PT85718B

PT85718B - Processo para a producao de d(-) (fenil facultativamente substituido) glicinas

Info

Publication number: PT85718B
Application number: PT85718A
Authority: PT
Inventors: Lawson William Powell; John Anthony Power
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1986-09-17
Filing date: 1987-09-15
Publication date: 1990-08-31
Also published as: ES2058121T3; EP0261836B1; IE872497L; JPH0779696B2; AU603827B2; AU7843287A; DK483487D0; JPS63185382A; HK1003230A1; PT85718A; CA1298800C; DE3786511D1; DE3786511T2; NZ221808A; DK483487A; IE60591B1; DK170992B1; EP0261836A1

Description

A preparação do enzima compreende células tratadas dum organismo produtor de hidantoínese imobilizadas com ou num suporte sólido conveniente, ou um enzima derivado dum organismo adsorvido sobre ou ligado a um suporte polimérico, juntamente com iões de metal bivalente que estabilizam a preparação e a tornam capaz de reutilização.

É também referido o processo para produzir a preparação de enzima.

Este invento está relacionado com uma preparação imobilizada para uso na produção de D(-) «ç-aminoácidos por uma via enzimática e diz respeito particularmente a uma preparação para uso num processo para a produção de D(-) (fenil substituido)glicinas, tais como D(-) (p-hidroxifenil)glicina que é usado como material de partida para a produção do antibiótico amoxicilina.

É conhecido, por exemplo das Patentes UK 1452591 e 1506067 que existem muitas enzimas que são capazes de converter 5-(fenil substituido)hidantoinas em D-of-aminoácidos. As enzimas mais adequadas são produzidas por organismos bacterianos e as Patentes UK 1534426 e 1564982 divulga organismos produtores de hidantoinase que hidrolisam 5-(fenil substituido)hidantoinas em D(-)N-carbamoil-(fenil substituido)glicinas. Ainda a Patente UK 1587116 divulga um processo enzimático para a produção de D- í<-aminoácido a partir de 5-(fenil substituido)hidantoina.

É bem conhecido dentro da especialidade que a imobilização de uma célula produtora de enzima ou da enzima conduz a um licor de enzimação mais limpo eque isto é vantajoso para os subsequentes processos de extracção. A Patente U.K. 1564982 divulga que células ou células tratadas de organismos produtores de hidantoinase podem ser imobilizadas por técnicas convencionais. No entanto, na prática os sistemas imobilizados assim produzidos são ijisuficientemente estáveis para proporcionar um processo comercialmente viável. Um sistema comercialmente viável deve ser capaz de se poder re-usar durante um número suficiente de enzimações para recuperar o custo da sua preparação. Tipicamente isto andará à volta de 15 vezes.

Surpreendentemente encontrou-se que a presença de um ião metálico divalente em tal sistema de enzimas imobilizadas confere estabilidade à preparação detal

-4forma que pode ser reutilizado.

Assim, o presente invento proporciona uma preparação de enzimas imobilizados para uso na produção de uma D(-) (fenil facultativamente substítuido)glicina ou um seu derivado N-carbamoilo a partir de 5-(fenilo facultativamente substítuido)hidantoina compreendendo células ou células tratadas de um organismo que produz uma enzima hidantoinase capaz de hidrolisar 5-(fenil facultativamente substítuido)hidantoina imobilizadas dentro ou sobre um suporte adequado, ou uma enzima derivada do organismo adsorvida num suporte polimérico carregado positivamente ou ligada covalentemente a um suporte polimérico funcionalizado, juntamente com uma quantidade eficaz de um ião metálico divalente estabilizador.

A quantidade eficaz de ião metálico divalente estabilizador conforme aqui descrito dependerá do ião usado e pode variar entre uma quantidade vestigial,i.e. que permanece ligada à preparação de enzima após ter sido removido um excesso do ião metálico divalente adicionado, até por exemplo um nível de 2 mmolar quando a preparação de enzima é suspensa num meio aquoso.

Os iões metálicos divalentes estabili zadores incluem iões divalentes de metais do Grupo II da Tabela Periódica com a exclusão do zinco e de certos metais de transcrição que possam ser divalentes. Iões de metais de transcrição que possam ser divalentes. Iões de metais divalentes adequados podem incluir, por exemplo, Mn⁺⁺; Co⁺⁺, Fe⁺⁺; Ni⁺⁺ E Mg⁺⁺:

São particularmente preferidos os iões metálicos divalentes estabilizadores derivados de metais de transcrição, em particular Mn , Co e Ni .

Um ião metálico divalente particularmente preferido é Mn⁺⁺.

Pelo termo D(-)(fenil facultativamente substituído)glicina tal como aqui é usado pretende-se significar D(-)fenilglicina e D(-)(mono-, di- ou tri-fenil substituído)glicinas. Substítuintes adequados incluem hidroxilo, alquilo , alcoxilo e halogénios. D(-)(fenil substituído)glicinas preferidas incluem D(-)(p-hidroxifenil)glicina e D(-)(3,4-di-hidroxifenil)glicina.

termo 5-(fenil facultativamente substituído )hidantoina tal como aqui é usado significa 5-fenil-hidantoina ou 5-(fenil substituído)hidantoina em que o fenilo é substituído por até três grupos incluindo hidroxilo, alquilo ^CQ_g)/ alcoxilo e halogénio. São exemplos típicos 5-(4-hidroxifenil)hidantoina e 5-(3,4-di-hidroxifenil)hidantoina.

termo preparação de enzimas imobilizadas tal como aqui é usado inclui preparações imobilizadas de células totais, células rebentadas ou enzima sem células. A enzima pode ser bruta, parcialmente purificada ou purificada. De preferência a preparação de enzimas imobilizados é uma preparação de enzimas imobilizados sem células.

De preferência o organismo a partir do qual a enzima hidantoinase é obtida é um microorganismo tal como uma estirpe de Bacillus, Pseudomonas, etc., conhecidas das Patentes U.K. 1564982, 1587116 e 1534426 ou um outro organismo adequado como seja uma espécie de Mycoplana.

São suportes adequados para a imobilização de células tratadas os convencionalmente usados na especielidade tais como matrizes poliméricas incluindo poliacrilamida, poliuretano ou alginato de cálcio ou materiais

porosos orgânicos ou inorgânicos tais como pumice, alumina e folhas finas de metal.

Suportes poliméricos carregados positivamente adequados para a imobilização de enzimas sem células incluem resinas de permuta aniónica e suportes poliméricos tais como DEAE celulose. Suportes poliméricos funcionalizados adequados incluem polímeros do ácido polimetacrilico substituído funcionalizados com aldeido e materiais tais como alumina de alta densidade revestida com um complexo de polietilenimina/glutaraldeído.

Resinas de permuta aniónica adequadas incluem resinas de permuta aniónica forte ou fraca, se bem que a última seja preferida. As resinas de permuta aniónica preferida incluem as resinas de permuta aniónica fenolformaldeído Duolite A568 ou Duolite DS 17183 (obtidas da Rohm e Haas Company), as quais são funcionalizadas com aminas secundárias, resinas de polistireno funcionalizadas por aminas terciárias tais como Amberlite IRA 935 e Amberlite IRA 945 (adquiridas à Rohm e Haas Company) e Purolit A100. Outras resinas adequadas incluem Amberlite IRA 901 que é polistireno funcionalizado por iões de amónio quaternário e Lewatit OC 1037 (adquirida à Bayer AG) que é poliestireno funcionalizado por aminas primárias. Também podem ser usadas resinas de polistireno com grupos funcionais do tipo di-etanol, como sejaDiaion EX-05 (da Mitsubishi Chemical Industries).

A estabilidade pode ainda ser aumentada pela ligação inter-cruzada da preparação in situ, por exemplo com um dialdeído solúvel em água. Um agente de ligação cruzada preferido é o glutaraldeído. No caso de de enzimas imobilizados sem células o agente de ligação cruzada é vantajosamente usado num nível abaixo de cerca de 1%, de preferência a cerca de 0,2%.

De acordo com um outro aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a produção de uma D(-)(fenil facultativamente substituído)glicina ou um seu derivado N-carbamoilo pela hidrólise de 5-(fenil facultativamente substituído)hidantoina por uma enzima hidantoinase adequada na ausência de ar, caracterizado por a enzima ser fornecida na forma de uma preparação de enzima imobilizada compreendendo células ou células tratadas de um organismo produtor da enzima imobilizada dentro ou sobre um suporte adequado ou uma enzima derivada do organismo adsorvido a um suporte polimérico carregado positivamente ou ligado covalentemente a um suporte polimérico funcionalizado, juntamente com uma quantidade eficaz de um ião metálico divalente estabilizador .

É essencial que o ar seja excluído durante o processo de hidrólise e subsequentemente enquanto a preparação de células imobilizadas é recuperada e reusada. A entrada de ar verificou-se conduzir à inibição da enzima, provavelmente por produtos da degradação oxidativa da hidantoina. A reacção é de preferência desenvolvida sob um lençol de azoto ou de outro gás inerte. É preferido que azoto ou um gás raro seja também borbulhado através da mistura de reacção.

Num processo preferido do invento outras quantidades do ião metálico divalente estabilizador, num nível de 0,2-2 mmolar, por exemplo, de preferência num nível de 0,5-1,0 mmolar podem ser adicionadas à mistura de reacção. Isto serve para minimizar a redução da actividade enzimática durante a reacção.

A reacção de hidrólise é de preferência efectuada a um pH de pelo menos pH8 e mais preferêncialmente na gama de 8,5 a 9,5. Um pH preferido é cerca de 9,0. Isto é controlado no decurso da reacção por exemplo pela adi ção de uma base ou pela utilização de um tampão adequado. A reacção normalmente decorre a uma temperatura na gama de 30 a 60°C, mais preferêncialmente 40 a 50°C durante um período de 6 a 48 horas, tipicamente 12 a 24 horas.

Adequadamente a preparação de enzima imobilizada é posta em contacto com uma pasta aquosa de cerca de 5 a 25% p/v da 5-(fenil facultativamente substítuido)hidantoina,de preferência 10 a 20% p/v, mais preferêncialmente cerca de 15% p/v, juntamente com 0,2 a 2, de preferência cerca de 0,5 mmolar do ião metálico divalente. A reacção de hidrólise pode ser efectuada num reactor com tanque de agitação ou num reactor de coluna na ausência de ar.

Certas preparações de enzimas imobiliza dos do invento são capazes de hidrolisar a 5-(fenil facultativamente substítuido)hidantoina directamente para dar D(-)(fenil facultativamente substítuido)glicina. Tais preparações enzimáticas devem tipicamente ser derivadas de microorganismos descritos em GB 1587116, especialmente os pertencentes ao género Pseudomonas.

Normalmente, no entanto, as preparações de enzimas imobilizadas do presente invento hidrolisam a 5-(fenil facultativamente substituído)hidantoina para dar um intermediário D(-)N-carbamoil(fenil facultativamente substituído )glicina que pode subsequentemente ser hidrolisado para dar a correspondente D(-)(fenil facultativamente substituído )glicina.

Quando se pretende hidrolisar o intermediário D(-)N-carbamoil(fenil facultativamente substituído)glicina por um método químico, a reacção pode ser convenientemente efectuada com ácido nitroso como descrito por T. Ohas hi et al. em Agric. Biol. Chem,, 1981, 45 (4), 831-838.

Métodos enzimáticos adequados para a hidrólise de D(-)N-carbamoil(fenil facultativamente substituído )glicinas para dar D(-)(fenil facultativamente substituído )glicinas envolvem carbamoilases, como descrito, por exemplo, na Patente UK NQ 2022581.

As preparações de enzimas imobilizadas do presente invento podem ser guardadas húmidas antes de serem usadas, de preferência a temperaturas baixas como seja cerca de 4°C e podem ser reusadas. As preparações de enzimas imobilizadas do invento foram utilizadas com êxito mais de quinze vezes e certas preparações de enzimas imobilizados sem células foram reusadas quarenta ou mais vezes.

De acordo com um outro aspecto do invento um processo para a produção de uma preparação deenzimas imobilizados para uso na produção de uma D(-)(fenil facultativamente substituído)glicina ou um seu derivado N-carbamoílo compreende a imobilização de células tratadas ou não de um organismo que produz uma, hidantoinase capaz de hidrolisar uma 5-(fenil facultativamente substituído)hidantoina dentro ou sobre um suporte adequado ou pôr em contacto uma enzima derivada das referidas células com um suporte polimérico, carregado positivamente ou funcionalizado, na presença de uma quantidade eficaz de ião metálico divalente estabilizador .

As técnicas para imobilização de células tratadas ou não dentro ou sobre um suporte adequado na presença de uma quantidade eficaz de um ião metálico divalen te estabilizador são análogos às convencionalmente usadas na especialidade. Assim, as células tratadas podem ser retidas dentro de suportes adequados como sejam matrizes poliméricas incluindo poliacrilamida e poliuretano ou alginato de cálcio ou podem ser quimicamente ligadas a suportes adequados tais como materiais porosos orgânicos ou inorgânicos incluindo

pumice, alumina e folhas de metal.

De acordo com um outro aspecto do invento um processo para a produção de uma preparação de enzimas imobilizadas sem células para usar na produção de uma D(-)(fenil facultativamente substituído)glicina ou um seu derivado N-carbamoilo compreendendo a preparação de uma enzima hidantoinase capaz de hidrolisar uma 5-(fenil facultativamente substituído)hidantoina, pôr em contacto uma solução da enzima com um suporte polimérico carregado positivamente ou funcionalmente na presença de uma quantidade eficaz de um ião metálico divalente estabilizador produzindo-se assim uma preparação de enzima imobilizada e separação da preparação de enzima imobilizada de uma sua suspensão aquosa.

De preferência a enzima hidantoinase é preparada por fermentação de um microorganismo adequado num meio de fermentação apropriado. O microorganismo é meios de cultura adequados são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria e exemplos deles estão descritos na Patente U.K. 1564982, 1534426 e 1587116.

Um microorganismo preferido é Bacillus brevis IFO 12333 que pode ser cultivado no meio de cultura divulgado na Patente UK 1587116 ou meios similares. Tais meios podem vantajosamente incluir um indutor para a enzima como seja hidantoina ou DL-5-metil-hidantoina e iões metáli-L.-L J L -4--4- + + cos divalentes incluindo Mn , Mg ; Co e Fe que como foi referido estimulam a produção de hidantoinase. Num processo preferido Bacillus brevis é cultivado num meio nutritivo de sementeira durante um período adequado como seja 44 horas e depois crescido num meio de fermentação contendo um agente indutor e iões, metálicos divalentes adequados a cerca de 25°C, um pH de 7 a 8 sendo mantido durante a fase inicial do crescimento. A fermentação está completa após cerca de 44 ho ras .

As células são então colhidas, por exemplo por centrifugação, e são depois rebentadas por sonicação ou por outras técnicas conhecidas para libertar hidantoinase.

Para purificar parcialmente a enzima é preferível precipitar os ácidos nucleicos, por exemplo pela adição de sulfato manganoso a uma concentração de 2o mmolar. Para precipitar as proteínas sensíveis ao calor a enzima é aquecida a uma temperatura na gama de 50 a 65°C de preferência 55 a 60°C, durante aproximadamente 30 minutos segui· do de arrefecimento até 4°C. A solução de enzima pode então ser centrifugada para remover os detritos celulares e ácidos nucleicos e proteínas precipitados. É preferido que a solução de enzima não seja dialisada antes da absorção para se reter o ião metálico divalente. Neste caso não é necessário adicionar mais ião metálico divalente para a produção da preparação de enzima imobilizado.

Para preparar a preparação de enzima imobilizado sem células, a solução de enzima parcialmente purificada é misturada com o suporte polimerico na presença dos iões metálicos divalentes adequados. A quantidade de enzima deve ser optimizada para cada tipo de suporte polimérico e é tipicamente 3 a 7 unidades por grama de suporte. A mistura é agitada a cerca de 25°C até ter lugar a adsorção, por exemplo cerca de 24 horas.

O suporte polimerico é de preferência preparado para adsorção por lavagem em solução salina e equilíbrio a cerca de pH 8 a 9.

Para ligação cruzada de preparação de enzima imobilizada sem células é desejável filtrar a preparação da solução de adsorção e tratar com uma solução de agente de ligação cruzada a um pH na gama de 8 a 9. A preparação

-12ligada de modo inter-cruzado pode ser então lavada com água destilada e depois tampão, de preferência contendo um ião metálico divalente, antes do armazenamento a húmido em recipientes fechados de preferência a temperatura baixa como seja cerca de 4°C.

Alguns exemplos serão agora descritos.

Exemplo 1

A enzima hidantoinase foi produzida através de fermentações bacterinas do modo seguinte. 9 1 de meio de fermentação contendo os componentes que se seguem foram preparados e ajustados a pH 7,0.

Extrato de levedura 200 g

KH₂PO₄ 10 g K₂HPO₄ 10 g (NH₄)₂SO₄ 50 g MgSO₄ 5 g

FeSO₄ 0,1 g MnSO₄ 0,1 g Call₂ 0,8 g Anti-espumante 15 g

O meio foi colocado num fermentador de 12 1 e autoclavado durante 60 minutos a 121°C. Solução de 20% p/v de glucose e 2% de DL 5-metil-hidantoina foram esterilizadas separadamente e 500 mis de cada uma foi introduzido no fermentador em condições de esterilidade.

O fermentador foi inoculado com 300 mis de uma cultura de sementeira de Bacillus brevis IFO 12333 cul-13-

tivada em Tryptone Soya Broth durante 44 horas a 25°C. A fermentação foi mantida a 25°C e arejada a 6 1/min. 0 pH foi controlado a 7,0 durante 24 horas com HC1. Usou-se então hidróxido de amónio para levantar o pH até 7,5. As 28 horas o pH foi aumentado para 8,0 e depois deixou-se subir livremente .

Deixou-se decorrer a fermentação durante 46 horas sendo então as células colhidas por centrifugação. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 1,25 1 de tampão 0,2 H Tris/HCl, pH 8,5. As células foram então sonicadas para libertar a hidantoinase para a solução.

A purificação parcial da enzima foi efectuada como se segue: os ácidos nucleicos foram precipitados pela adição de MnSO^ 20 mM, a solução de enzima foi tratada pelo calor a 58°C durante 30 minutos depois arrefecida até 4°C. Após armazenamento a 4°C durante 18 horas a preparação foi centrifugada para remover os detritos celulares e precipitados os ácidos nucleicos e proteínas. A preparação fci testada para determinar a actividade de hidantoinase. Uma suspensão de DL-5-(4-hidroxifenil)hidantoina em tampão 0,2M Tris/HCl pH 8,5 foi agitada a 42°C até se dar a saturação. Uma amostra de preparação de enzima foi então adicionada e a formação de D(-)N-carbamoil—(4-hidroxifenil)glicina foi seguida por HPLC. Uma unidade de hidantoinase é definida como a quantidade de enzima que converte 1 mMole de DL-5-(4-hidroxifenil) hidantoina em D(-)N-carbamoil-(4-hidroxifenil)glicina em 1 hora .

Exemplo 2

Amostras de resinas de permuta aniónica obtidas de fontes comerciais foram lavadas durante 1 hora

em NaCl 1M e depois equilibradas durante a noite em tampão 0,2M Tris HC1 pH 8,5. As resinas equilibradas foram recuperadas por filtração e guardadas até serem necessárias. A enzima parcialmente purificada preparada como descrito no Exemplo 1 foi usada no processo de imobilização. A enzima foi deixada adsorver às resinas misturando 10 mis da solução de enzima por grama (peso molhado) de resina (3,5-7,0 unidades/ /grama de resina) durante 24 horas a 25°C. Os complexos de enzima-resina foram removidos por filtração e tratados com 1% de glutaraldeído a pH 8,5. Após 1 hora as amostras de resina foram de novo retiradas por filtração e levadas três vezes com água destilada. Finalmente, as enzima-resinas foram lavadas com tampão 0,2M Tris/HCl pH 8,5 e guardadas húmidas emrecipientes fechados a 4°C.

Cada complexo de enzima-resina preparado deste modo foi testado para determinar a sua actividade específica como descrito no Exemplo 1. A Tabela 1 mostra as actividades específicas obtidas para uma série de resinas de permuta iônica comerciais tratadas deste modo.

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Exemplo 3

440 mis da solução de enzima parcialmente purificada (actividade = 0,59 unidade/ml) conforme preparado no Exemplo 1 foi adicionado a 40 g da resina Duolite A568 . A, mistura foi agitada suavemente a 25°C durante 24 horas para permitir a adsorção da hidantoinase ao suporte. O complexo de enzima-resina foi então separado por filtração e lavado três vezes com água destilada e finalmente com tampão 0,2M Tris/HCl pH 8,5. A enzima-resina foi guardada húmida num recipiente fechado a 4°C. A enzima imobilizada foi testada como descrito no Exemplo 1 e a sua actividade específica verificou-se ser 3,9 jj/g.

200 g de DL-5-(4-hidroxifenil)hidantoina e 0,23 g de MnSO^ foram adicionados'a 1,8 1 de água destilada num recipiente com camisa. Borbulhou-se azoto através da mistura. A suspensão foi agitada, a temperatura controlada a 40°C e o pH ajustado a 8,7 com hidróxido de amónio. Após equilibrio do sistema adicionou-se 150 unidades (38,5 g do complexo enzima-resina) de hidantoinase. Deixou-se a reacção decorrer durante 24 horas e o pH foi controlado a 8,7 com hidróxido de amónio. Após 24 horas o rendimento de D(-)N-carbamoil-(4-hidroxifenil)glicina foi determinado por HPLC como sendo de 97%. O produto formado neste processo foi isolado por meios convencionais e encontrou-se possuir elevada pureza óptica.

A enzima-resina usada neste processo foi reusada 50 vezes por decantação da solução de D(-)N-carbamoil-(4-hidroxifenil)glicina no fim da reacção, tendo cuidado para manter a enzima sob um lençol de azoto e substítuindo-a com uma nova carga de suspensão de substrato pré-equilibrado. Ao longo destes ciclos os rendimentos de conversão para D(-)N-carbamoil-(4-hidroxifenil)glicina foram de 95% ou mais altos.

Exemplo 4

A enzima hidantoinase foi também imobilizada em UOP IPS -100, um suporte baseado em alumina impregnado com um complexo de polietileneimina de alto peso molecular - glutaraldeído. UOP IPS - 100 éum produto comercial de UOP Inc, Des Plaines, Illinois. 250 mis da solução de enzima parcialmente pura preparado como descrito no Exemplo 1 (actividade = 0,23 unidades/ml)' foi adicionado a 7,5 g de suporte UOP. A mistura foi agitada suavemente a 25°C durante 18 horas. O complexo enzima-supõrte assim formado foi separado por filtração e foi então lavado com água destilada seguido de tampão 0,2M Tris/HCl pH 8,5. A enzima imobilizada foi testada usando o processo convencional descrito no Exemplo 1 e encontrou-se ter uma actividade específica de 4,68 unidades/g. A enzima insolubilizada foi guardada húmida num recipiente fechado a 4°C.

Exemplo 5

8Ό0 litros de células contendo hidantoinase de Bacillus brevis IFO 12333 foram cultivados usando o meio descrito no Exemplo 1. O indutor, 5-metil-hidántoina, foi esterilizado e os iões metálicos foram dissolvidos em água desionizada e adicionados ao meio imediatamente antes da esterilização. Adicionou-se glucose como solução estéril ) a 40% p/p paradar uma concentração final de 1% p/v. O meio foi inoculado com células cultivadas durante 36 horas a 25°C em 12 balões de agitação cada um contendo 400 ml de Tryptone Soya Broth. A fermentação decorreu a 25°C com uma pressão de 1,0 bar e um fluxo de ar de 0,3 v.v. ml~^. O pH foi mantido abaixo de 7,0 durante as primeiras 36 horas após o que foi subido para 7,5 até às 48 horas. 0 rendimento de células final foi de 6% com uma actividade específica de 1,8 μ/g.

Colheram-se as células usando uma centrífuga de fluxo contínuo Westphalia e à pasta de células resultante (100 1) foi aumentado o pH para 8,5 com uma solução de amónia antes da homogeneização numa máquina APV Manton-Gaulin (K6). O homogenato foi então diluido para 270 1 com água desmineralizada seguido da adição de Μηεο^’ΊΡ^Ο para 20 mM, o pH sendo mantido a 8,5-8,6 com solução de amónia. Isto foi seguido de tratamento pelo calor a 60°C durante 1 hora. O homogenato floculado foi então arrefecido para 30°C e clarificado por passagem através de uma centrífuga de fluxo contínuo.

8,2 kg de resina de permuta aniónica Duolite A568 que foi préviamente lavada com NaCl 1M e ajustada a pH 8,5 durante 1 hora com NH^OH foi adicionado a 130 litros de solução de enzima clarificada com uma actividade de 189 μ/litro. A adsorção da enzima à resina decorreu durante 20 horas com agitação o pH foi mantido a 8,5 com NH^OH. A resina foi então recuperada e adicionada a 100 litros de solução de glutaraldeído a 0,2% p/v a pH 8,5. O processo de ligação cruzada ocorreu durante 1 hora com agitação. A enzima-resina foi então recuperada por filtração e lavada com tampão 0,05M Tris/HCl pH 8,5 contendo MnSO^ 1 mM durante 30 mins. Recuperou-se 8,6 kg de enzima-resina com uma actividade específica de 1,7 μ/kg.

Exemplo 6

6,65 kg da enzima-resina com uma actividade de 1,1 μ/g preparado pelo método descrito no Exemplo 5 foi usado para hidrolisar 9,75 kg de DL-5-(4-hidroxifenil)hidantoina em 65 litros de água desmineralizada contendo 11 g de MnSO^. a reacção de hidrólise foi efectuada durante 23 ho-19-

ras a 40°C e pH 9,3-9,5 com sendo borbulhado através da mistura para excluir oxigénio. No fim da reacção mediu-se um rendimento de 96,4% de D(-)N-carbamoil(4-hidroxifenil) glicina.

Exemplo 7

A enzima-resina no Exemplo 6 foi usada para efectuar 12 hidrólises de DL-5-(4-hidroxifenil)hidantoina a 10% com um rendimento médio de 96,4% e mais 11 reacções com substrato a 15% com um rendimento médio de 95,6%.

Exemplo 8 células de Bacillus brevis IFO 12333 cultivadas usando o meio descrito no Exemplo 1 foram colhidas por centrifugação a partir de seis litros de caldo de fermentação. Ressuspenderam-se as células para 500 ml em tampão O,1M Tris pH 9,0 e misturou-se depois com 500 ml de Protanal LP/10/60 (Protan, Drammen, Nomega) a 6% p/v. A suspensão de células foi então passada através de uma agulha de seringa para um banho de solução de cloreto de cálcio 0,lM onde as células imobilizadas em alginato de cálcio foram precipitadas e recuperadas como um fio numa canilha. O peso final das células imobilizadas foi de 787,4 g.

Uma porção das células imobilizadas (330g) foi usada para hidrolisar 100 g de DL-5-(4-hidroxifenil)-hidantoina em um litro de água contendo 0,44 g de MnSO^.

A reacção de hidrólise foi efectuada durante 23 horas a50°C e pH 9,1 com a ser borbulhado através da mistura para excluir o oxigénio. O pH foi controlado pela adição de de NaOH 5M. No fim da reacção mediu-se um rendimento de 40% de D(-)N-carbamoil(4-hidroxifenil)glicina.

Claims

REIVINDICAÇÕES li. - Processo para a produção duma D(-)(fenil facultativamente substituído)glicina ou seu derivado N-carbamoilo por hidrólise de 5-(fenil facultativamente substituído)-hidantoina por um enzima hidantoinase conveniente na ausência de ar, caracterizado por o enzima ser fornecido na forma duma preparação enzimática imobilizada compreendendo células ou células tratadas dum organismo produtos do enzima imobilizado dentro ou sobre um suporte conveniente, ou um enzima derivado dum Organismo adsorvido num suporte polimérico carregado positivamente ou covalentemente ligado a um suporte polimérico funcionalizado, juntamente com uma quantidade eficaz dum ião metálico bivalente estabilizante.
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o enzima imobilizado estar isento de células.
3â. - Processo de acorda com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 caracterizado por o enzima ser obtido a partir duma estirpe de Bacillus, Pseudomonas ou Mycoplana.
4ê. - Processo de acordo'com a reivindicação 3 caracterizado por o enzima ser obtido a partir do Bacillus brevis IFO 12333.
5^. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o ião de metal bivalente ser escolhido a partir do grupo que consiste em Mn⁺⁺, Co⁺⁺, Fe⁺⁺, Ni⁺⁺ e Mg⁺⁺.
6ê. - Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado poro ião metálico bivalente ser o
7â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por o enzima estar ligado ao suporte por ligação cruzada.
8â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 caracterizado por se produzir D(-)(4-hidroxifenil)glicina ou D-(-)N-carbamoil(4-hidroxifenil)glicina.
9a. - Processo para a produção de uma preparação de enzima imobilizado para utilização na produção de umaD(-)(fenil facultativamente substituido)glicina ou seu derivado N-carbamoilo, caracterizado por compreender a imobilização de células tratadas ou não tratadas dum organismo que produza uma hidantoinase capaz de hidrolisar uma 5-(fenil facultativamente substituido)-hidantoina cornou sem um suporte conveniente, ou fazendo contactar um enzima derivado das referidas células com um suporte polimérico carregado positivamente ou funcionalizado na presença duma quanti·

-23dade' eficaz duni ião metálico bivalente estabilizador.
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Processo de acordo com a reivin dicação 9 caracterizado por a preparação de enzima imobilizado se encontrar livre de células e por o processo adicionalmente compreender a separação da preparação enzimática imobilizada duma sua suspensão aquosa.