JPS63185382A - 新規調整物及びその製法 - Google Patents

新規調整物及びその製法

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JPS63185382A
JPS63185382A JP62231965A JP23196587A JPS63185382A JP S63185382 A JPS63185382 A JP S63185382A JP 62231965 A JP62231965 A JP 62231965A JP 23196587 A JP23196587 A JP 23196587A JP S63185382 A JPS63185382 A JP S63185382A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素的経路によるＤ　（−）α−アミノ酸の製
造において使用される固定化調製物に関し、とシわけ抗
生物質アモキシリンを製造する際の出発物質として使用
されるＤ（−＞（Ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンの
ようなり　（−）　（置換フェニル）グリシンの製法に
おいて有用な調製物に関する。
（従来の技術） ５−（置換フェニル）ヒダントイン化合物をＤ−α−ア
ミノ酸に転化しうる多くの酵素が存在することは、例え
ば英国特許第１４５２５９１号および同第１５０６０６
７号から知られている。大多数の適当な酵素は細菌によ
って産生され英国特許第１５３４４２６号および同第１
５６４９８２号は５−（置Σ 換フェニル）ヒダントイン化合物Ｄ（−）Ｎ−カルバモ
イル−（置換フェニル）グリシンに加水分解するヒダン
トイナーゼ産生生物を開示している。
さらに英国特許第１５８７１１６号は５−（置換フェニ
ル）ヒダントインからＤ−α−アミノ酸を製造する酵素
的方法を開示している。
酵素産生細胞または酵素の固定化が比較的きれい々酵素
反応液をもたらし、その後の抽出工程において有利であ
ることは、当分針でよく知られている。英国特許第１５
６４９８２号は、ヒダントイナーゼ産生生物の細胞また
は処理細胞が慣用技術により固定化されることを示して
いる。しかじなから、実際にはこのようにして作られた
固定化系は商業的に実行しうる方法を提供するのに十分
なほど安定ではない。商業的に実行しうる系は、その調
製物のコストを回収するのに十分な回数の酵素反応のた
めに再利用できるものでなければならない。一般にこれ
は１５回位であるだろう。
（発明が解決しようとする問題点） 驚くべきことに、このような固定化酵素系中に２価金属
イオンが存在すると、その調製物が安定化されて再利用
可能となることが見出された。
従って、本発明は適当々支持体内または支持体上に固定
化された５−（任意置換フェニル）ヒダントインを加水
分解しうるヒダントイナーゼ酵素を産生ずる生物の細胞
または処理細胞、もしくはの酵素と、有効量の安定化用
２価金属イオンと、から成る５−（任意置換フェニル）
ヒダントインからＤ（−）（任意置換フェニル）グリシ
ンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体を製造するのに有
用な固定化酵素調製物を提供する。
（問題点を解決するための手段） ここに記載される安定化用２価金属イオンの有効量は使
用するイオンに依存し、微量（すなわち添加された２価
金属イオンの過剰量を除去した後（；酵素調製物に結合
して残存する量）から、例えば２ミリモル（酵素調製物
を水性媒体中に懸濁する場合）のレベルまでの範囲内で
変化しうる。
安定化用２価金属イオンには周期表の第■族金属（但し
亜鉛を除外する）および２価であシうるある種の遷移金
属の２価イオンが含まれる。適当な２価金属イオンは例
えばＭｎ＋＋，Ｃｏ＋＋、Ｆｅ＋＋ｔＮｉ＋＋およびＭ
ｇ＋＋でちる。好適な安定化用２価金属イオンは遷移金
属の２価イオンであシ、特にＭｎ”ｓＣｏ＋＋およびＮ
１　　　である。最適な２価金属イオンはＭｎ　　　で
ある。
本明細書中で用いるＤ　（−）　（任意置換フェニル）
グリシンなる用語は、Ｄ　（−）フェニルグリシンおよ
びＤ　（−）　（モノ−、ジーまたはトリー置換フェニ
ル）グリシンを意味する。適当な置換基にはヒドロキシ
基、ｃＩ−６アルキル基ｓ　Ｃ１−６アルコキシ基およ
びハロゲン原子が含まれる。好適なり（−）（置換フェ
ニル）グリシンにはＤ（−）（ｐ−ヒドロキシフェニル
）グリシンおよヒＤ（−）（３，４−ジヒドロキシフェ
ニル）グリシンが含まれる。
本明細書中で用いる５−（任意置換フェニル）ヒダント
インなる用語は、５−フェニルヒダントインまたはフェ
ニル基が３個以下の基（ヒドロキシ基、ＣＩ　”’　６
アルキル基、Ｃｌ−６アルコキシ基およびハロゲン原子
を含む）で置換された５−（置換フェニル）ヒダントイ
ンを意味する。代表例は５−（４−ヒドロキシフェニル
）ヒダントインおｊび５−（３，４−ジヒドロキシフェ
ニル）ヒダントインである。
本明細書中で用いる“固定化酵素調製物”なる用語は完
全細胞、破壊細胞または無細胞（細胞不含）酵素の固定
化調製物を意味する。酵素は粗製のもの、部分精製した
もの、または精製したもののいずれであってもよい。好
ましくは固定化酵素調製物は固定化された無細胞酵素調
製物である。
ヒダントイナーゼ酵素を産生ずる生物は、好ましくは英
国特許第１５６４９８２号、同第１５８７１１６号およ
び同第１５３４４２６号に記載されるバチルス属、シュ
ードモナス属の菌株のような微生物、またはマイコプラ
ナ種のような他の適当な生物である。
細胞または処理細胞を固定化するのに適した支持体はポ
リアクリルアミド、ポリウレタンまたはアルギン酸カル
シウムを含めたポリマー基材、もしくは軽石、アルミナ
および金属箔のような多孔質の無機または有機材料など
の当分針で通常使用されるものである。
無細胞酵素を固定化するのに適した正に荷電したポリマ
ー支持体には、陰イオン交換樹脂およびＤＥＡＥセルロ
ースのようなポリマー支持体が含まれる。適当な官能化
ポリマー支持体にはアルデヒドで官能化された置換ポリ
メタクリル酸重合体、およびポリエチレンイミン／グル
タルアルデヒド複合体で被覆された高密度アルミナのよ
うな材料が含まれる。
適当な陰イオン交換樹脂には強陰イオン交換樹脂と弱陰
イオン交換樹脂が含まれるが、後者が好ましい。好適な
陰イオン交換樹脂には第三アミンで官能化されたフェノ
ール−ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂デュオライト
（Ｄｕｏｌｉｔｅ　）　Ａ３６８またはデュオライトＤ
８１７１８３　（ローム・アンド・ハース社から入手可
能）、アンバーライト（ｋ油ｅｒｌｉｔｅ　）　ＩＲＡ
９３５やアンバーライトＩＲＡ９４５（ローム・アンド
・ハース社から入手可能）のような第三アミンで官能化
されたポリスチレン樹脂、およびプロリット（Ｐｕｒｏ
ｌｉｔ　）　Ａ１００が含まれる。その他の適当な樹脂
には第四アンモニウムイオンで官能化されたポリスチレ
ンのアンバーライ）　ＩＲＡ　９０１．および第一アミ
ンで官能化されたポリスチレンのレワタイト（Ｌｅａ＃
ｔｉｔ　）　ＱＣ１０３７（ベイヤーＡＧから入手可能
）が含まれる。
ジェタノール型の官能基をもつポリスチレン樹脂例えば
ダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ　）　ＥＸ−０５（三菱化
学工業から入手可能）もまた使用し得る。
安定性はその調製物をその場で、例えば水溶性ジアルデ
ヒドを用いて、架橋することによりさらに高められる。
好適な架橋剤はグルタルアルデヒドである。固定化され
た無細胞酵素の場合、その架橋剤は約１％以下、好まし
くは約０．２％のレベルで有利に使用される。
本発明の別の面によれば、空気の不在下に適当なヒダン
トイナーゼ酵素で５−（任意置換フェニル）ヒダントイ
ンを加水分解することによるＤ（−）（任意置換フェニ
ル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導体の製法
が提供され、その際上記酵素は適当な支持体内または支
持体上に固定化された該酵素を産生ずる生物の細胞また
は処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体上に
吸着されたあるいは官能化ポリマー支持体に共有結合さ
れた上記生物由来の酵素と、有効量の安定化用２価金属
イオンと、から成る固定化酵素調製物の形で提供される
点に特徴がある。
加水分解工程の間と固定化細胞調製物を回収して再利用
する間は、空気を排除することが必要である。空気の侵
入は、恐らくヒダントインの酸化的分解産物による、酵
素の阻害へ導くことが判明した。この反応は好ましくは
窒素や他の不活性ガスの雰囲気下で行われる。窒素また
は希ガスを反応混合物中に吹き込むことも好適である。
好適な本発明方法では、０．２〜２ミリモル好まＬ　＜
　Ｉｒｉ　Ｏ，ｓ〜１．０ミリモルのレベルの安定化用
２価金属イオンが反応混合物に添加される。これは反応
中の酵素活性の低下を最小限に抑えるのに役立つ。
加水分解反応は好ましくは少なくともｐＨ８、よシ好ま
しくはｐＨ８，５〜ｐＨ９，５の範囲内で実施される。
好適なｐＨは約９．０である。これは例えばアルカリの
添加または適当な緩衝剤の使用により、反応の間中制御
される。一般に反応は３０〜６０°Ｇ最も好ましくは４
０〜５０℃の温度で、６〜４８時間一般には１２〜２４
時間行われる。
固定化酵素調製物は約５〜２５　ｗ／　ｖチ、好ましく
は１０〜２０　ｗ／ｖチ、よシ好ましくは約１５　ｗ／
ｖ％の５−（任意置換フェニル）ヒダントインの水性ス
ラリーおよび０．２〜２ミリモル好ましくは約０．５ミ
リモルの２価金属イオンと接触させる。加水分解反応は
攪拌タンク反応器または塔反応器中で空気の不在下に行
われる。
本発明のある種の固定化酵素調製物は５−（任意置換フ
ェニル）ヒダントインをＤ　（−）　（任意置換フェニ
ル）グリシンに直接加水分解することができる。このよ
うな酵素調製物は一般に英国特許第１５８７１１６号に
記載される微生物、特にシュードモナス属に属するもの
から誘導される。しかしながら、本発明の固定化酵素調
型物は通常５−（任意置換フェニル）ヒダントインを中
間体Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フェニル）グ
リシンに加水分解し、次いでこの中間体は所望により化
学的または酵素的方法により加水分解されて対応するＤ
　（−）　（任意置換フェニル）グリシンを生成する。
中間体Ｄ（−）Ｎカルバモイル（任意置換フェニル）グ
リシンを化学的方法で加水分解する場合、その反応はオ
ーハシ（Ｔ、０ｈａｓｈｉ　）ら、Ａｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　、　１９８１．４５（４）、
８３１−８３８に記載される如く亜硝酸を用いて有利に
実施される。Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル（任意置換フエ
ニＡ／）グリシンＤ（−）（任意置換フェニル）グリシ
ンに加水分解する適当な酵素的方法は、例えば英国特許
第２０２２５８１号に記載されるカルバモイラーゼを使
用する。
本発明の固定化酵素調製物は使用前に湿った状態で、好
ましくは低温（例えば約４℃）で貯蔵され、その後再利
用される。本発明の固定化酵素調製物は１５回以上首尾
よく利用でき、ある種の好適な固定化無細胞酵素調製物
は４０回またはそれ以上再利用することができた。
本発明のさらに別の面によれば、Ｄ　（−）　（任意置
換フェニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導
体を製造するのに有用な固定化酵素調型物の製法が提供
され、その方法は５−（任意置換フェニル）ヒダントイ
ンを加水分解しうるヒダントイナーゼを産生ずる生物の
処理細胞または未処理細胞を適当な支持体内もしくは支
持体上に有効量の安定化用２価金属イオンの存在下で固
定させるか、あるいは上記生物由来の酵素と正に荷電し
たまたは官能化されたポリマー支持体とを有効量の安定
化用２価金属イオンの存在下で接触させることから成る
。
処理細胞または未処理細胞を有効量の安定化用２価金属
イオンの存在下で適当な支持体内または支持体上に固定
化する技法は、当分野で通常使用される技法と類似して
いる。こうして処理細胞はポリアクリルアミド、ポリウ
レタンおよびアルギン酸カルシウムを含めたポリマー基
材のような適当な支持体内に閉じ込められるか、あるい
は軽石、アルミナおよび金属箔を含めた多孔質の無機ま
たは有機材料のような適当な支持体へ化学的に結合され
る。
本発明のさらに別の面によれば、Ｄ　（−）　（任意置
換フェニル）グリシンまたはそのＮ−カルバモイル誘導
体の製造において有用な固定化無細胞酵素調製物の製法
が提供され、その方法は５−（任意置換フェニル）ヒダ
ントインを加水分解しうるヒダントイナーゼ酵素を調製
し、その酵素の溶液と正に荷電したまたは官能化された
ポリマー支持体とを有効量の安定化用２価金属イオンの
存在下で接触させて固定化酵素調製物をつくシ、そして
固定化酵素調製物をその水性懸濁液から分離することか
ら成る。
ヒダントイナーゼ酵素は好ましくは適当な発酵培地中で
の適当な微生物の発酵により産生される。
適当な微生物および培地は当分野で習熟した者によく知
られておシ、その例は英国特許第１５６４９８２号、同
第１５３４４２６号および同第１５８７１１６号に記載
されている。
１つの好適な微生物は英国特許第１５８７１１６号に記
載の培地または類似の培地中で生育するバチルス・プレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）　ＩＦＯ１
２３３３である。上記培地は有利にはその酵素の誘導物
質（例えばヒダントインまたはＤＬ−５−メチルヒダン
トイン）およびヒダントイナーゼ生産を刺激すると報告
された２価金属イオン（例えばＭｎ＋＋＋Ｍｇ→＊　Ｃ
ｏ＋＋およびＦｅ＋＋）を含有する。好適な方法では、
バチルス・プレビスを栄養種培地中で適当な期間（例え
ば４４時間）生育させ、その後誘導物質および適当な２
価金属イオンを含む発酵培地巾約２５℃で生育させる。
初期成長期の間は声を７〜８に維持する。発酵は約４４
時間後に完了する。
その後細胞を例えば遠心により収穫し、次に超音波処理
または当分野で知られた他の技術にょシ細胞を破壊して
ヒダントイナーゼを放出させる。
この酵素を部分精製するために、例えば硫酸マンガンを
２０ミリモルの濃度になるまで添加して、核酸を沈殿さ
せることが好ましい。熱に不安定なタンパク質を沈殿さ
せるためには酵素を５０〜６５℃好ましくは５５〜６０
℃の温度で約３０分間加熱し、その後４℃に冷却する。
次に酵素溶液は遠心して細胞破砕物を除き、核酸とタン
パク質を沈殿させる。酵素溶液は２価金属イオンをその
まま保持させるために、吸着に先立って透析を行わない
ことが好ましい。この場合には固定化酵素調製物の製造
のために２価金属イオンを新たに添加する必要がない。
固定化された無細胞酵素調製物を製造するために、部分
精製した酵素溶液は適当な２価金属イオンの存在下でポ
リマー支持体と混合される。酵素の負荷量はそれぞれの
型のポリマー支持体につぃて最適化されねばならず、一
般には支持体ＩＩにつき３〜７単位である。この混合物
は吸着が生じるまで（例えば約２４時間）約２５℃で攪
拌される。ポリマー支持体は食塩水中で洗ったのち約声
８〜９に平衡化して、吸着のために予備処理することが
望ましい。
固定化無細胞酵素調製物を架橋するために、その調製物
を吸着溶液から炉取し、ｐＨ８〜９において架橋剤の溶
液で処理することが望ましい。その後架橋された調製物
は蒸留水で洗い、さらに緩衝液（好ましくは適当な２価
金属イオンを含む）で洗ったのち、密閉容器中に低温（
約４℃）で湿った状態のまま貯蔵される。
今や、いくつかの実施例を以下に説明する。
実施例１ ヒダントイナーゼ酵素は次の方法を用いて細菌発酵によ
り生産した。以下の鎖成分： 酵母エキス　　　　　２００Ｉ ＫＨ２）Ｐｏ４１０１１ に２ＨＰＯ４１０ｇ （ＮＨ４）ｚｓｏ４　　　　　　　　５０．！ｉ’′Ｍ
ｇＳＯ４５ｇ ＦｅＳＯ４０１ｇ Ｍｎ５ｏ４　　　　　　　　　　　　　　０１．！ｉ’
ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　０Ｂ＆消泡剤　
　　　　　　　１５．Ｆ を含む発酵培地９１を用意して、ｐ）１７．０に調整し
た。この培地を１２７の発酵槽に入れ、１２１°Ｃで６
０分間オートクレーブ滅菌した。２０　ｗ／ｖ　％グル
コース溶液および２％ＤＬ−５−メチルヒダントイン溶
液を別々に滅菌し、それぞれ５００−ずつを無菌条件下
で発酵槽に加えた。
発酵槽には、トリプトン・ツヤ・プロス（Ｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ　５ｏｙａ　Ｂｒｏｔｈ　）上にて２５℃で４４時
間生育させたバチルス・プレビスＩＦＯ１２３３３ノ種
培養物を接種した。発酵は２５℃に保ち、６１／分で通
気した。…は２４時間の間ＨＣＡで７．０に制御し、そ
の後水酸化アンモニウムを用いてｐＨ７，５に上げ、２
８時時間区ｐＨ８，０に上げ、その後は自由に上昇させ
た。
発酵を４６時間行ったあと、細胞を遠心によ）溶液中に
ヒダントイナーゼを放出させた。
酵素の部分精製は次のように行った： ２０ｍＭ　ＭｎＳＯ４の添加により核酸を沈殿させ、そ
の酵素溶液を５８℃で３０分間加熱処理し、その後４℃
に冷却した。４℃で１８時間貯蔵後、この調製物を遠心
して細胞破砕物を除き、核酸とタンパク質を沈殿させた
。この調製物はヒダントイナーゼ活性を測定するために
検定した。０．２Ｍ’）’Ｊス／　ＨＣ／緩衝液（ｐＨ
８，５）中の１チＤＬ−５−（４−ヒドロキシフェニル
）ヒダントインの懸濁液ヲ４２℃で飽和が生じるまで攪
拌した。次いで酵素調製物のアリコートを加え、Ｄ（−
）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフェニル）グリ
シンの生成をＨＰＬＣで調べた。１単位のヒダントイナ
ーゼはＤＬ−５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダント
イン１ミリモルをＤ（−）Ｎ−カルバモイル−１（４−
ヒドロキシフェニル）グリシンに１時間で転化する酵素
の量として定義される。
実施例２ 商業的供給源から入手した陰イオン交換樹脂のして必要
になるまで貯蔵した。実施例１に記載の如く調製した部
分精製酵素は固定化方法において使用した。樹脂１ｇ（
湿潤重量）当たシ酵素溶液ｌＱｍ７（３，５〜７．０単
位／ｇ樹脂）を２５℃で２４時間混合することにより、
酵素を樹脂に吸着させた。この酵素−樹脂複合体を戸数
し、ｐＨｓ、　５にて１チグルタルアルデヒドで処理し
た。１時間後樹脂サンプルを再度戸数し、蒸留水で３回
洗浄した。最後に、酵素−樹脂複合体を０．２　Ｍ　ト
リス／　ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，５）で洗い、密閉容器
中に４℃で湿った状態のまま貯蔵した。
この方法で製造したそれぞれの酵素−樹脂複合体は、実
施例１に記載のようにその比活性を測定すべく検定した
。表１はこの方法で処理した一連の市販のイオン交換樹
脂に対して得られた比活性を示す。
実施例３ 実施例１で調製した部分精製酵素溶液（活性＝０．５９
単位／１ｒＬｌ）４４０−をデュオライトＡ３６８樹脂
４０ｇに添加した。この混合物を２５℃で２４時時間中
かに攪拌してヒダントイナーゼを支持体に吸着させた。
次いで酵素−樹脂複合体を濾過によ部分離し、蒸留水で
３回洗い、最後に０．２Ｍトリス／ＨＣｊｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）で洗った。この酵素−樹脂は密閉容器中に４
℃で湿った状態のまま貯蔵した。固定化酵素は実施例１
のようにして検定し、その比活性は３．９　ｕ　／　９
であった。
ＤＬ−５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン２
００ｇおよびＭｎＳＯ４０，２３、ｊｉ［をジャケット
付き容器中の蒸留水１．８）に加えた。窒素ガスをこの
混合物に吹き込んだ。この懸濁液を攪拌し、温度を４０
℃に制御し、水酸化アンモニウムで声８．７に調整した
。この系を平衡化した後、１５０単位のヒダントイナー
ゼ（酵素−樹脂複合体３８．５１）を加えて２４時間反
応させ、その間水酸化アンモニウムでｐＨ８，７に調整
した。２４時間後、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル−（４−
ヒドロキシフェニル）グリシンの収率は９７チであるこ
とがＨＰＬＣにより測定された。この方法で製造した生
成物は慣用手段で単離することができ、高い光学純度を
もつことが判明した。
この方法で使用した酵素−樹脂は、反応の終了時に酵素
を窒素雰囲気下に保つよう注意しなからＤ（−）Ｎ−カ
ルバモイル−（４−ヒドロキシフェニル）グリシンをデ
カントし、その代わシに予め平衡化しておいた基質懸濁
液を新たに装填することによ９５０回再利用した。これ
らのサイクル全体を通して、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイル
−（４−ヒドロキシフェニル）グリシンへの転化率は９
５％またはそれ以上でおった。
実施例４ させたアルミナ系支持体ＵＯＰ　ＩＰＳ−１００上に固
定化した。ＵＯＰ　ＩＰＳ−１００はイリノイ州デスプ
レイネス、ＵＯＰ社の商品である。実施例１のようにし
て調製した部分精製酵素溶液（活性＝　０．２３単位／
ｍ１）２５ＱＴＬｌをＵＯＰ支持体７．５ｇに加えた。
この混合物を２５℃で穏やかに１８時間攪拌した。
このようにして形成された酵素−支持体複合体は濾過に
よ部分離し、蒸留水次いで０．２　Ｍ　）　ＩＪス／Ｈ
Ｃ／緩衝液（ｐＩ（８，５）で洗った。この固定化酵素
は実施例ＩＫ記載の標準方法により検定して、４．６８
単位／ｇの比活性をもつことがわかった。
この不溶化酵素は密閉容器中に４℃で湿った状態のまま
貯蔵した。
実施例５ バチルス・プレビスＩＦＯ１２３３３のヒダントイナー
ゼ含有細胞８００リツトルを実施例１に記載の培地で生
育させた。誘導物質５−メチルヒダントインは培地中で
滅菌し、金属イオンは脱イオン水に溶解して滅菌直前に
培地に加えた。グルコースは滅菌４ｏ　ｗ／ｌチ溶液と
して加え、最終濃度をｌＷ／Ｖ％とした。トリプトン・
ツヤ・ブロス４００づを含む１２個の振とりフラスコ中
２５℃で３６時間生育させた細胞を上記培地に接種した
。１．０バールの圧力および０．３ｖ、ｖ、ｍ’の空気
流下に２５℃で発酵させた。ｐＨは最初の３６時間の間
７．０以あり、その比活性は１．８ｕ／ｇ　であった。
細胞はウニストンアリア・デスラッシング（Ｗｅｓｔｐ
ｈａｌｉａ　ｄｅｓｌｕｄｇｉｎｇ　）遠心機を使って
収穫し、得られた細胞スラリー（１００／）はＡＰＶマ
ントン−ゴーリン（Ｎ６）装置でホモジナイゼーション
（均質化）するのに先立ってアンモニア溶液でｐＨ８，
５に上昇させた。その後ホモジネートを軟化水で２７０
１３に希釈し、続いてＭｎＳＯ４・４Ｈ２０を２０ｍＭ
になるまで加え、聞をアンモニア溶液で８．５〜８．６
に維持した。引き続いて６０℃で１時間熱処１理した。
その後凝集したホモジネートを３０℃に冷却し、デスラ
ッシング遠心機を通過させて澄明化した。
Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌで洗浄し且つＮＨ４０Ｈで１時間にわ
たってｐＨ８，５に調整した陰イオン交換樹脂デュオラ
イ）　Ａ３６８８．２　ｋｇを、澄明化した酵素溶液（
活性＝１８９　ｕ／ｌ）　１３０　ｌに加えた。酵素の
樹脂への吸着はＮＨ４ＯＨで１）Ｉ（８，５に保ちなが
ら攪拌下で２０時間にわたって行った。その後樹脂を濾
過により回収し、ｐＨ８，５で０．２ｗ／ｖ４グルタル
アルデヒド溶液１００）に加えた。架橋反応は攪拌しな
がら１時間行った。次いで酵素−樹脂を濾過により回収
し、１　ｍＭ　Ｍｎ　Ｓ　Ｏ４を含む０．０５Ｍ　）リ
ス／　Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ８，５）で３０分間洗った。
１．７ｕ／９の比活性をもつ酵素−樹脂８．６　ｋｇを
回収した。
実施例６ 実施例５に記載の方法で製造した酵素−樹脂（活性：　
１．１ｕ／ｇ）　６．６５　＃を用いて、ＭｎＳＯ４１
１ｙを含む軟化水６５１中でＤＬ−５−（４−ヒドロキ
シフェニル）ヒダントイン９．７５ｋｇを加水分解した
。加水分解反応はこの混合物にＮ２　　を吹き込んで酸
素を排除しながら４０℃、ｐＩ４９．３〜９．５で２３
時間行った。反応の終了時に、Ｄ（−）Ｎ−カルバモイ
ル−（４−ヒドロキシフェニル）クリシンの収率は９６
．４係であると測定された。
実施例７ 実施例６の酵素−樹脂を使用して、１０％ＤＬ−５−（
４−ヒドロキシフェニル）ヒダントインを１２回加水分
解して平均収率９６，４％を得、その後さらに１５％基
質を１１回加水分解して平均収率９５．６チを得た。
実施例８ 実施例１に記載の培地で生育させたバチルス・プレビス
ＩＦＯ１２３３３の細胞を遠心により発酵プロス６１か
ら収穫した。その細胞を０．１　Ｍ　）　リス緩衝液（
ｐｔ４９．０　）　５００ｒａｌ中に再懸濁し、次いで
６ｗ／ｖ％プロタナー７’　（Ｐｒｏｔａｎａｌ　）　
ＬＰ／１０／６０　（ノルウェー、ドラムメン、プロタ
ン社）５００−と混合した。この細胞、懸濁液を注射針
で吸い上げて０、１　Ｍ塩化カルシウム溶液の浴中に入
れ、アルギン酸カルシウム中に固定化された細胞を沈殿
させてスプール上に糸として回収した。固定化細胞の最
終重量は７８７．４　ｇであった。
固定化細胞の一部（３３０ｇ）を使用して、胤ＳＯ４０
，４４ｇを含む水１１中でＤＬ−５−（４−ヒドロキシ
フェニル）ヒダントイン１０（ｌを加水分解した。加水
分解反応はこの混合物にＮ２を吹き込んで酸素を排除し
ながら５０℃、ｐＨ９，１で２３時間行った。聞は５Ｍ
　ＮａＯＨを添加して調整した。反応の終了時に、Ｄ（
−）Ｎ−カルバモイル−（４−ヒドロキシフェニル）グ
リシンの収率は４０チであると測定された。
代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 信１名 （至） 手続押１ｊ正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭２ス一カ７７／４号 ３、補正をする者 事件との関係　　出　願　入 住　所　イギリス国、ミドルセックス州、ブレンドフォ
ード、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番
地なし）名　称　ビーチャム・グループ・ビーエルシー
４、代理人 居　所　東京都中央区日本橋兜町１２番１号大洋ビル５
、補正により増加する発明の数　　な　し補正の内容 １、事件の表示 特願昭６２−２３１９６５号 ２、発明の名称 新規調整物及びその製法 ３、補正をする者 事件との関係　　出　願　人 住　所　イギリス国、ミドルセックス州、ブレンドフォ
ード、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番
地なし）名　称　ビーヂャム・グループ・ピーエルシー
４、代理人 ５、補正命令の日付　昭和６３年２月２３日（発送）６
、補正により増加する発明の数　　な　し１、明細書第
１頁記載の発明の名称を次のように改める。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）５−（任意置換フェニル）ヒダントインからＤ（
    −）（任意置換フェニル）グリシンまたはそのＮ−カル
    バモイル誘導体を製造するのに有用な固定化酵素調製物
    であって、適当な支持体内または支持体上に固定化され
    た５−（任意置換フェニル）ヒダントインを加水分解し
    うるヒダントイナーゼ酵素を産生する生物の細胞または
    処理細胞、もしくは正に荷電したポリマー支持体に吸着
    されたまたは官能化ポリマー支持体に共有結合された上
    記生物由来の酵素、並びに有効量の安定化用２価金属イ
    オンから成る上記の固定化酵素調製物。
  2. （２）固定化酵素は細胞を含まない特許請求の範囲第１
    項記載の調製物。
  3. （３）酵素はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュー
    ドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはマイコプ
    ラナ属（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）の菌株から得られる特許
    請求の範囲第１項または第２項記載の調製物。
  4. （４）酵素はバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂ
    ｒｅｖｉｓ）ＩＦＯ１２３３３から得られる特許請求の
    範囲第３項記載の調製物。
  5. （５）２価金属イオンはＭｎ＾＋＾＋，Ｃｏ＾＋＾＋，
    Ｎｉ＾＋＾＋およびＭｇ＾＋＾＋より成る群から選ばれ
    る特許請求の範囲第１〜４項のいずれか一つの項記載の
    調製物。
  6. （６）２価金属イオンはＭｎ＾＋＾＋である特許請求の
    範囲第５項記載の調製物。
  7. （７）酵素は架橋により支持体に結合される特許請求の
    範囲第１〜６項のいずれか一つの項記載の調製物。
  8. （８）空気の不在下に適当なヒダントイナーゼ酵素で５
    −（任意置換フェニル）ヒダントインを加水分解してＤ
    （−）（任意置換フェニル）グリシンまたはそのＮ−カ
    ルバモイル誘導体を製造する方法であって、該酵素が適
    当な支持体内または支持体上に固定化された該酵素を産
    生する生物の細胞または処理細胞、もしくは正に荷電し
    たポリマー支持体に吸着されたまたは官能化ポリマー支
    持体に共有結合された上記生物由来の酵素、並びに有効
    量の安定化用２価金属イオンから成る固定化酵素調製物
    の形で提供される点に特徴がある上記の製造方法。
  9. （９）固定化酵素調製物は特許請求の範囲第２〜７項の
    いずれか一つの項に記載のものである特許請求の範囲第
    ８項記載の方法。
  10. （１０）Ｄ（−）（４−ヒドロキシフェニル）グリシン
    またはＤ（−）Ｎ−カルバモイル（４−ヒドロキシフェ
    ニル）グリシンを製造するための特許請求の範囲第８項
    または第９項に記載の方法。
  11. （１１）Ｄ（−）（任意置換フェニル）グリシンまたは
    そのＮ−カルバモイル誘導体の製造において有用な固定
    化酵素調製物の製法であって、有効量の安定化用２価金
    属イオンの存在下で、適当な支持体内または支持体上に
    ５−（任意置換フェニル）ヒダントインを加水分解しう
    るヒダントナーゼを産生する生物の処理細胞または未処
    理細胞を固定化するか、あるいは上記細胞由来の酵素と
    正に荷電したポリマー支持体または官能化されたポリマ
    ー支持体とを接触させることから成る固定化酵素調製物
    の製法。
  12. （１２）固定化酵素調製物は細胞を含まず、上記方法は
    その水性懸濁液から固定化酵素調製物を分離することを
    さらに含む、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
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