JPS59109174A - 固定化生体触媒の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、反応の触媒等として用いられる固定化生体
触媒の製法に関する。

近年、工業における製品製造工程（プロセス）において
は、省エネルギー、省資源が重要な命題の一つとなって
いる。そこで、酵素や酵素を生産する微生物等を利用す
る生体反応を工業的に利用することが盛んになり、これ
らを利用する反応が食品、医薬部門等ですでに使用され
ている。生体反応を利用したプロセスでは、従来のプロ
セスに比べて、常温、常圧といった緩やかな条件で反応
が進められ、酵素、微生物は反応特異性を有するので、
これらに特有な物質のみ反応させることもできる。また
、これらを用いると副反応がきわめて少ないので生成物
の純度が高くなり、反応も極めて迅速に進む。さらに、
従来、多段反応であったものが単一のプロセスで済むよ
うにもなる。このように、酵素や微生物を用いると数々
の利点が得られる。しかし、酵素を使用する場合、これ
は水溶性であって、従来では酵素を水に溶解させた状態
で酵素反応を行うようにしていたので、反応終了後に反
応溶液中から酵素のみを分離回収し、酵素を再利用する
ことば技術的に極めて困難であった。酵素は高価である
ので、製品製造コストを軽減するには、反応毎に酵素の
分離２回収が必要となる。そこで、何らかの形で酵素に
修飾を行って酵素を水不溶性にすること等、酵素を固定
化する（固定化酵素にする）ことが考案さた。固定化酵
素を使用するようにすると、これまで酵素反応を回分式
で行なっていたのを連続式で行なうことが可能になり、
酵素を再使用することも可能となる。また、生産コスト
等の経済性の面や生成物中に酵素が混在しないという生
成物の純度の面、その他の面で非常に有利になる。その
うえ、酵素の反応特異性を利用して、被測定溶液の前処
理条件や被測定物質と混在する他の物質に係わることな
く濃度を測定できるというバイオセンサとしての用途も
考えられる。

これまでに名案された酵素の固定化法器Ｊ、一般に五つ
の方法、すなわち担体結合法、架橋法および包括法に大
別することができる。もつとも普通の場合についζ述べ
れば、担体結合法ＧＪ酵素を水不溶性の担体に結合させ
る方法であって、その結合様式によって、さらに、酵素
をイオン的に担体に結合させるイオン結合法、酵素を物
理的に担体に吸着させる物理的吸着法、１■体表面一ト
の官能基と酵素中の遊離子ミノ基等（アミノ酸残基等）
とを化学反応によって結合さ−υ”る共有結合法の三つ
に細分される。架橋法は２個もしくはそれ以上の官能基
を有する試薬（架橋剤）と酵素とを反応させ、酵素間を
架橋して水不溶性とする方法、包括法はポリマー（ポリ
マーマトリックス）のゲルの中に酵素を包み込んで脱離
できない状態にして固定したり（格子型）、ナイロン皮
膜等の半透成性のポリマーの皮膜によって酵素を被覆す
る方法（マイクロカプセル型、マイクロカプセル化法）
である。

これらの固定化酵素の製法には几Ａずれも欠点があった
。すなわち、担体結合法はその性質上固定化酵素を担体
の形状以外の形に成形することば困難であり、表面積に
限界があるため酵素固定量も限界を有している。また、
架橋法や包括法は酵素固定化時に比較的反応性の激しい
試薬を用いることが多いといったような理由で固定化時
に酵素の失活が起きる等して得られる固定化酵素の活性
が低いものとなることが多かった。そのうえ、包括法に
より得られる固定化酵素では、格子や皮膜が酵素を覆っ
ていることが基質や生成物の透過性を悪くさせる（拡散
抵抗を人き（させる）原因となっていた。

発明者らは、多量の酵素を固定することができ、拡散抵
抗の小さい固定化酵素の得られる製法を得ようとして研
究を重ねた。その結果、酵素を含むゲル膜を官能基を有
する担体表面に形成させたあと、官能基と酵素を架橋し
、つぎにゲルを除去して固定化酵素をつくればよいとい
うことを見出した。また、微生物菌体も同じ方法で担体
に固定することができるということを見出し、ここにこ
の発明を完成した。

すなわち、この発明は、官能基を有する担体にゲル化剤
と生体触媒の混合物を塗布したあと、ゲル化剤をゲル化
させ、生体触媒と担体の官能基を架橋したのち、ゲルを
除去することを特徴とする固定化生体触媒の製法をその
要旨とする。以下、この発明の詳細な説明する。

官能基を有する担体としては、セルロース、ナイロン、
白金等の天然有機物１合成有機物、金属、無機物等に化
学処理を施して表面上に官能基を導入したもの、あるい
はイオン交換樹脂等の最初から官能基を有するものが用
いられ、水不溶性であれば特に種類は限定されない。官
能基の種類としては、アミノ基、カルボキシル基、フェ
ノール基等があげられ、固定する生体触媒の種類や架橋
剤の種類に応じて、適当な種類の官能基を有する担体を
用いる必要がある。化学処理を行う場合、化学処理剤と
しては、γ−アミノプロピルトリエ］−キシシラン等の
シランカップリング剤、ヘキサメチレンジアミンその他
の２官能性試薬が用いられ、場合によってば３官能性以
上の多官能性試薬が用いられることもありうる。γ−ア
ミノプロピル１−リエトキシシランやヘキサメチレンジ
アミンはアミノ基を導入する場合に用いられる。ゲル化
剤としてはに一カラギーナン、アスパラギン酸（す１〜
リウム塩等の塩も含む）等の多ｍ頬、その他が用いられ
るが、ゲル化させたあとゾル化させる等して取り除くこ
とができるものを用いる必要がある。ゲル化剤が２種以
上間時に用いられる場合もある。生体触媒のうち、酵素
としては、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、
プロテアーゼ等の加水分解酵素、アル：１−ルデヒドロ
ゲナーゼ、グリ：１−スオキシダーゼ、アミノ酸オキシ
ダーセ等の酸化還元酵素、メチルトランスフェラーゼ、
グリコジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ等
の転移酵素、アミノ酸デカルボキシラーゼ、グルタミン
酸デカルボキシラーゼ等のりアーゼ、あるいは、イソメ
ラーゼ、リガーゼ等の中から選ばれた少なくとも１種が
用いられる。微生物菌体としては、Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ
＋ｉａ　　ｃｏｌｔ　、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　
ｐｕｔｉｄａ等のうちの少なくとも１種が用いられる。

酵素と微生物菌体が同時に用いられる場合もありうる。

架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ヘギザメチレン
ジイソシアリー−１・、ビスジアゾヘンジジン等が用い
られるが、担体の官能基の種類や生体触媒の種類に応じ
て決める必要がある。

また、酵素を失活させたり、微生物菌体の特性を１０な
わせる恐れが少ない架橋剤を選ぶ必要がある。

このような原）Ａ料を用い、っぎのようにして固定化生
体触媒をつくる。

まず、生体触媒とゲル化剤を混合し、この混合物を担体
表面に塗布する。つぎに、担体上で生体触媒−ゲル化剤
混合物（ゲル化剤）をゲル化させる。つぎに、ゲル中に
架橋剤を含ませ（拡散させ）、担体の官能基と酵素とを
架橋剤で架橋する。

必要に応じて担体と架橋された酵素と別の酵素とを架橋
するようにしてもよい。つぎに、ゲルをゾル化させる等
して除去すれば固定化生体触媒が得られる。このように
、ゲル化剤と生体触媒の混合物を担体に塗布したあと生
体触媒と担体とを架橋するので、担体表面の生体触媒の
濃度を高くしさえすれば、多量の生体触媒を担体に固定
することができる。また、生体触媒を担体に固定したあ
とゲルを除去するので、包括法で得られる固定化酵素の
ようにゲルによって基質や生成物の移動が妨げられると
いったようなことはない。したがって、この方法によっ
て得られる固定化酵素は拡散抵抗の小さいものとなる。

この発明にかかる固定化生体触媒の製法はこのように構
成されるものであって、官能基を有する担体にゲル化剤
と生体触媒の混合物を塗布したあとゲル化剤をゲル化さ
せ、生体触媒と担体の官能基を架橋したのち、ゲルを除
去して固定化生体触媒をつくるようにするので、多量の
生体触媒を担体に結合させるのが容易である。また、拡
散抵抗の小さい固定化生体触媒が得られる。したがって
、この方法により得られた固定化酵素をセンサーとして
用いると応答性が良好となる。さらに、この方法により
得られる固定化酵素は、活性が高く、活性の安定性も高
いことが確かめられた。

つぎに、実施例および比較例について説明する。

〔実施例１〕 つぎのようにして、担体のアミノ基が導入されたナイロ
ンに酵素のインベルターゼを固定した。

ナイロンを硫酸ジメチル中において、１００℃で３０分
間処理してしペプチド結合部を活性化さく９） せた。つぎに、このナイロンを１．０％のへキザメチレ
ンジアミン溶液中において処理（常温で３０分間）して
アミノ基を導入し、担体として用いた。

１．５％アルギン酸ソータ゛ン容液３０＋ｎｊ＋にイン
ベルターゼ３００ｍｇを溶解し、前記のようにして処理
したナイロン（担体）をこの溶液に浸してナイロン表面
にインベルターゼ−アルギン酸溶液の被験を形成さゼた
。ナイロンを冷蔵庫に入れて被験（固定化酵素膜）をゲ
ル化さセたあと、氷浴（ｉｃ　−ｅ　ｂａｔｔ＋）中で
ナイロンを１．０％のグルタルアルデヒド溶液に約３０
分間浸し、インへルターゼとナイロンとを架橋した。つ
ぎに、ナイロンをｐＨ８，０の緩衝液（約４５℃）に浸
し、ゲル化したアルギン酸を除去して固定化酵素（固定
化生体触媒）をｉＭた。得られた固定化標品の固定前の
酵素に対する活性の割合（比活性保持率）を測定した。

測定結果を第１表に示す。ただし、活性は０．　ＯＩ　
Ｍ酢酸すＩ・リウム緩衝液中においてＩＭのサッカロー
スの分解反応を行ない、生成物であるグルコース、フル
クト−スをり、Ｎ、Ｓ法（ジニトロサリチ（１０） 弗酸法）を用いて比色定量を行なうことにより測定した
。

比較例１として、包括法を用い、アルギン酸ソーダだＬ
Ｊを用いてインへルターゼを固定し、アルギン酸のゲル
でインへルターゼが包括固定された固定化酵素をつくっ
た。この固定化酵素の比活性保持率を実施例１で記した
と同様の方法で測定した。この測定結果も第１表に示す
。

第　　１　　表 第１表より、実施例１で得られた固定化酵素は、比較例
２で得られたものに比べて比活性保持率が高くなってい
ることがわかる。これは、実施例１の固定化酵素の拡散
抵抗が比較例のものに比べて低いためと考える。

〔実施例２〕 つぎのようにして、担体のイオン交換樹脂に酵（１１） 素のトリプシンを固定した。

に−カラギーナン溶液（１，０％）とトリプシン溶液（
３，０ｍｇ／　ｍ　１　）とを１：１の割合で混合した
混合物（４０℃）に、へｍｂｅｒ日ｔｅ　ＩＲＡ−９４
イオン交換樹脂（表面官能基−ＮＨ２）を浸したあと、
イオン交換樹脂を０．０５　Ｍ塩化カリウム溶液に浸し
てに一カラギーナンをゲル化させた。つぎに、　　　　
　　。

イオン交換樹脂を０．８％グルタルアルデヒド溶液（５
℃）中に入れて約１５分間攪拌を行なった。

イオン交換樹脂を水洗したあと、これを４０゛ｃのｐＨ
５，ｏ＃酸ナナトリウム緩衝液０．１Ｍ）に浸してに一
カラギーナンを除去して固定化酵素標品を得た。得られ
た固定化標品の製造後の活性の安定性（経時変化）を測
定した。活性はつぎのようにして測定した。すなわち、
ｐＨ５，７酢酸緩衝液（０，１Ｍ）中において８．ＯＸ
ｌｏ（ＭのＤＬ−ＢＡＰＡ（Ｎ　−ｔｘ　−Ｂｅｎｚｏ
ｙｌ　−Ｄ　　Ｌ　　−八ｒｇｉｎｉｎｅ　−ｐ　　−
ｎｉ−ｔｒｏａｎｊ目ｄｅ　　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏＢｄ
ｅ　）の分解反応を行ない、生成するｐ−ｎ１ｔｒｏａ
ｎｉｌｉｄｅを３４０ｒ＋ｍの波長で比色定量を行なう
ことにより活性を測定した。

（１２） 第２表に測定結果を示す。ただし、活性は固定化前の酵
素１ｍｇ当りの活性を１００とする相体的な活性であら
れした。

比較例２として包括法を使用し、３．０　ｍｇ／　ｍ　
１２のトリプシン溶液にに一カラギーナン溶液（１，０
％）を加えたあと、塩化カリウムでに一カラギーナンを
ゲル化させてトリプシンを固定した。得られた固定化酵
素標品の安定性を実施例２に記したと同様の方法で測定
した。この測定結果を第２表に示す。

第２表 第２表より、実施例２で得られた固定化酵素は比較１ダ
Ｉ２で得られたものに比べ、活性が安定していることが
分かる。これは、比較例２の固定化酵素では酵素がゲル
から離脱する恐れが多いのに比（１３） べ、実施例の固定化酵素では担体と酵素とが架構されて
いるので酵素が離脱する恐れが少ないためと考えられる
。

〔実施例３〕 つぎのようにして、担体のアミノ基が導入された白金板
に酵素のグルコースオキシダーゼを固定した。

白金板（５ｍ＊　ｘ　５龍×７０μｍ厚）をγ−アミノ
プロピルトリエトキシシラン−アセトンの２％溶液で２
４時間処理したあと、白金板をアセトンで洗浄した。つ
ぎに、に−カラギーナン溶液（１゜０％）とグルコース
オキシダーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）の比が０．２５：
１．ｔｉｔ、ｉ、ｓ：ｔ、２：１の割合となるよう混合
して４種類の溶液をつくった。これらの溶液的２０μｌ
を前記のようにして処理した４枚の白金板にそれぞれ塗
布した。

４種類の白金板を冷蔵庫に入れてに一カラギーナンをゲ
ル化させ、つぎに、１．０％グルタルアルデヒド溶液に
約３０分間浸してグルコースオキシダーゼと白金板を架
橋した。このあと白金板をｐＨ５゜（１４） ０の酢酸すトリウム緩衝ｉ（０，０１Ｍ＞に浸してに一
カラギーナンを除去し、當温で乾燥させて固定化酵素標
品を得た。得られた４種類の固定化標品をセンサーとし
て使用し、それぞれの応答時間を測定した。すなわち、
ポテンショスタットを用いて、０．７　Ｖ　（ｖ　ｓｐ
ｔ　）の電圧を固定化標品に印加するとともに固定化標
品を２Ｘ１０４Ｍのグルコース溶液に浸し、定席状態の
電流が流れるまでの時間（応答時間）を測定した。

比較例３として、実施例３と同様の方法で白金板上にに
一カラギーナンー酵素膜（酵素がに一カラギーナンのゲ
ルで包括された膜）を形成させてなる固定化酵素を４種
類つくった。この４種類の固定化酵素についても、実施
例３に記したと同様の方法で応答時間を測定した。

実施例３および比較例３で得られた各固定化酵素の応答
時間の測定結果を第１図に示す。ただし、○は実施例３
の固定化酵素、△は比較例３の固定化酵素の測定結果を
それぞれあられす。

第１図より、実施例３で得られた固定化酵素は（１５） いずれも比較例３で得られたものに比べ応答時間が短く
なっていることがわかる。これは、実施例３の固定化酵
素の拡散抵抗が比較例３のものに比べ低いためと考えら
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３および比較例３で得られた固定化酵素
の製造時におけるに一カラギーナンの使用量変化に対す
る応答時間の変化をあられずグラフである。 代理人　弁理士　　松　本　武　彦 （１６）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）官能基を有する担体にゲル化剤と生体触媒の混合
   物を塗布したあと、ゲル化剤をゲル化させ、生体触媒と
   担体の官能基を架橋したのち、ゲルを除去することを特
   徴とする固定化生体触媒の製法。
2. （２）ゲル化剤がに一カラギーナンおよびアスパラギン
   酸のうちの少なくとも一方である特許請求の範囲第１項
   記載の固定化生体触媒の製法。
3. （３）生体触媒が、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移
   酵素、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼの中から
   選ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の固定化生体触媒の製法。