JPS6349996B2

JPS6349996B2 -

Info

Publication number: JPS6349996B2
Application number: JP13935683A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Motai; Yaichi Fukushima; Kazutaka Imai; Katsutoshi Okamura
Original assignee: Fuji Deuison Kagaku Kk; KITSUKOOMAN KK
Current assignee: Fuji Deuison Kagaku Kk; KITSUKOOMAN KK
Priority date: 1983-08-01
Filing date: 1983-08-01
Publication date: 1988-10-06
Also published as: JPS6030684A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化された微生物菌体もしくは酵素
に関し、その目的とするところは、基質との反応
効率が著しく高められた固定化された微生物菌体
もしくは酵素のゲルを提供することにある。従来、微生物、酵素等をアルギン酸塩で包括固
定化する方法は、固定化に際し活性の低下が起り
難く、又食品衛生上安全な方法として近年食品、
医薬工業への応用が試みられている。そして通常、微生物菌体もしくは酵素をアルギ
ン酸塩で包括固定化する場合、アルギン酸塩の水
溶液に該微生物菌体もしくは酵素を懸濁したもの
を、通常のゲル化剤中に注射器もしくは多孔板等
より滴下もしくは流下させることにより、球状も
しくは糸状のゲルに成型されている。その際、ゲ
ル粒子径の調整は、一般に滴下の流速を調節する
ことにより行なわれているが、アルギン酸塩溶液
は粘度が高く、又液滴は液体の表面張力と重力と
のバランスにより形成されるため、滴下に使用さ
れるノズルの外径より大きい粒子径のものしか成
型することが出来ない。かくして、従来は２mm〜
５cm程度の粒子径のものが得られている。又ゲル包括法により固定化された微生物もしく
は酵素を用いて酵素反応を行なう場合、該酵素反
応を効率的に行なわせるには、該固定化ゲル中へ
基質を充分透過させることが極めて重要である。又固定化微生物を用いる場合、従来ゲル内の微
生物はゲル表面の近辺で増殖し易すく、該酵素反
応はゲルの表層近辺にしか寄与されない（福井等
編「酵素工学」第388〜395頁、東京化学同人社発
行）等のことが記載されている。一方、マイクロカプセル法により微生物菌体も
しくは酵素を固定化した場合、微小粒子の成型は
可能であるが、このような成型操作が煩雑である
ことの他、モノマー、重合触媒もしくは有機溶剤
等を使用するため、活性を著しく低下させる等の
欠点がある。本発明は、このような従来技術の欠点を解消
し、固定化された微生物菌体もしくは酵素のゲル
粒子径を500ミクロン以下とし、基質との反応効
率の著しく高められた固定化ゲルを容易に得るこ
とができるようにしたものである。即ち、本発明は、微生物菌体、酵素をタンニン
もしくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又
は酵素を不溶化担体に吸着したものを、水、また
は緩衝液、もしくは親水性有機溶媒、およびゲル
基材としてアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カ
リウム、もしくはアルギン酸アンモニウムと混合
した液を、ゲル化剤と噴霧接触させることにより
得られたゲル平均粒子径が500ミクロン以下の微
小ゲルからなる固定化された微生物菌体もしくは
酵素である。以下、本発明について詳述する。先ず、本発明に用いられる微生物菌体として
は、細菌、酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の
菌体でも良い。又酵素も如何なる種別のものでも
良く、例えばアルコール脱水素酵素、グルコース
オキシダーゼ、乳酸脱水素酵素等の酸化還元酵
素、Ｄ−グルタミルトランスフエラーゼ、グルタ
ミントランスアミネース、ヘキソキナーゼ等の転
移酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、ペニシリナーゼ等の加水分解酵
素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロシナ
ーゼ等のリアーゼ酵素、グルコースイソメラー
ゼ、マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グ
ルタチオンシンターゼ、NADシンターゼ等のリ
ガーゼ酵素等が代表例として挙げられる。上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架
橋試薬で不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担
体に吸着させる。先ず、タンニンで不溶化させる場合は、酵素量
に対し、１〜10倍量（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有
する溶液を加え、PH８以下、好ましくはPH３〜７
で撹拌しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より
例えば遠心分離、濾過等の通常の分離手段を用い
て不溶化酵素を得る。なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、
ピロガロールタンニン例えば没食子タンニン又は
五倍子タンニン、カテコールタンニン例えば茶、
カカオ等から得られるタンニン質分（カテコール
重合体）等が用いられる。これらのタンニンはタ
ンニン作用を有する限り精製されていないもので
も良く、例えば市販の柿渋タンニン等も用いられ
る。これらは単独でも２種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前
記酵素を１〜20％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を
含有する液に加え、５〜40℃で10分〜16時間反応
させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分離、
濾過等の通常の分離手段を用いて不溶化酵素を得
る。なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒ
ド類、イソシアネート類等が適しており、例えば
ジアルデヒドデンプングリオキザール、マロンア
ルデヒド、コハク酸アルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ピメリジアルデヒド、ヘキサメチレンイソ
シアネート、ｐ−トルイレンジイソシアネート等
が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望まし
い。そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段と
しては、通常の吸着剤、例えば活性炭、シリカゲ
ル、酸性白土、多孔質ガラス等、又DEAE−セフ
アデツクス、CM−セフアデツクス、DEAE−セ
ルロース、CM−セルロース、アンパーライトIR
−45、ダウエツクス−50等のイオン交換体等の不
溶化担体をカラムに詰めて前記酵素を通液する
か、又は該不溶化担体を酵素と混合、撹拌して吸
着させた後、これを必要により例えば遠心分離、
濾過等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵
素を得る。なおその後、必要により、該酵素を吸
着した不溶化担体に前記多官能性架橋剤を加えて
反応させてもよい。次に、上記した微生物菌体、酵素をタンニンも
しくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は
酵素を不溶化担体に吸着したものを、水、または
緩衝液、もしくは親水性有機溶媒、およびゲル基
材としてアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリ
ウム、もしくはアルギン酸アンモニウムと常温〜
50℃程度で混合してゲル基材が溶解した液を得
る。これに用いる緩衝液としては、例えば酢酸緩衝
液、マツキルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられ、又
親水性有機溶媒としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、プロピルアルコール、アセトン
等が挙げられ、これらの有機溶媒は通常10〜20％
（Ｗ／Ｖ）程度で用いられる。なお、上記した微生物菌体、酵素を不溶化した
もの、もしくは酵素を不溶化担体に吸着したもの
と、水、または緩衝液、もしくは親水性有機溶
媒、およびゲル基材との混合は、これらを同時に
混合してもよく、また上記した微生物菌体、酵素
を不溶化したもの、もしくは酵素を不溶化担体に
吸着したものを水、または緩衝液、もしくは親水
性有機溶媒に懸濁し、これにゲル基材またはその
溶液を加え混合してもよく、さらにまたゲル基材
を水、または緩衝液、もしくは親水性有機溶媒に
溶解した液に、上記した微生物菌体、酵素を不溶
化したもの、もしくは酵素を不溶化担体に吸着し
たものを加え混合してもよい。そしてゲル基材としてのアルギン酸ナトリウ
ム、アルギン酸カリウム、もしくはアルギン酸ア
ンモニウムは通常0.5〜4.0％（Ｗ／Ｖ）、好まし
くは1.0〜2.0％（Ｗ／Ｖ）程度用いられ、常温〜
50℃程度で混合、溶解される。次に上記した如くゲル基材を混合し溶解した溶
液を、噴霧器、好ましくは加圧噴霧器を用いてゲ
ル化剤と噴霧接触させることによりゲル平均粒子
径が500ミクロン以下の微小な固定化された微生
物菌体もしくは酵素を得る。これに用いるゲル化剤としては例えば塩化カル
シウム、酢酸カルシウム、硫酸アルミニウム、塩
化アルミニウム等が用いられ、これらは通常１〜
10％（Ｗ／Ｖ）程度の濃度の溶液として用いられ
る。そして固定化された微生物菌体もしくは酵素を
得る際の噴霧接触手段としては、通常加圧噴霧用
ノズルを用いて噴霧するのが好ましい。その際、
圧力ノズルとしては例えば単純ジエツト型ノズ
ル、衝突ジエツト型ノズル、渦巻き型ノズル、２
流体型ノズル等の加圧噴霧ノズルが用いられる。
また、回転円板噴霧器もしくは音波、静電気、振
動等を利用した噴霧器等も用いられる。そして加
圧噴霧する場合の噴霧圧力は0.5〜600Kg／cm²・
Ｇ、好ましくは１〜120Kg／cm²・Ｇ程度である。又、これらの加圧噴霧条件は、使用する菌体及
び酵素の種類、アルギン酸塩の濃度、ノズルの種
類等により影響を受けるので、それにより適宜選
択される。そして固定化された微生物菌体もしくは酵素の
ゲル粒子の大きさは、本発明においては平均粒子
径が500ミクロン以下となるように調整し、この
ような微粒子とすることにより基質との反応効率
を著しく高めることが出来る。そして、本発明においては、固定化微生物菌体
を上記の如く、500ミクロン程度以下の微粒子と
することにより、例えば該菌体を用いて発酵させ
る際、予じめ培養培地で培養することにより該菌
体を増殖させる操作も不要となり、該微生物菌体
を直接発酵に供し得る等の格段に優れた利点を有
する。以上の如く、本発明により固定化された微生物
菌体もしくは酵素を用いれば、基質との反応効率
を著しく高めることが出来、又該酵素を種々の基
質に繰り返し使用しても、該固定化された酸素含
有ゲルからの脱離が著しく抑制される等、本発明
は産業上極めて有意義である。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１タンニン酸〔和光純薬(株)製〕２ｇを20mlの
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶解したものと、
アスペルギルス・オリゼーFERM Ｐ−1149の〓
培養物より硫安分画し、DEAE−セルローズを用
いて精製したロイシン・アミノペプチダーゼ標品
200mgを20mlの0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶
解したものとを充分混合し、該ロイシン・アミノ
ペプチダーゼを不溶化（沈澱）させた。該沈澱物を常法により遠心分離した後、上述の
トリス緩衝液（PH7.0）で２回洗滌した。得られた不溶化酵素（乾物量として300mg）に
１％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム〔和光純薬
(株)製〕水溶液20mlを加えて混合し、これをエアー
レス・スプレイヤー〔２流体型、ノズル口径：
0.5mm、噴霧圧力：3.0Kg／cm²・Ｇ、英国バーゲス
社製〕で５％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に
加圧噴霧し、平均粒子径100〜250ミクロンの微粒
子状に固定化されたロイシン・アミノペプチダー
ゼを得た（実施例１の固定化酵素）。実施例１の固定化酵素の活性を、従来法で固定
化されたロイシン・アミノペプチダーゼである対
照−１および対照−２の活性と比較した結果は第
１表に示すとおりである。なお、対照−１：上記の不溶化酵素（ロイシン・アミ
ノペプチダーゼ）300mgに１％（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸ナトリウム水溶液20mlを加えて混合し、これ
を注射器（口径：２mm）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）
塩化カルシウム溶液中に滴下して得た平均粒子径
５mmの球状に固定化されたロイシン・アミノペプ
チダーゼであり、対照−２：上記の不溶化酵素（ロイシン・アミ
ノペプチダーゼ）300mgに１％（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸ナトリウム水溶液20mlを加えて混合し、これ
を注射器（口径：１mm）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）
塩化カルシウム溶液中に滴下して得た平均粒子径
２mmの球状に固定化されたロイシン・アミノペプ
チダーゼである。また、相対酵素活性の測定試験は、上記各固定
化酵素（0.2ｇ）を用いてそれぞれロイシン−ｐ
−ニトロアニリドを基質として中台の方法〔中台
忠信、日本醤油研究所報告３、99（1977年）〕で測
定することにより行ない、得られた活性値を、対
照−１の標品（酵素活性値：100％）と比較した
相対酵素活性値（％）を示したものが第１表であ
る。

【表】第１表より明らかな如く、実施例１の固定化酵
素は、対照の固定化酵素の何れに比しても著しく
酵素活性値の高いものである。実施例２豚の心臓起源の乳酸脱水酵素（ベーリンガー社
製）100mgを0.05M酢酸緩衝液（PH7.0）20mlに溶
解し、25％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒド水溶液
を５ml加え、撹拌しつつ20℃で30分間反応させ、
得られた不溶化酵素を常法により遠心分離した
後、0.05M酢酸緩衝液（PH5.5）300mlで洗浄後、
不溶化酵素を得た。得られた不溶化酵素50mgに0.05M酢酸緩衝液
（PH5.5）50mlを加え懸濁した液に、２％（Ｗ／
Ｖ）アルギン酸ナトリウム水溶液50mlを加えて混
合し、これをワグナーハンデイーペインターＷ−
170（２流体型、ノズル口径：0.7mm、日本ワグナ
ースプレーテツクス社製）で５％（Ｗ／Ｖ）塩化
カルシウム溶液中に噴霧圧力120Kg／cm²・Ｇで加
圧噴霧し、平均粒子径100〜250ミクロンの微粒子
状に固定化された乳酸脱水素酵素を得た（実施例
２の固定化酵素）。実施例２の固定化酵素の活性を、従来法で固定
化された乳酸脱水素酵素の活性と比較した結果は
第２表に示すとおりである。なお、対照−１：上記の不溶化酵素（乳酸脱水素酵
素）50mgに0.05M酢酸緩衝液（PH5.5）50mlを加
えて懸濁した液に、２％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナ
トリウム水溶液50mlを加えて混合し、これを注射
器（口径：２mm）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）塩化カ
ルシウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径５
mmの球状に固定化された乳酸脱水素酵素であり、対照−２：上記の不溶化酵素（乳酸脱水素酵
素）50mgに0.05M酢酸緩衝液（PH5.5）50mlを加
えて懸濁した液に、２％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナ
トリウム水溶液50mlを加えて混合し、これを注射
器（口径：１mm）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）塩化カ
ルシウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径
1.5mmの球状に固定化された乳酸脱水素酵素であ
る。また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固
定化酵素（0.2ｇ）を用いてそれぞれピルビン酸
を基質としてストルセンバツハの方法〔ストルセ
ツバツハ、メソツド・イン・エンチモロジ−９、
278〜288（1966）〕で測定することにより行ない、
得られた活性値を、対照−１の標品（酵素活性
値：100％）と比較した相対酵素活性値（％）を
示したのが第２表である。

【表】第２表より明らかな如く、実施例２の固定化酵
素は、対照の固定化酵素の何れに比しても著しく
酵素活性値の高いものである。実施例３サイロイド244〔富士デヴイソン化学(株)製〕１ｇ
とウレアーゼ〔タイプ９、シグマ社製〕100mgを
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に加えて混合し、
５℃で約１時間撹拌することによりウレアーゼを
該サイロイドに吸着させ、次いでこれを常法によ
り遠心分離した後、上記トリス緩衝液（PH7.0）
で洗滌した。得られたサイロイドに吸着した酵素50mgを、１
％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム水溶液20mlに
懸濁し、これを実施例１で用いたエアーレス・ス
プレイヤーで５％（Ｗ／Ｖ）塩化アルミニウム溶
液中に噴霧圧力2.5Kg／cm²・Ｇで加圧噴霧して平
均粒子径150〜300ミクロンの微粒子状に固定化さ
れたウレアーゼを得た（実施例３の固定化酵素）。実施例３の固定化酵素の活性を、従来法で固定
化されたウレアーゼである対照の活性と比較した
結果は第３表に示すとおりである。なお、対照は、上記のサイロイドに吸着した酵
素（ウレアーゼ）50mgを１％（Ｗ／Ｖ）アルギン
酸ナトリウム水溶液20mlに懸濁し、これを注射器
（口径：１mm）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）塩化アル
ミニウム溶液中に滴下して得られる平均粒子径
1.5mmの球状に固定化されたウレアーゼである。また、相対酵素活性の測定試験は、上記の各固
定化酵素（0.2ｇ）を用いてそれぞれ尿素を基質
としてライセルの方法〔ライセル・エフ・ジエ
ー、ジ・エンチームス３版、４、１〜21（1971）〕
で測定することにより行ない、得られた活性値
を、対照の標品（酵素活性値：100％）と比較し
た相対酵素活性値（％）を示したのが第３表であ
る。

【表】第３表より明らかな如く、実施例３の固定化酵
素は対照の固定化酵素に比し著しく酵素活性値の
高いものである。実施例４グルコース２％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）、及び食塩
10％（Ｗ／Ｖ）を含む培養培地（PH5.5）１を
３フラスコに入れ、常法により殺菌した後、該
培地にサツカロミセスルキシーATCC10383の種
培養液10mlを接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。得られた培養終了液１を遠心分離して集菌
し、これを凍結乾燥した後、５ｇの乾燥酵母菌体
を得た。得られた酵母菌体５ｇを１％（Ｗ／Ｖ）アルギ
ン酸アルモニウム水溶液500mlに懸濁し、これを
３の密閉圧力容器に投入し、これにヘリウムガ
スを導入後、該圧力容器内の圧力を10Kg／cm²・Ｇ
に調整し、次いでノズル〔1/4MKBO 8038型、
ノズル口径：0.4mm、いけうち(株)製〕のコツクを
開け、５％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に加
圧噴霧して平均粒子径100〜250ミクロンの微粒子
状に固定化された酵母菌体を得た（本発明‐１の
固定化酵母）。なお、本発明‐２は上記酵母菌体５ｇを１％
（Ｗ／Ｖ）アルギン酸アンモニウム水溶液500mlに
懸濁し、これを３の密閉圧力容器に投入し、こ
れにヘリウムガスを導入後、該圧力容器内の圧力
を８Kg／cm²・Ｇに調整し、次いでノズル〔1/4
MKBO 8038型、ノズル口径：0.4mm、いけうち
(株)製〕のコツクを開け、５％（Ｗ／Ｖ）塩化カル
シウム溶液中に加圧噴霧して平均粒子径450〜500
ミクロンの微粒子状に固定化した酵母菌体であ
る。次に上記の本発明‐１および本発明‐２の固定
化酵母菌体のアルコール生産性を、以下に示す固
定化された酵母菌体である対照‐１、対照‐２お
よび対照‐３のアルコール生産性と比較した結果
を第４表に示す。なお、対照：−１上記の酵母菌体５ｇを１％（Ｗ／
Ｖ）アルギン酸アンモニウム水溶液500mlに懸濁
し、これを注射器（口径：２mm）を用いて５％
（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に滴下して得ら
れる平均粒子径５mmの球状に固定化された酵母菌
体であり、対照−２：上記の酵母菌体５ｇを１％（Ｗ／
Ｖ）アルギン酸アンモニウム水溶液500mlに懸濁
し、これを注射器（口径：１mm）を用いて５％
（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に滴下して得ら
れる平均粒子径２mmの球状に固定化された酵母菌
体であり、対照−３：上記対照−２の固定化酵母菌体をカ
ツターナイフで切断して得られる平均粒子径700
〜900ミクロンに固定化された酵母菌体である。また、アルコール生産性の測定は、グルコース
８％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エ
キス0.3（Ｗ／Ｖ）、及び食塩18％（Ｗ／Ｖ）を含
む培地（PH5.4）100mlを500フラスコに入れ、
常法により殺菌した後、該培地に上記の各固定化
酵母（湿潤菌体）５ｇ加え、夫々の培地で30℃、
３日間経時的に静置培養した培養液のアルコール
濃度を測定することにより行なつた。その結果を
第４表に示す。

【表】第４表より明らかな如く、平均粒子径が500ミ
クロン以下の固定化酵母（本発明−１、２）を用
いれば、対照の固定化酵母の何れを用いた場合よ
りもアルコール生成量は著しく向上することが認
められた。又、本発明の如く、平均粒子径を500
ミクロン以下の微粒子とすれば、予じめ培養培地
で培養することによる該菌体の増殖操作を全く行
うことなく該酵母菌体を直接発酵に供しても、著
しく短時間（ほぼ20hr程度）でアルコール発酵の
定常期に達し得ると言う格段に優れた効果が認め
られた。

Claims

【特許請求の範囲】１微生物菌体、酵素をタンニンもしくは多官能
性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を不溶化
担体に吸着したものを、水、または緩衝液、もし
くは親水性有機溶媒、およびゲル基材としてアル
ギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、もしく
はアルギン酸アンモニウムと混合した液を、ゲル
化剤と噴霧接触させることにより得られたゲル平
均粒子径が500ミクロン以下の微小ゲルからなる
固定化された微生物菌体もしくは酵素。２ゲル化剤が塩化カルシウム、酢酸カルシウ
ム、硫酸アルミニウム、及び塩化アルミニウムよ
り選ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲
第１項記載の固定化された微生物菌体もしくは酵
素。３多官能性架橋試薬がグルタルアルデヒドであ
る特許請求の範囲第１項記載の固定化された微生
物菌体もしくは酵素。