JPS61115493A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents
固定化酵素の製造方法Info
- Publication number
- JPS61115493A JPS61115493A JP23542284A JP23542284A JPS61115493A JP S61115493 A JPS61115493 A JP S61115493A JP 23542284 A JP23542284 A JP 23542284A JP 23542284 A JP23542284 A JP 23542284A JP S61115493 A JPS61115493 A JP S61115493A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- carrier
- crosslinking agent
- crosslinking
- aqueous solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は固定化酵素の製造方法に関する。さらに詳し
くは、化学結合ことに酵素間の架橋結合により酵素を担
体に固定化する固定化酵素の製造方法に関する。
くは、化学結合ことに酵素間の架橋結合により酵素を担
体に固定化する固定化酵素の製造方法に関する。
（ロ）従来技術
最近、診断用や合成用のバイオリアクターとして酵素を
担体に固定化してなる固定化酵素が用いられるようにな
ってきた。このような固定化酵素を製造する代表的な方
法として、担体ことに多孔性物質（例えば、多孔性シリ
カ）に所望の酵素水溶液を接触させることにより酵素を
担体に物理的に吸着させる方法が知られている。
担体に固定化してなる固定化酵素が用いられるようにな
ってきた。このような固定化酵素を製造する代表的な方
法として、担体ことに多孔性物質（例えば、多孔性シリ
カ）に所望の酵素水溶液を接触させることにより酵素を
担体に物理的に吸着させる方法が知られている。
しかしながら、かような物理的な吸着のみを利用した固
定化方法では、バイオリアクターとして使用時に酵素が
試料中に溶解して短期間で酵素活性が低下してしまうと
いう欠点がある。
定化方法では、バイオリアクターとして使用時に酵素が
試料中に溶解して短期間で酵素活性が低下してしまうと
いう欠点がある。
この点に関し、上記のごとく酵素を予め担体に物理吸着
させた後、適当な架橋剤を用いて吸着された酵素間に架
橋させることにより、酵素を不溶化させる方法も知られ
ている（「固定化酵素」、千畑一部著（構談社）、第３
７頁下から第２〜１行及び第４５頁２．１．２架橋法参
照）。
させた後、適当な架橋剤を用いて吸着された酵素間に架
橋させることにより、酵素を不溶化させる方法も知られ
ている（「固定化酵素」、千畑一部著（構談社）、第３
７頁下から第２〜１行及び第４５頁２．１．２架橋法参
照）。
しかしながら、かような従来の酵素−酵素間の架橋法に
よる酵素の固定化においても固定化された酵素の不溶化
効果は充分なものとはいえず、酵素の脱離により活性が
劣化し易いという問題点があった。
よる酵素の固定化においても固定化された酵素の不溶化
効果は充分なものとはいえず、酵素の脱離により活性が
劣化し易いという問題点があった。
（ハ）発明の目的
この発明は、上記のごとき従来の問題点を解消すべくな
されたものであり、活性の劣化が少なくかつ高活性の架
橋法による固定化酵素を提供しようとするものである。
されたものであり、活性の劣化が少なくかつ高活性の架
橋法による固定化酵素を提供しようとするものである。
本発明者らは、架橋法による固定化について鋭意研究を
行なった結果、従来の担体への酵素の物理吸着処理と架
橋剤の接触処理との手順を組み変えることにより、意外
にも酵素の架橋性が高く活性の劣化が抑制され、かつ活
性自体も向上された固定化酵素が得られる事実を見出し
た。
行なった結果、従来の担体への酵素の物理吸着処理と架
橋剤の接触処理との手順を組み変えることにより、意外
にも酵素の架橋性が高く活性の劣化が抑制され、かつ活
性自体も向上された固定化酵素が得られる事実を見出し
た。
に）発明の構成
かくしてこの発明によれば二又はそれ以上の官能基を有
する架橋剤を用いて酵素と酵素とを架橋することにより
酵素を担体に固定化する方法において、架橋剤を予め担
体に吸着又は付着させた後に該担体を酵素水溶液に接触
保持させて酵素の架橋させることを特徴とする固定化酵
素の製造方法が提供される。
する架橋剤を用いて酵素と酵素とを架橋することにより
酵素を担体に固定化する方法において、架橋剤を予め担
体に吸着又は付着させた後に該担体を酵素水溶液に接触
保持させて酵素の架橋させることを特徴とする固定化酵
素の製造方法が提供される。
この発明は、従来の架橋法にあける手順、すなわち■固
定化を意図する酵素の水溶液中に担体を入れる等の手法
により先に担体に酵素を物理吸着させ、■その後に架橋
剤に接触させて吸着酵素を架橋させる手順、を逆転させ
、■先に架橋剤を溶液接触等により担体に吸着や付着さ
せた後、■酵素水溶液に接触させて酵素をその場で架橋
及び固定させる点を特徴とするものである。そしてそれ
により高活性でかつ耐久性の優れた固定化酵素を提供す
るものである。
定化を意図する酵素の水溶液中に担体を入れる等の手法
により先に担体に酵素を物理吸着させ、■その後に架橋
剤に接触させて吸着酵素を架橋させる手順、を逆転させ
、■先に架橋剤を溶液接触等により担体に吸着や付着さ
せた後、■酵素水溶液に接触させて酵素をその場で架橋
及び固定させる点を特徴とするものである。そしてそれ
により高活性でかつ耐久性の優れた固定化酵素を提供す
るものである。
この発明に用いる担体としては、極性基の有無にかかわ
らず種々の固体状物質が使用でき、例えば活性炭、ガラ
ス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリ
カゲル、ベントナイト、ア １パタイト、セピ
オライト、不溶性無機塩及び含酸素有機金属化合物（金
属アルコキシドやアセチルアセトネート金属錯体等）の
加水分解ゲルのような天然又は合成の無機固体、無機塩
、金駆酸化物、金属水酸化物などが挙げられ、これ以外
にも天然又は合成の高分子も使用可能である。かかる担
体としては実用上の酵素活性を得る点で比表面積の大き
なものが好ましく、通常、多孔性物ａを用いるのが好ま
しい。この際の多孔性とは少なくとも固定を意図する酵
素が内部に充分に浸透しつる程度の多孔性を意味する。
らず種々の固体状物質が使用でき、例えば活性炭、ガラ
ス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリ
カゲル、ベントナイト、ア １パタイト、セピ
オライト、不溶性無機塩及び含酸素有機金属化合物（金
属アルコキシドやアセチルアセトネート金属錯体等）の
加水分解ゲルのような天然又は合成の無機固体、無機塩
、金駆酸化物、金属水酸化物などが挙げられ、これ以外
にも天然又は合成の高分子も使用可能である。かかる担
体としては実用上の酵素活性を得る点で比表面積の大き
なものが好ましく、通常、多孔性物ａを用いるのが好ま
しい。この際の多孔性とは少なくとも固定を意図する酵
素が内部に充分に浸透しつる程度の多孔性を意味する。
これらの点で一つの好ましい担体としてセピオライトが
挙げられる。これら担体の形状は用途に応じて選択すれ
ばよいが、通几、粒状のものを用いるのが適している。
挙げられる。これら担体の形状は用途に応じて選択すれ
ばよいが、通几、粒状のものを用いるのが適している。
上記担体に架橋剤を吸着又は付着させる方法としては、
担体を架橋剤の溶液（例えば、水溶液）に浸漬して所定
時間保持させる方法が好ましい。
担体を架橋剤の溶液（例えば、水溶液）に浸漬して所定
時間保持させる方法が好ましい。
この処理時間は、通常、常温下で数分〜数時間で充分で
ｊ″、る。なお、多孔性の担体を用いた際には減圧下で
押体内部の気泡を充分に除去した後又は除去しつつ吸着
又は付着処理を行なうのが好ましい０ 架橋剤としては、グルタルアルデヒド、二官能性以上の
インシアナート誘導体、ビスジアゾベンジジン、Ｎ、Ｎ
−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ、Ｎ−エチ
レンビスマレインイミド等が挙げられる。これらは酵素
タンパク頁中のα−アミノ基、ε−アミノ基、フェノー
ル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基等の官能基と
反応してシッフ塩基結合、ヘプチド結合、ジアゾ結合等
を形成して架橋結合を構成しつるものであり、意図する
任意の酵素に応じて至適架橋剤を選択すればよい。通常
、グルタルアルデヒドやイソシアナート誘導体（例えば
、ヘキサメチレンジイソリアナート）を用いるのが適し
ている。なセ、溶液ことに水溶液により担体に接触させ
る際の架橋剤の濃度は通常、１０ ｍｔｎｏ １１〜５
ｍｏ ｉ！程度が適している。
ｊ″、る。なお、多孔性の担体を用いた際には減圧下で
押体内部の気泡を充分に除去した後又は除去しつつ吸着
又は付着処理を行なうのが好ましい０ 架橋剤としては、グルタルアルデヒド、二官能性以上の
インシアナート誘導体、ビスジアゾベンジジン、Ｎ、Ｎ
−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ、Ｎ−エチ
レンビスマレインイミド等が挙げられる。これらは酵素
タンパク頁中のα−アミノ基、ε−アミノ基、フェノー
ル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基等の官能基と
反応してシッフ塩基結合、ヘプチド結合、ジアゾ結合等
を形成して架橋結合を構成しつるものであり、意図する
任意の酵素に応じて至適架橋剤を選択すればよい。通常
、グルタルアルデヒドやイソシアナート誘導体（例えば
、ヘキサメチレンジイソリアナート）を用いるのが適し
ている。なセ、溶液ことに水溶液により担体に接触させ
る際の架橋剤の濃度は通常、１０ ｍｔｎｏ １１〜５
ｍｏ ｉ！程度が適している。
このようにして得られた架橋剤含有担体は適宜洗浄処理
に付されたのち酵素の水溶液との接触処理に供される。
に付されたのち酵素の水溶液との接触処理に供される。
この際も通常、担体を酵素水溶液中に所定時間、浸漬保
持することにより行なうのが適している。これにより、
担体中への酵素の浸透及び吸着又は付箔している架橋剤
と酵素との反応が進行する。この際の処理条件は常温下
、数分〜【時間が連しており、５分〜１間開程度が好ま
しい。なお、多孔性担体を用いた際には前記と同様に減
圧下で処理するのが好ましい。かような処理により、酵
素は担体内に充分に接触又は浸透すると共に架橋剤によ
り酵素間に架橋が行なわれて酵素が担体に仲間に固定化
されることとなる。な詔、この際に用いる酵素水溶液の
濃度は酵素の種類にもよるが、意図する酵素活性によっ
て適宜選択すればよい。
持することにより行なうのが適している。これにより、
担体中への酵素の浸透及び吸着又は付箔している架橋剤
と酵素との反応が進行する。この際の処理条件は常温下
、数分〜【時間が連しており、５分〜１間開程度が好ま
しい。なお、多孔性担体を用いた際には前記と同様に減
圧下で処理するのが好ましい。かような処理により、酵
素は担体内に充分に接触又は浸透すると共に架橋剤によ
り酵素間に架橋が行なわれて酵素が担体に仲間に固定化
されることとなる。な詔、この際に用いる酵素水溶液の
濃度は酵素の種類にもよるが、意図する酵素活性によっ
て適宜選択すればよい。
このようにして得られた固定化酵素は適宜洗浄処理した
後、適当なカラム内に充填することによって批々のバイ
オリアクターとして利用することができる。
後、適当なカラム内に充填することによって批々のバイ
オリアクターとして利用することができる。
吐１実施例
担体としてセピオライトを用い、架橋剤としてグルタル
アルデヒドを用い、酵素としてラクターゼを用いること
によりこの発明の製造方法を実施した。
アルデヒドを用い、酵素としてラクターゼを用いること
によりこの発明の製造方法を実施した。
まず、セピオライト塊を約Ｈ−ｏｏ°Ｃで１２（１加熱
処理して充分乾燥させ、ひれを破砕して平均粒径約１１
ａＲのセピオライト粒状物を得た。このセピオライト粒
状物（担体）約１００１’Ｆを２５重爪％のグルタルア
ルデヒド水溶液（１００ｍ７り中に浸漬し、減圧脱気条
件下で常温下、８０分間保持させた。次いでメンブラン
フィルタ−によりグルタルアルデヒド水溶液から担体を
分離した後、ラクターゼ約１Ｆを溶解したＰＨ７のリン
酸塩緩衝水溶液（１０ｇｔ）中に浸漬し、減圧脱気条件
下で常温下、８０分間保持させて架橋反応を行なった。
処理して充分乾燥させ、ひれを破砕して平均粒径約１１
ａＲのセピオライト粒状物を得た。このセピオライト粒
状物（担体）約１００１’Ｆを２５重爪％のグルタルア
ルデヒド水溶液（１００ｍ７り中に浸漬し、減圧脱気条
件下で常温下、８０分間保持させた。次いでメンブラン
フィルタ−によりグルタルアルデヒド水溶液から担体を
分離した後、ラクターゼ約１Ｆを溶解したＰＨ７のリン
酸塩緩衝水溶液（１０ｇｔ）中に浸漬し、減圧脱気条件
下で常温下、８０分間保持させて架橋反応を行なった。
このようにして得られたこの発明の固定化酵素を、１５
．７重量％のラクトース溶液２００ｇ／中に加えて８０
″Ｃ下酵素反応に供し、反応開始後２゜５．１０及び８
０分後にそれぞれ生成グルコース量を測定して活性を評
価した（第１回測定）。さらに活性の劣化を評価するた
めに、上記反応後固定化酵素を蒸留水で洗浄し再び８０
分間の活性を評価を行ない（第２回測定）、更にこのサ
イクルをもう一度繰り返した（第８回測定）。
．７重量％のラクトース溶液２００ｇ／中に加えて８０
″Ｃ下酵素反応に供し、反応開始後２゜５．１０及び８
０分後にそれぞれ生成グルコース量を測定して活性を評
価した（第１回測定）。さらに活性の劣化を評価するた
めに、上記反応後固定化酵素を蒸留水で洗浄し再び８０
分間の活性を評価を行ない（第２回測定）、更にこのサ
イクルをもう一度繰り返した（第８回測定）。
なお、比較例として物理吸着のみによる固定化酵素・比
較例■）及び従来の架橋法による固定化酵素（比較例■
）について同様な評価を行なった。
較例■）及び従来の架橋法による固定化酵素（比較例■
）について同様な評価を行なった。
この比較例■及び■の固定化酵素の製造条件は以下の通
りである。
りである。
（比較例Ｉ）
ラクターゼ１ｆを溶解したＰＨ７のリン酸塩緩衝水溶液
（１０ｍ／）中に架橋剤未処理のセピオライト粒状物約
ｔｏｏｑを浸漬し、減圧脱気下、常温で８０分間保持し
て吸着させた。
（１０ｍ／）中に架橋剤未処理のセピオライト粒状物約
ｔｏｏｑを浸漬し、減圧脱気下、常温で８０分間保持し
て吸着させた。
（比較例■）
比較例Ｉで得られた酵素を物理吸着した担体を、２５重
ｎ％グルタルアルデヒド水溶液（１００ｇ７＋中に浸漬
し、減圧脱気下、常温で８０分間保持して反応させた。
ｎ％グルタルアルデヒド水溶液（１００ｇ７＋中に浸漬
し、減圧脱気下、常温で８０分間保持して反応させた。
このようにして得られた結果を第１表に示した。
また、参考のために上記結果のうち、反応囲始８０分後
のグルコース量をプロットしたグラフを第１図に示した
。
のグルコース量をプロットしたグラフを第１図に示した
。
このようにこの発明の製造方法により得られた固定化酵
素の配素活性は従来法のものに比して高くかつ繰り返し
使用による失活も低減化されていることが判る。
素の配素活性は従来法のものに比して高くかつ繰り返し
使用による失活も低減化されていることが判る。
（へ）発明の効果
以上述べたごとく、この発明によれば、従来の架四法に
比して高活性でかつ活性の劣化が少ない固定化酵素を得
ることができる。そしてかかるこの発明は酵累間を架橋
することにより酵素を固定化しているため、担体の官能
基の有無にかかわらず酵素を強固に固定化することがで
きる。
比して高活性でかつ活性の劣化が少ない固定化酵素を得
ることができる。そしてかかるこの発明は酵累間を架橋
することにより酵素を固定化しているため、担体の官能
基の有無にかかわらず酵素を強固に固定化することがで
きる。
第１図は、この発明の製造方法により得られた固定化酵
素の活性を比較例と共に例示するグラフである。
素の活性を比較例と共に例示するグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、二又はそれ以上の官能基を有する架橋剤を用いて酵
素と酵素とを架橋することにより酵素を担体に固定化す
る方法において、 架橋剤を予め担体に吸着又は付着させた後に該担体を酵
素水溶液に接触保持させて酵素の架橋させることを特徴
とする固定化酵素の製造方法。 ２、担体が、多孔性物質からなる特許請求の範囲第１項
記載の製造方法。 ３、架橋剤が、グルタルアルデヒド又はヘキサメチレン
ジイソリアナートである特許請求の範囲第１項又は第２
項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23542284A JPS61115493A (ja) | 1984-11-08 | 1984-11-08 | 固定化酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23542284A JPS61115493A (ja) | 1984-11-08 | 1984-11-08 | 固定化酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115493A true JPS61115493A (ja) | 1986-06-03 |
| JPH0566105B2 JPH0566105B2 (ja) | 1993-09-21 |
Family
ID=16985866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23542284A Granted JPS61115493A (ja) | 1984-11-08 | 1984-11-08 | 固定化酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61115493A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143847A (en) * | 1988-05-25 | 1992-09-01 | Ngk Insulators, Ltd. | Enzyme-fixed bioreactor |
-
1984
- 1984-11-08 JP JP23542284A patent/JPS61115493A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143847A (en) * | 1988-05-25 | 1992-09-01 | Ngk Insulators, Ltd. | Enzyme-fixed bioreactor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0566105B2 (ja) | 1993-09-21 |
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