JP3392865B2 - 固定化酵素調製物およびD―α―アミノ酸の製造法 - Google Patents
固定化酵素調製物およびD―α―アミノ酸の製造法Info
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Description
−α−アミノ酸の製造法に関する。本発明の固定化酵素
調製物は、特に、抗生物質アモキシシリンの製造に用い
るD−(p−ヒドロキシフェニル)グリシンなどのよう
な抗生物質の中間原料となるD−α−アミノ酸の製造に
役立つ。
アミノ酸に変換できる酵素(以下「脱カルバミル酵素」
という)が存在することは、例えば、特公昭57−18793
号、特公昭63−20520号、特公平1−48758号などですで
に知られている。
使用すると、不純物が少ない酵素反応液が調製でき、生
成物の回収が容易になること、酵素の反復使用が可能に
なるためコスト回収に有利であることなどがすでに他の
多数の酵素について知られており、また、工業生産にも
使用して効果をあげている。
化菌体、細胞のアセトン処理粉末または無細胞抽出液と
して使用した例はあるが、固定化酵素としての使用は、
特公昭63−20520号に使用態様としての可能性が一般的
に示唆されているに過ぎない。
すが、活性の維持に問題がある。特に、反復使用の点で
劣っており、商業的ベースで使用できるものではない。
ルバミル酵素の固定化調製物を得、工業生産への使用を
はかるものである。
果、酸化防止剤が脱カルバミル酵素の安定化に有効であ
り、これの存在下に脱カルバミル酵素を固体支持体と接
触させることにより反復使用の可能な脱カルバミル酵素
の固定化調製物を得ることができることを見いだし、本
発明を完成させるに至った。
分解してD−α−アミノ酸を生成させる酵素(脱カルバ
ミル酵素)、酸化防止剤および適当な固定化支持体から
なることを特徴とする固定化酵素調製物、脱カルバミル
酵素を酸化防止剤の存在下、固定化支持体に接触させる
ことを特徴とする該固定化酵素調製物の製造法、および
N−カルバミル−D−α−アミノ酸に該固定化酵素調製
物を作用させることを特徴とするD−α−アミノ酸の製
造法を提供するものである。
バミル−D−α−アミノ酸のN−カルバミル基を脱離す
る作用のある酵素であればいずれでもよく、D−アミノ
酸に立体特異的な作用があるものでもDまたはL−アミ
ノ酸いずれに作用するものでもよい。使用する態様にも
よるが、普通はD−アミノ酸に特異的な酵素が有用なこ
とが多い。
はないが、工業生産のためには微生物が適している。か
かる微生物としては、例えば、特公昭57−18793号、特
公昭63−20520号および特公平1−48758号に開示された
アグロバクテリウム属、シュードモナス属、アースロバ
クター属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、モ
ラキセラ属、パラコッカス属、アエロバクター属、アエ
ロモナス属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、フラ
ボバクテリウム属、セラチア属などの天然の微生物や、
特願平2−400848号に記載されるごとき遺伝子組換えに
よって脱カルバミル酵素産生能を付与された、あるいは
増強された人工微生物が挙げられる。これらの微生物の
代表的な例としては、アグロバクテリウム・スピーシー
ズKNK712(FERM BP−1900)、シュードモナス・スピー
シーズKNK003A(FERM BP−3181)、シュードモナス・
スピーシーズKNK505(FERM BP−3182)、エシェリヒア
・コリJM109pAD108(FERM BP−3184)、エシェリヒア
・コリJM109pPD304(FERM BP−3183)などが挙げられ
る 本発明においては、該脱カルバミル酵素は精製酵素、
部分精製酵素または粗酵素として、場合によっては菌体
のままで固定化酵素調製物中に存在していてよく、脱カ
ルバミル活性を発揮できる状態にあれば、存在型態や共
存物を問わない。
カプトエタノール、L−システイン塩酸塩、システアミ
ン塩酸塩、ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール
とジチオエリスリトールの混合物、還元型グルタチオン
などが使用できる。
の態様によって異なるが、無細胞抽出液のような粗酵素
液や硫安分画等を行った部分精製酵素液を固定化に供す
る場合は、イオン交換基や共有結合基をもったポリマー
支持体が使用できる。
オン交換樹脂、例えば、第1、2、3、4級アミンを交
換基とするデュオライト(登録商標)Aやアムバーライ
トIRA(登録商標)のシリーズ、あるいはジエタノール
型の官能基を持つポリスチレン樹脂、例えば、ダイアイ
オンEXなどが使用できる。
して持つ置換ポリメタクリル酸ポリマー、ポリエチレン
イミン/グルタルアルデヒド複合体で被覆された高密度
アルミナなどが使用できる。
には、ポリアクリルミド、ポリウレタンまたはアルギン
酸カルシウムなどのポリマーや軽石、アルミナのような
多孔質材料を使用することができる。
れる。
機械的破砕(ホモゲナイザーなど)、酵素処理などによ
って無細胞抽出液を調製する。この場合、0.1mM〜20m
M、通常5mM程度の酸化防止剤を存在させる。
常使用する手段が用いられる。例えば、硫酸プロタミン
を蛋白量の1/5〜1/10量加えて核酸を沈澱させ、50〜60
℃の温度で約20分間加熱した後、4℃に冷却して熱に不
安定な蛋白を沈澱させ、これを遠心分離して核酸と熱不
安定な蛋白を除去する。さらに、必要に応じて硫安分画
を行い、支持体と接触させる酵素溶液とする。この間、
酸化防止剤を0.1mM〜20mMの範囲、通常5mM程度存在せし
める。
0mM、通常5mM程度の酸化防止剤を含む緩衝液中で平衡化
させたものを使用する。支持体と酵素溶液を0.1〜20m
M、通常5mM程度の酸化防止剤の存在下で接触させ、4〜
30℃、好ましくは25℃で攪拌する。酵素の吸着量が所期
の量に達した後(通常8〜48時間)、濾取し、架橋剤で
処理して不溶化し、安定化させる。架橋剤としては、例
えば、1%以下(好ましくは0.2%)のグルタルアルデ
ヒドなど公知のものが使用できる。この間も酸化防止剤
を0.1mM〜20mM存在させるのが好ましい。架橋された固
定化酵素調製物は蒸留水や緩衝液(酸化防止剤を含むの
が好ましい)で洗浄し、低温(約4℃)にて密閉容器中
に湿潤状態で保存する。
行うのがよい。酵素の負荷量は、酵素の精製の度合いな
どにより異なるが、一般には、10〜80単位/g支持体であ
る(ここに、1単位の脱カルバミル酵素は、N−カルバ
ミル−D−(p−ヒドロキシフェニル)グリシン1μmo
lを1分間でD−(p−ヒドロキシフェニル)グリシン
に転換するに必要な酵素量である)。固定化酵素調製物
中の酸化防止剤の量5〜10mg/g調製物になるようにする
ことが好ましい。
N−カルバミル−D−α−アミノ酸からD−α−アミノ
酸を製造する工程について説明する。
カルボキシル基、アミノ基、アミド基などの基で置換さ
れていてもよい炭素数1〜4のアルキル基、所望によ
り、芳香環が水酸基などで置換されていてもよい炭素数
7〜8のアラルキル基(ベンジル、フェネチル基など)
または、所望により、水酸基やハロゲンで置換されてい
てもよいフェニル基を意味する] で表される。
Mである。
濃度は、5〜25w/v%、好ましくは15w/v%で使用され
る。固定化酵素調製物の使用量は、10〜80単位/g支持体
のもので対基質当り10〜20単位、好ましくは15単位/g基
質の範囲で用いられ、反応はpH6.5〜8.0の範囲、通常pH
7.0にpHを制御しつつ行う。温度は酵素によって異る
が、一般には30℃〜60℃、特に耐熱性の酵素ではさらに
高い温度で使用することもできる。反応は、カラム法
や、反応器中に懸濁して行うが、後者ではバッチ反応が
普通に行われ、通常1バッチ当たり6〜48時間程度の反
応時間である。本発明の固定化酵素調製物は、非常に安
定で、例えば、15回以上の使用でも活性低下はほとんど
なく、30回以上の反復使用も可能であった。
にしておくのが好ましい。
が、本実施例は本発明の例示に過ぎず、何らこれらに限
定されるものではない。
り生産した。
7.0に調整した。この培地を18リットルの発酵槽に入
れ、121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。尿素およ
びN−カルバミル−D−フェニルグリシン溶液を別々に
ミリポアフィルターにて除菌し、それぞれ500ミリリッ
トルずつを無菌条件下で発酵槽に加えた。
を除いた同様な培地で30℃30時間生育させたアグロバク
テリウム・スピーシーズKNK712(FERM BP−1900)の種
培養物を接種した。発酵は33℃に保ち通気した。pHは硫
酸と可性ソーダー溶液を用いて7.0に制御した。
した。この細胞沈殿物を0.2Mリン酸緩衝液1.5リットル
(pH7.0)中に再懸濁し、ジチオスレイトール5mMになる
よう加え、超音波処理して溶液中に脱カルバミル酵素を
放出させた。
がら徐々に添加し、核酸を沈澱させ、その酵素溶液を50
℃で20分間加熱処理し、その後4℃に冷却した。4℃で
一夜貯蔵後、核酸と蛋白質を沈澱させ、遠心分離して細
胞破砕物を除いた。この調製物の脱カルバミル活性を測
定するために検定した。1%N−カルバミル−D−フェ
ニルグリシン/0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0)に酵素調製物
を加え40℃条件下反応を行ない、D−フェニルグリシン
の生成を調べた。
るよう添加し、さらに硫安による分画を実施した。氷
冷、攪拌しながら硫安を少量ずつ添加し、蛋白を沈澱さ
せた。硫安飽和15〜35%の活性画分を採取し、リン酸緩
衝液100ミリリットル(pH7.0)に溶解させ、同様の活性
検定を行った。
(デュオライト、アンバーライトおよびダイアイオン)
のサンプルを1M NaCl中で1時間洗浄したのち、ジチオ
スレイトール5mMを含む0.2Mリン酸緩衝液中で一夜平衡
化した。平衡化した樹脂は濾過して必要になるまで貯蔵
した。実施例1に記載のごとく調製した部分精製酵素を
固定化に使用した。樹脂1g(湿潤重量)当たり実施例1
の酵素の熱処理後のものおよび硫安分画後のものそれぞ
れ5ミリリットルおよび10ミリリットル(10〜80単位/g
樹脂)を、25℃で24時間混合することにより、酵素を樹
脂に吸着させた。この酵素−樹脂複合体を濾過し、pH7.
0にて1%グルタルアルデヒドで処理した。1時間後、
樹脂サンプルを再度濾過し、蒸留水で3回洗浄した。最
後に、酵素−樹脂複合体を0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0)
で洗い、N2ガスを注入した密閉容器中に4℃で湿った状
態のまま貯蔵した。
実施例1に記載のようにその活性を測定すべく検定し
た。表1はこの方法で処理した一連の市販のイオン交換
樹脂に対して得られた比活性を示す。
erlite)樹脂は米国フィラデルフィア、ローム・アンド
・ハース社の商品であり、ダイアイオン(Diaion)樹脂
は日本、三菱化成工業の製品である。
性:2.5単位/ミリリットル)100ミリリットルをデュオ
ライトA568樹脂15gに添加した。この混合物を25℃で24
時間穏やかに攪拌して脱カルバミル酵素を支持体に吸着
させた。ついで、酵素−樹脂複合体を濾過により分離
し、ジチオスレイトール5mMを含む0.2%グルタルアルデ
ヒド溶液中(pH7.0)で1時間攪拌した。蒸留水で3回
洗い、最後に0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0)で洗った。こ
の酵素−樹脂は密閉容器中に4℃で湿った状態のまま貯
蔵した。一方、硫安分画後の酵素液(活性:9.3単位/ミ
リリットル)30ミリリットルをデュオライトA568樹脂3g
に添加し、以下同様に調製した。固定化酵素液は実施例
1のようにして検定し、その比活性はそれぞれ9.8単位/
g、70単位/g樹脂であった。
gおよびジチオスレイトール8mg(0.5mMとなる)をジャ
ケット付きの容器中の蒸留水100ミリリットルに加え攪
拌しながら10N NaOHを加え、pHを7.0に調製した。窒素
ガスを連続的に吹き込みながら温度を40℃に制御した。
この系を平衡化した後、147単位の酵素−樹脂複合体(1
5g)を加え反応させた。その間、塩酸溶液でpH7.0に調
整した。24時間後D−ヒドロキシフェニルグリシンの収
率は97%である事がHPLCにより測定された。この方法で
製造した生成物は慣用手段で単離する事ができ、高い光
学純度をもつことが判明した。一方、硫安分画後の酵素
−樹脂では、N−カルバミル−D−ヒドロキシフェニル
グリシン15gおよびジチオスレイトール8mgをジャケット
付き容器中の蒸留水100ミリリットルに加え、以下同様
の操作を行ない210単位の酵素−樹脂3gを加え、同様に
反応させ、高光学純度のものを得た。
素を窒素雰囲気下に保つように注意しながら、D−ヒド
ロキシフェニルグリシン溶液を吸引し、その代わりに予
め平衡化しておいた基質懸濁液を新たにセットすること
により、30回再利用した。これらのサイクル全体を通じ
て、D−ヒドロキシフェニルグリシンへの転化率は95%
またはそれ以上であった。
ズKNK003A(FERM BP−3181)を生育させ、細胞を遠心
分離により発酵ブロス9リットルから収穫した。この細
胞を0.2Mトリス/塩酸緩衝液(pH7.0)300ミリリットル
中に再懸濁し、ジチオスレイトール5mMとなるよう加
え、超音波処理して溶液中に脱カルバミル酵素を放出さ
せた。これに3%硫酸プロタミン水溶液20ミリリットル
を攪拌しながら徐々に添加し、核酸を沈澱させた。その
酵素溶液を65℃、20分間加熱処理し、その後、4℃に冷
却した。4℃で一夜貯蔵後、核酸と蛋白質で沈澱させ、
遠心分離して細胞破砕物を除いた。この熱処理後の部分
精製酵素液(活性:0.06単位/ミリリットル)100ミリリ
ットルをデュオライトA568樹脂10gに添加した。この混
合物を25℃で24時間攪拌して脱カルバミル酵素を支持体
に吸着させた。酵素−樹脂複合体を濾別し、ジチオスレ
イトール5mMを含む0.2%グルタルアルデヒド溶液中(pH
7.0)で穏かに1時間攪拌架橋した。蒸留水で3回洗
い、最後に0.2Mトリス/塩酸緩衝液(pH7.0)で洗っ
た。その比活性は0.38単位/g樹脂でN−カルバミル−D
−アラニンを基質とした場合の活性は4.2単位/gであっ
た。
て、ジチオスレイトール0.5mMを含む蒸留水40ミリリッ
トル中でN−カルバミル−D−アラニン2gを加水分解し
た。加水分解反応はこの混合物にN2を吹き込んで酸素を
排除しながら45℃、pH6.7〜7.0で24時間行った。反応終
了時のD−アラニンの収率は96.5%であると測定され
た。
水分解して平均収率96.1%を得た。
ムに充填し、1mMの酸化防止剤を含む2%N−カルバミ
ル−D−(p−ヒドロキシフェニル)グリシン溶液を上
記のカラムに通液し連続加水分解反応を行った。酸化防
止剤としてはジチオスレイトール、L−システイン塩酸
塩、システアミン塩酸塩を使用し、通液速度1ml/分、40
℃、N2シール下で4日間連続反応を行った。
30〜35%に抑えられたが、酸化防止剤を使用しない場合
は80%以上の酵素失活が認められた。
原料等として重要なD−α−アミノ酸類を製造する脱カ
ルバミル酵素の固定化調製物が提供される。この調製物
を使用することにより、30回以上の反復使用が可能にな
り、工業生産への使用が期待できる。
Claims (7)
- 【請求項1】a)アグロバクテリウム・スピーシーズKN
K712(FERM BP−1900)、シュードモナス・スピーシー
ズKNK003A(FERM BP−3181)およびエシェリヒア・コ
リJM109 pAD108(FERM BP−3184)からなる群より選
択される少なくとも1種の微生物に由来する、N−カル
バミル−D−α−アミノ酸を加水分解してD−α−アミ
ノ酸を生成させる酵素、b)陰イオン交換樹脂、および
c)酸化防止剤からなる、30回以上反復使用できること
を特徴とする固定化酵素調製物。 - 【請求項2】陰イオン交換樹脂が、アミンを交換基とす
るフェノール型イオン交換樹脂である請求項1記載の固
定化酵素調製物。 - 【請求項3】酸化防止剤が、ジチオスレイトール、2−
メルカプトエタノール、L−システイン塩酸塩、システ
アミン塩酸塩、ジチオエリスリトール、ジチオスレイト
ールとジチオエリスリトールの混合物、または還元型グ
ルタチオンである請求項1記載の固定化酵素調製物。 - 【請求項4】アグロバクテリウム・スピーシーズKNK712
(FERM BP−1900)、シュードモナス・スピーシーズKN
K003A(FERM BP−3181)およびエシェリヒア・コリJM1
09 pAD108(FERM BP−3184)からなる群より選択され
る少なくとも1種の微生物に由来する、N−カルバミル
−D−α−アミノ酸を加水分解してD−α−アミノ酸を
生成させる酵素と、陰イオン交換樹脂を酸化防止剤の存
在下で接触させることを特徴とする固定化酵素調製物の
製造法。 - 【請求項5】陰イオン交換樹脂を、酸化防止剤を含む緩
衝溶液中で平衡化せしめた後、酵素と接触させる請求項
4記載の製造法。 - 【請求項6】請求項1〜3のいずれか1項記載の固定化
酵素調製物を、酸化防止剤の存在下にN−カルバミル−
D−α−アミノ酸と接触させることを特徴とするD−α
−アミノ酸の製造法。 - 【請求項7】固定化酵素調製物を30回以上反復使用する
ことを特徴とする請求項6記載の製造法。
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Chemical & Engineering News,1975年 8月18日,Vol.53,No.33,pp.33−34 |
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