルCo含有）を加え反応温度37℃、反応時間60
分にて振とうしながら酵素反応をおこない、生成
するＬ−バリンを定量し反応率を求めた。また固
定化アミノアシラーゼ剤を繰り返し用いて同じ反
応を繰り返し行い、３回目、30回目、60回目、90
回目における酵素活性を求めた。本発明の固定化
アミノアシラーゼ剤と従来の技術による固定化ア
ミノアシラーゼ剤の結果を下記の如くであつた。

【表】 次に牛肝臓より抽出したブレオマイシン不活化
酵素の固定化の例を示す。 実施例 ４ 新鮮な牛肝臓20ｇを100mlの１／15モルリン酸
緩衝液（PH＝7.2）とホモジエネートし、
15000rpmにて30分遠心分離し、上清を集めブレ
オマイシン不活化酵素液とする。別に同緩衝液に
て平衝化したDEAEセフアデツクスＡ−25（フア
ルマシアフアインケミカルズ社製）20mlに実施例
１と同様にしてエピクロルヒドリン3.0ｇを反応
させ、未反応エプクロルヒドリンを除去し、ブレ
オマイシン不活化酵素液100mlを加え、37℃にて
４時間ゆつくり振とうし、固定化した。これを保
温ジヤケツト付きカラムに充填し、１／15モルリ
ン酸緩衝液100ml、2N−NaClを含む同緩衝液400
ml、更に同緩衝液200mlにて洗浄し、未反応ある
いは吸着した酵素を洗い出した。 ジヤケツトに37℃の温水を流し、基質としてブ
レオマイシンB₂の１％同緩衝液溶液を2.5ml／時
間の流速で連続的に流した。 ２ケ月間連続運転してブレオマイシンB₂の加
水分解率は約80％に低下し、その平均加水分解率
は95.6％であつた。 比較例 ４ 実施例４でエピクロルヒドリンを作用させない
以外実施例４と同様に操作し、４日間にてブレオ
マイシンB₂の加水分解率は80％に低下した。 実施例 ５ 多孔質ガラスCPG−10（20〜80メツシユ、550
〓、エレクトロ・ヌクレオニツクス社製）８ｇに
10％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン
KBE−903（信越シリコーン社製）160mlを加え、
6N−塩酸にてPH＝5.5に調整し、75℃にて２時間
振とう後、別し、水洗して乾燥器にて120℃、
２時間熱処理する。得られたアミノプロピルガラ
スを実施例４と同様にエピクロルヒドリンと反応
させ、ブレオマイシン不活化酵素を固定し、酵素
反応を行つたところ同様の結果を得た。 比較例 ５ 実施例５でエピクロルヒドリンを作用させない
以外実施例５と同様に操作し、10日間にてブレオ
マイシンB₂の加水分解率は80％に低下した。 （発明の効果） 本発明においては、イオン結合法及び共有結合
による従来り固定化酵素の欠点を解決し、水不溶
性の弱塩基性アニオン交換体の交換基にエピハロ
ヒドリンを反応させて得た担体を用いることによ
り、イオン結合法と同様の操作で酵素と担体とを
共有結合で結合させることが可能となつた。 従つて、本発明によればイオン結合法と同様の
簡単な操作により水不溶性の弱塩基性アニオン交
換体から強固な共有結合を持つ固定化酵素が得ら
れ、その酵素活性も高く、また高い基質濃度も使
用可能となり、酵素の脱離もなくその耐久性も非
常に長いため長期間の使用が可能となつた。 又、本発明によれば弱塩基性アニオン交換体を
用いることによりエピハロヒドリンによる反応が
極めて容易に進み、更に、弱塩基性アニオン交換
体を用いることにより酵素の固定化が短時間で極
めて容易に行われ、従つて本発明の担体及び固定
化酵素は簡単な手段で製造可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基
   にエピハロヒドリンを反応させることにより得ら
   れる担体。 ２ 水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基
   にエピハロヒドリンを反応させて得られる担体に
   酵素を固定化してなる固定化酵素。