JPS638121B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は例えば固定酵素及び他の生物学的活性
剤の担体としての有用性を初めとする種々の化学
的性質を有する比較的安価で安定な物質としての
多孔性セルロースビーズの製造方法に関するもの
である。 通常のセルロース粒子及び再生セルローズ粉末
は酵素を固定することのできる良好な担体として
の要件の殆んどすべてを満足するけれども、これ
らはカラム反応器にぎつしりと詰つてしまい、そ
の結果流動性の低下及び時には偏流を生じ、その
ため固定酵素と反応流動体との接触が不十分とな
るという欠点がある。不溶性の担体上に酵素を固
定することは酵素の実用的利用のために広く行わ
れており、それぞれの所望の用途のために新しい
酵素を使用する必要がなくなる。酵素の固定によ
り安定化が達成され、有効な酵素の使用及び連続
式の酵素反応器の設計及び操作が可能である。 固定酵素の実用上の成功は固定に使用する担体
の性質に大きく左右される。従つて、すぐれた担
体とは安価であるという要件を満足し、且つ反応
器での使用が容易であるための物理的形状を有す
るものである。これについては、球状ビーズの形
が特に好ましいものであり、何故ならばこれは充
填床、流動床、展開床、撹拌タンク、その他の普
通の型の化学反応器中で使用できるからである。
この担体はまた高いカラム中に充填してもつぶれ
たり変形しないという様な適切な物理的及び機械
的強度を持たねばならない。崩潰及び変形すると
カラムが緊密にに詰つてしまい、カラム中の液剤
の流れが妨げられ化学反応器の効率が低下する。
また、適当な担体は表面吸収のみならず、イオン
性又は化学共有結合により担体上への酵素及び他
の生物学的剤の固定を容易に達成し得るための
種々の化学的性質をもたねばならない。この点に
関して、担体は各単位担体が所望の酵素を多量に
固定することができるために多数の結合を形成す
る様大きな容量を有するべきである。即ち、高い
多孔度及び均一に分布した内部ボイド空間を有す
る担体が特に好ましいものである。この様な多孔
性によりセルロースビーズの内部ボイド空間中及
び空間から外への化学剤又は反応生成物の良好な
分散が達成される。担体は化学的に安定で物理的
に強度が大でなければならず、且つ長い活性寿命
を有する固定酵素系を得るために担体の劣化をも
たらす微生物によるアタツクを防ぐ不活性物質よ
りなるものでなければならない。 現在は通常多孔性ガラス及び多孔性セラミツク
粒子が酵素の固定に用いられており、この様な粒
子は前記の要件をほとんど満足するものであるが
比較例高価である。更に、ガラス及びセラミツク
担体への酵素の固定に使用できる化学反応の数に
も制限がある。 米国特許3947325、3905954、3573277、
3505299、3501419、3397198、3296000、3251824、
3236669、2843583、2773027、2543928及び
2465343号には種々の形状の種々のセルローズ物
質の製造が記載されており、これらのあるものは
酵素の如き生物学的に活性な物質又はイオン交換
基を固定するのに適していると記載されている。
しかし、これらの方法もまた高価であり、且つ得
られた製品は一般に充填床及び流動床の如き化学
反応器中で使用するのに望ましくない物理的形状
をもつているという欠点がある。特にこれらの先
行技術によつては全表面に均一に分布した孔及び
均一に多孔性である大きい内部ボイド空間を有す
る球状に成形したセルロースビーズの製造法は得
られていない。更に、先行技術のセルロース粒子
及び粉末は粒子寸法が小さいので化学反応器中に
使用するのに適していない。更に、先行技術のセ
ルロース粉末及び粒子は硬い表皮を有し、この表
皮のため分散が著しく阻害され化学反応器中での
使用の有効性が低い。 本発明は酵素の固定に好適の均一にして高度の
多孔性を有するセルローズビーズの製造方法に関
するものである。 これらのビーズは酵素、蛋白質、ヌクレイン酸
等の精製及び分離にも有用であることが発見され
た。更に、このビーズは金属イオンを含有する稀
薄溶液から該金属イオンを分離するのにも有用で
ある。 従つて、本発明の主目的は酵素又は他の生物学
的に活性な物質を固定することのできる担体とし
て有用である種々の化学的性質を有する安価で多
孔性が大きく且つ安定な粒子を製造する手段を提
供することである。 本発明の更に他の目的はセルロース誘導体を充
填床反応器中で操作するとき液体の適当な通過を
もたらす如き良好な機械的性質を有する高多孔性
の粒子に変換する方法を提供することである。 更に他の目的は酵素の高固定能を提供するに十
分に大きい表面積を有する多孔性セルロースビー
ズの製造方法を提供することである。 更に他の目的は化学反応器中で用いる場合、崩
壊したり変形したりすることのない改良された物
理的及び機械的強度を有する多孔性セルロースビ
ーズの製造方法を提供することである。 更に他の目的は酵素、蛋白質、ヌクレイン酸等
の精製及び（又は）分離に適するセルローズビー
ズの製造方法を提供することである。 更に他の目的は金属イオンを含有する稀薄溶液
から該金属イオンを分離するに適するセルロース
ビーズの製造方法を提供することである。 本発明の上記目的は下記の記載から更に明らか
となるであろう。 本発明によれば酵素及び他の生物学的剤として
使用するに適した多孔性セルロースビーズの製造
法が提供される。セルロースから製造した通常の
微結晶セルロース及び他の粒子は酵素の適当な担
体としての一般的要件の多くを満足するけれども
この様な粒子は加圧されると緊密に詰る傾向があ
りまた十分に多量の酵素を付着するに十分な多孔
性をもたらすことができない。セルロース誘導体
は一般に安価であり、本発明に従つて処理すると
一般に生物学的に不活性な化学反応用の非常に多
能的な物質が得られる。即ち、本発明のセルロー
ス誘導体ビーズは固定酵素の担体として使用する
のに望ましい多くの性質を提供する。 多孔性セルロースビーズを製造するためのセル
ロース誘導体の物理的性質を変更する本発明の方
法は次の工程を包含する、 (a) セルロース誘導体を不活性有機水混和性溶剤
に溶解し下記に定義する沈澱溶液の密度よりも
大なる密度を有する溶液を形成する； (b) 前記溶液を小滴状で沈澱溶液中に分散
（distribute）せしめて前記セルロース誘導体を
均一な多孔性のビーズの形状に沈澱せしめる； (c) 該溶液から沈澱ビーズを分離する； (d) 分離した多孔性ビーズを水で洗う； (e) 水洗したビーズを加水分解してビーズをセル
ロースに転換せしめ且つ酵素及び他の生物学的
剤の付着するための活性点を増加せしめる； (f) 加水分解したビーズを洗浄して多孔性セルロ
ースビーズを得る。 本発明によればセルロース誘導体を選択された
溶剤に溶解し、これを選択された沈澱溶液中に分
散せしめることにより高度に均一な多孔性を有し
且つすぐれた化学的及び物理的性質を有するセル
ロースビーズを製造することができる。本発明に
よつて製造したビーズは高度に多孔性である。孔
は一般にビーズの表面及び内部にわたつて均一に
分布している。溶剤及び沈澱溶液を適当に選ぶこ
とによりビーズの孔径を調節することが出来る。
本発明の方法によると孔径及び孔分布の両方を調
節することができるというのは特に有利である。
第２図及び第４Ａ及びＢ図に於いて孔開口部はビ
ーズの表面にわたつて均一に分布しており、その
寸法は約1000Åであり、この寸法は孔の中の酵素
及び試剤の分子が運動するのに適当な寸法であ
る。 不活性の水混和性有機溶剤は単独の液又はその
組合せでもよい。所望の形状及び多孔性を有する
多孔性セルロースビーズを得るためには不活性有
機溶剤及び沈澱溶液の正しい組合せを用いること
が重要である。不活性水混和性有機溶剤は液体の
組合せでよく、これはセルロース誘導体とともに
溶液を形成し、沈澱溶液と混合すると転相を起し
セルロース誘導体は多孔性ビーズの形で凝固す
る。即ち、不活性有機溶剤はセルロースアセテー
トの如きセルロース誘導体を溶解することができ
且つ沈澱溶液中に可溶の液体として特徴を有する
成分(a)を含有する。 溶剤系の第二の成分(b)は成分(a)に可溶であり且
つ沈澱溶液にも可溶の液体であり、これは最終溶
剤溶液（セルロース誘導体とともに）の密度が沈
澱溶液の密度よりも十分に高く、溶剤溶液を小滴
として沈澱溶液中に分散せしめたときセルロース
が凝固し所望の寸法及び多孔性の多孔性ビーズと
して沈澱析出するに十分な量で溶剤溶液中に存在
する。溶剤の成分(b)は溶剤溶液の小滴が沈澱溶液
と接触した際、その形状を保つ様に溶剤溶液の表
面活性を調節するのに用いられる。成分(b)はまた
沈澱したビーズの孔径及び多孔性を調節する作用
も行う。他の場合には、成分(a)及び（又は）成分
(b)を調製するのに１種以上の液体を使用するのが
適当である。 本明細書で使用する「沈澱溶液」という用語は
セルロース誘導体に対して非溶剤であり上記不活
性水混和性有機溶剤と混和し得る液体溶液と定義
する。例えばこの沈澱溶液は水又は水溶液でよ
い。この様に沈澱溶液は溶剤成分(a)及び(b)の両者
と混和性である。即ち、セルロース誘導体を有機
溶剤に溶解し、次に得られた溶剤溶液の小滴を沈
澱溶液に加えるとセルロース誘導体が凝固しセル
ロース誘導体の受ける転相により沈澱折出し、所
望の多孔性セルロースビーズが形成されるものと
理解される。 上で述べた様に、所望の多孔性セルロースビー
ズを製造するための上記方法には多くの変形が可
能である。セルロースアセテートの外に例えばセ
ルロースナイトレート及びメチルセルロースの如
き他のセルロース誘導体を多孔性ビーズの製造の
出発物質として使用できる。本発明で使用する
「セルロース誘導体」及び「加水分解性セルロー
ス誘導体」という用語は例えば加水分解又は水素
添加によつてそれからセルロースを再生し得る物
質を包含するものである。 セルロース誘導体に対する有機溶剤成分(a)及び
(b)は変えることができるが、セルロース誘導体に
対して不活性であり且つ完全に又は実質的に沈澱
溶液と混和し得るものであるべきである。セルロ
ース誘導体を不活性溶剤に添加することにより形
成された溶剤溶液の密度はこれが分散される沈澱
溶液の密度よりも高いことが第一に重要であり、
このことにより溶剤の小滴を沈澱溶液中に分散せ
しめたとき水溶液を撹拌しない時はこの小滴が沈
むことが重要なのである。水性沈澱溶液を用いる
場合適当な単独溶剤としては例えばジメチルスル
ホキサイド及びメチルアセテートがある。市販の
物質を溶剤成分(a)及び（又は）(b)として使用する
ことができ、これらの物質は水分を含んでいても
よく、この水分は或る場合には有利であることが
わかつた。 水性沈澱溶液を用いる場合、溶剤成分(a)として
アセトン、ホルムアミド、アセトンとメタノール
又はエタノールとの混合物、メチルアセテート、
メチレンジクロライドとメタノールとの混合物、
メチルエチルケトン及びメチルスルホキサイドよ
り成る群から選ばれる成分を使用するのが好まし
い。成分(b)はジメチルスルホキサイド、ホルムア
ミド、メチルアセテート、シクロヘキサン、メチ
レンジクロライド、エチレンジクロライド、メチ
レンジクロライドとメタノールとの混合物及びエ
チレンジクロライドとメタノールとの混合物より
成る群から選ぶのが好ましい。 好ましい溶剤成分(a)はアセトンであるが、他の
溶剤も適当に使用することができ、水性沈澱溶液
を使用する場合下記の物質から選ぶことができる
（混合物の比は容積基準の好ましい最小比であ
る。）。 成 分 (a) 最小比(容積) アセトン ‐‐‐ アセトン＋メタノール 60：40 アセトン＋エタノール 60：40 メチルアセテート ‐‐‐ メチレンジクロライド＋メタノール 80：20 ジメチルスルホキサイド ‐‐‐ メチルエチルケトン ‐‐‐ ホルムアミド ‐‐‐ 上記の如く、成分(a)の第一の作用はセルロース
誘導体を溶解することである。成分(b)の添加はセ
ルロース誘導体を沈澱溶液中に沈澱せしめるに必
要な密度を有する溶剤溶液を提供するのに必要で
ある。成分(b)もビーズの孔径及び均一な多孔性を
もたらす。 従つて、溶剤成分(b)は溶剤溶液の所望の比重を
もたらすものである。そして水性沈澱溶液を用い
る場合は成分(b)としてジメチルスルホキサイドを
用いるのが好ましい。或る場合には成分(a)と(b)と
は同じあつてもよく、即ち水性沈澱溶液とともに
用いる場合はジメチルスルホキサイド、ホルムア
ミド又はメチルアセテートであり得る。水性沈澱
溶液を用いる場合成分(b)として適当に使用し得る
種々の物質は次の通りである。 成 分 (b) 最小比(容
積） ジメチルスルホキサイド ‐‐‐ エチレンジクロライド＋メタノール 60：40 メチレンジクロライド＋メタノール 60：40 エチレンジクロライド ‐‐‐ メチレンジクロライド ‐‐‐ ホルムアミド ‐‐‐ シクロヘキサノン ‐‐‐ セルロース誘導体と不活性溶剤との溶液はコン
トロールされたセルロース誘導体対溶剤比を有す
るべきであり、その理由はこの比は得られたビー
ズの最終多孔性に影響を与えるからである。一般
に、この比が小さい場合（即ち溶剤の量が大きい
場合）多孔性の大きいビーズが得られる。１：20
乃至１：３（重量／容量）のセルロース対溶剤
（成分(a)と(b)を含む）の比は種々の特定の用途を
有するセルロースビーズを製造するのに適当であ
ることが発見された。好ましくは１：10乃至１：
６（重量／容量）のセルロース対溶剤比を用いて
取り扱い容易な溶液を得る。この溶液により少く
とも50容量％、好ましくは75―95％、最も好まし
くは約75―80％のボイド空間を有する望ましい性
質の多孔性セルロースビーズが得られる。より高
度の多孔性を有するビーズは一般により大きい割
合の均一に分布した内部ボイド空間を有し、これ
により分散が良好となるが、低多孔性のビーズよ
りも物理的強度がやゝ低下するであろう。 セルロース誘導体の溶液を分散すべき好ましい
沈澱溶液は一般に水より成るものであるが、その
表面張力を小さくし且つ多孔性ビーズの形成を促
進するために適当量の非イオン性又はイオン性表
面活性剤を含有する水溶液でもよい。沈澱溶液は
水とメタノール又はエタノール（容量比50：50）
との混合物を含有することも出来る。また、セル
ロース誘導体が不溶で、且つ必要な密度要件が満
足される限り沈澱溶液は水性のものでなくともよ
い。即ち、液体であり、密度が不活性有機溶剤の
密度よりも小さく且つそれと混和可能である限り
シクロヘキサン、ヘキサン、デカン、ベンゼン等
の如き炭化水素溶液も使用できる。セルロース誘
導体溶液をスプレーノズルの如き適当な手段によ
つてスプレーすることにより分散するときは、圧
力降下及び不活性溶剤の水溶液中への混和性によ
り分散を生じ、セルロース誘導体の多孔性ビーズ
が最終的に沈澱する。 当業者に理解される様に、セルロースビーズを
沈澱せしめる場合、セルロース誘導体を含有する
溶剤が沈澱溶液よりも大きい密度を有するために
は十分な量の溶剤成分(b)が存在しなければならな
い。第１表は水溶液中のセルロース誘導体を沈澱
せしめるための多くの不活性有機溶剤を示してい
る。示されている比は水よりも大きい密度を有す
る溶剤溶液を提供するために必要な最小のもので
ある。この表からわかる様に成分(b)の比重が大き
ければ大きい程、最小の密度を得るに必要な成分
の量が少くなる。 【表】 多孔性ビーズの沈澱後、酵素の付着に対してよ
り活性の大きい点（サイト）を形成するためにセ
ルロースを加水分解により誘導体から再生する。
ビーズの形成後セルロースをその誘導体から再生
する場合、普通セルロース物質中に存在する水酸
基のすべてを再生するために置換基（セルロース
アセテートからのアセテートの如き）を除去する
ことができる。再生の度合が高い程、得られたビ
ーズの安定性が大きくなる。酵素をセルロースビ
ーズ担体上に固定する或る場合には水酸基又は置
換基を酵素の付着を促進する官能化学基、例えば
アミノ基に転換するのが望ましい。 第１図は多孔性ビーズの粒径分布を示す。 第２図は多孔性セルロースビーズの走査電子顕
微鏡写真である。 第３図は多孔性セルロースビーズの圧力低下特
性のプロツト曲線である。 第４Ａ図は多孔性セルロースビーズの表面の走
査電子顕微鏡写真（×20000）である。 第４Ｂ図は多孔性セルロースビーズの内部の走
査電子顕微鏡写真である。 第１図について説明すると、これは前述の方法
によつてスプレーノズルからセルロース誘導体の
溶液を分散（噴射により）することによつて得ら
れた最終多孔性ビーズの粒径分布を示す。大き過
ぎたり、小さ過ぎるビーズは最終用途に応じて必
要ならば集めたり適当な溶剤中に再溶解してもよ
い。一般にカラム型の化学反応器中に用いる場
合、均一な寸法のビーズが好ましい。所望の粒径
はビーズの用途、例えば固定すべき酵素の種類に
応じて変化できる。 上記の方法によつて製造した多孔性セルロース
ビーズは一般に非常に高い多孔性を有し、0.05―
30ミクロンの調節した孔径を有する。セルロー
ス／溶剤溶液の調製に於いてセルロース対溶剤比
が１：10（重量／容量）の場合、最終ビーズは約
90％ボイドという高い多孔度を有する。この方法
によつて製造した多孔性セルロースビーズの走査
電子顕微鏡写真を第２図、第４Ａ図及び第４Ｂ図
に示す。これらの写真から得られたビーズのいく
つかの重要な特徴を知ることができる。第一に
は、ビーズは一般に形が球形であり、孔の開口部
はビーズの表面にわたつて均一に分布しているこ
とがわかる。このことは大ていの用途に対して、
望ましいものであり、それは均一な活性を有する
固定酵素触媒を得ることができるからである。セ
ルロースビーズのボイド相は連続的である。この
ことは望ましい特徴である。何故ならば不連続の
「気泡」により固定酵素系中に不用な役に立たな
い空間が出来るからである。第三に、ビーズ表面
に硬い「皮」が存在しないことである。硬い皮が
存在すると分散が妨げられる。最後に、孔径が全
く均一であることである。その結果、ビーズの内
部ボイド空間の内表面の全域が酵素固定及び酵素
触媒反応に利用することができる。高度の多孔性
及びその他の特徴により本発明の多孔性セルロー
スビーズが酵素の固定及び他の生物学的に活性な
試剤に対する用途に特に適する様になつたのであ
る。 酵素担体の重要な性質はこの担体を含む酵素反
応器中の種々の液体流量で生じる圧力の降下であ
る。例えばDEAE―セルロースが現在グルコース
からフルクトースへの転換用の酵素担体として工
業的に使用されている。DEAE―セルロースの場
合圧力降下が非常に大きく、その結果、適度の流
量を得るためには浅い床しか使用できない。充填
塔操作に於ける本発明の多孔性セルロースビーズ
の圧力降下特性は第３図の曲線Ａで示されてい
る。いわゆる（nominal）線流速度は供給液の容
積流量を塔の断面積で除することによつて計算す
る。実際の操作に於いては工業的塔の中の流速度
は0.5cm／秒以下であろう。例えば内径２フイー
ト（60.96cm）の反応塔の場合、線速度0.5cm／秒
は容積流量1389ガロン／時間（5254／時間）と
均等である。グルコースからフルクトースを製造
する典型的な工業操作に於いては供給液中の砂糖
濃度は約５ポンド・砂糖／ガロンである。上記の
流量により２フイートの塔で１年につき60000000
ポンド以上の製品が得られるであろう。酵素反応
の滞留時間要件のため線流速は普通0.5cm／秒以
下である。従つて本発明の多孔性セルロースビー
ズは酵素又はその他の生物学的活性剤を固定する
ことのできる担体として塔型化学反応器中で使用
する場合圧力降下に関して重大な工学上の問題を
起すことがないことがわかる。適当な誘導化の
後、多孔性セルロースビーズを他の可能な用途
（例えば果汁、ワイン又はビールからのタンニン
の除去、及び稀薄溶液からの金属イオンの除去）
に使用する場合、反応塔中の液体流速は上に述べ
た0.5cm／秒よりも著しく大きくすることができ
るであろう。 多孔性セルロースビーズの流れ特性及び他の物
理的及び機械的性質は２官能性及び（又は）多官
能性化合物で架橋することによつて向上せしめる
ことができる。第３図の曲線Ｂはトリレン―２，
４―ジイソシアネートによる処理及び酵素固定後
の多孔性セルロースビーズの圧力降下要件を示
す。線速度が２cm／秒では未処理のセルロースビ
ーズ（曲線Ａ）は圧縮し、かなり変形して圧力降
下の増大が顕著となる。曲線Ｂはごくわづか上に
向つてくぼんでおり、これは処理したビーズが殆
んど変形していないことを示す。 ビーズの加水分解の前か後で架橋剤で多孔性セ
ルロースビーズを処理するとその物理的強度が増
大する。ビーズ上に酵素が付着するとまたその物
理的強度が増大するであろう。例えばジイソシア
ネート（例えばトリレン―２，４―ジイソシアネ
ート又はヘキサメチレンジイソシアネート）で後
処理するとビーズは非常に堅く強くなる。エピク
ロロヒドリンによる架橋によつても多孔性セルロ
ースビーズの物理的性質は向上する。セルロース
及び澱粉を含めて多糖類の架橋の化学は物理科学
のよく発達した部門である。その他の適当な架橋
剤としては塩酸溶液中のホルムアルデヒド又はグ
ルタルアルデヒドがある。他の多くの炭水化物架
橋剤が例えば米国特許3905954号（Joneset al）
に記載の如く周知である。 一般に本発明の多孔性ビーズは次の工程によつ
て製造される。 (a) 加水分解可能な形のセルロースを通常セルロ
ース誘導体対溶剤の比（重量：容量）１：20乃
至１：３のコントロールされた割合で不活性水
混和性有機溶剤中に溶解して溶剤溶液を製造す
る。溶剤は沈澱溶液と完全に又は実質的に混和
可能なものでなければならず、また溶剤溶液の
密度は沈澱溶液と接触した際溶剤が沈澱溶液と
容易に混和可能となりセルロース誘導体がその
中に沈澱するに十分なものでなければならな
い。 (b) 溶剤溶液を小滴の形状で沈澱溶液中に分散
（例えば噴射により）する。表面活性剤を含有
することのできる沈澱溶液と接触すると溶剤は
溶液媒体中に分散しセルロース物質の多孔性ビ
ーズが凝固し、且つ沈澱溶液を含むタンクの底
に沈澱する。セルロース誘導体はスプレーノズ
ルから沈澱溶液浴中に加圧下噴射するのが好ま
しい。必要ならば、前記の浴は撹拌してビーズ
の形成を促進してもよい。 (c) 沈澱したビーズは洗浄後、セルロースを再生
するために加水分解して酵素の付着のための活
性サイトを有する多孔性セルロースビーズが得
られる。必要ならば多孔性ビーズの安定性を増
大するために、または適当な反応サイトを得る
ために種々の方法でビーズを化学的に変性せし
めてもよい。例えば大きな安定性と増大した物
理的強度とを得るためにビーズを架橋してもよ
い。また、正に荷電した基又は負に荷電した基
を化学的に置換してセルロースビーズの表面吸
収性を変化せしめてもよい。セルロース自身は
一般に親水性であり、従つて、その反応サイト
を変えることによりその親水性を変えることが
できる。 本発明は更に上記多孔性セルロースビーズ上へ
の付着により酵素又は他の生物学的活性剤を固定
することのできる方法を提供するものである。例
えば、多孔性セルロースビーズを従来法により
Ｎ，Ｎ―ジエチル ２―クロロエチルアミンハイ
ドロクロライドと反応せしめて該ビーズをジエチ
ルアミノエチル（DEAE）セルロースに転換する
ことができる。この様にして得られたビーズは
DEAE―セルロースを含有し、これはストレプト
ミセス菌株から誘導したグルコースイソメラーゼ
を付着せしめるのに有効であつた。また、シアノ
ゲンブロマイドを用いる方法によりグルコースイ
ソメラーゼを固定した。 多孔性セルロースビーズ上への酵素の固定を行
うための他の方法としてはトリレン―２，４―ジ
イソシアネートを用いるものがある。セルロース
を架橋して多孔性ビーズの物理的強度を向上せし
めるのにジイソシアネートを用いた。しかし、本
発明の多孔性セルロースビーズはジイソシアネー
トで処理すると単にジイソシアネート―処理ビー
ズを酵素溶液と混合するだけでその表面に酵素を
固定することができることを発見した。例えば、
グルコアミラーゼを用いた場合、ジイソシアネー
トビーズは乾燥ビーズの１グラム当り1000国際単
位以上の酵素を付着した。次の如き理論によつて
本発明を限定するものではないが、乾燥多孔性セ
ルロースビーズを触媒（例えばトリエチルアミ
ン）の存在下トリレン―２，４―ジイソシアネー
トとともに乾燥アセトン中においた場合ビーズの
物理的強度が向上することに鑑みセルロース分子
間に可成りの程度の架橋が起つているものと考え
られる。反応を十分な時間行つた後、ビーズを乾
燥アセトンで洗浄し遊離のジイソシアネート残基
を除去した。セルロースビーズは多数のイソシア
ネート基を有するものと思われる。処理したビー
ズを酵素水溶液と混合すると酵素分子はイソシア
ネート基を介してセルロースビーズと共有結合す
るものと考えられる。また、処理したビーズを水
で洗うことによりイソシアネート基がアミノ基に
転換することも発見された。この様にして、本発
明者等は（ビーズ及び酵素上の）アミノ基と反応
し且つ架橋し得るものとして周知のグルタルアル
デヒドにより酵素であるグルコアミラーゼをアミ
ノセルロースビーズに固定することに成功した。 本発明によつて製造した多孔性セルロースビー
ズは酵素、ヌクレイン酸等の分離及び精製にも使
用できる。本発明の方法によつて製造した多孔性
セルロースビーズは誘導化してDEAE―多孔性セ
ルロースビーズを製造することができ、このビー
ズはすぐれた流動性を有し、しかもカラムクロマ
トグラフイーとして知られている技術による現在
市販の製品と同程度に有効に酵素、蛋白質、ヌク
レイン酸等を分離することがでできる。 また、本発明の多孔性セルロースビーズを
DEAE以外の基で誘導化することができる。即
ち、本発明の多孔性セルロースビーズは多数の特
定の用途に適用することができる。例えば特定の
官能基を多孔性セルロースビーズに付着せしめる
ことができ、蛋白質を有する誘導化ビーズの床中
に果汁を通すことにより果汁からタンニンを除去
するのに使用することができる。 同様なやり方で、金属イオンを含有する稀薄溶
液から金属イオンを除去することができる。この
様な方法は稀釈した採鉱溶液からの価値のある金
属イオン（即ち銅イオン及び金イオン）の回収法
を提供し、酸溶液による鉱石からの金属の抽出の
ための現行の溶液採鉱法への特別の適用が可能で
ある。 下記の実施例は本発明を更に詳細に示すもので
あり、本発明の範囲はこれによつて限定されるも
のではない。 実施例 50ｇのセルロースアセテート（イーストマンコ
ダツクケミカル社製Vise3）を400mlの溶剤Ａ（容
量比６：４のアセトンとジメチルスルホキサイド
とから成る）中に溶解し12.5％（重量／容量）溶
液を生成した。次にスプレーガン（シアーズ リ
ユーベツク カンパニー社のペイントスプレーヤ
ー）により40ガロンの水と４滴の普通の家庭用洗
浄剤とを含む水槽中に前記セルロース溶液を
20psiの空気圧で微細水滴状で噴射した。水の表
面と接触するとセルロースアセテート小滴は多孔
性ビーズに凝固し底に沈んだ。次に多孔性ビーズ
を捕集し洗浄した。次にこの洗浄したビーズを約
0.15Nの水酸化ナトリウムにより室温で一晩脱ア
セチル化した。次にこの脱アセチル化したビーズ
を洗浄し吸引乾燥し50容量％より大なるボイド空
間を有する多孔性セルロースビーズを得た。この
ビーズは直ちに酵素固定に使用できるものであつ
た。第１図は得られた多孔性ビーズの寸法分布を
示す。電子顕微鏡写真はビーズが一般に球状であ
り、内部及び表面の構造が同じであることを示し
ている。孔径は全く均一であり、孔は第２図、４
Ａ図及び４Ｂ図に示す様にビーズ全体に均一に分
布していた。ビーズの孔径は走査電子顕微鏡写真
から決定した。走査顕微鏡写真撮影には乾燥試料
が必要であり、空気中でビーズを乾燥すると孔径
が収縮するので液体二酸化炭素により臨界点法に
よつて乾燥した。孔径は約1000Åであつた。 実施例 実施例の方法に従つて溶剤Ａ中の10％（重
量／容量）セルロースアセテート溶液を用いて多
孔性ビーズを形成した。このビーズは酵素固定に
用いるのに適していた。 実施例 溶剤Ｂ（容量比７：３のアセトンとホルムアル
デヒド）を用いて10％（重量／容量）セルロース
アセテート（イーストマンコダツクケミカル社の
Visc3）溶液を製造した。次にこのセルロースア
セテート溶液を実施例に従つて噴射し加水分解
した。50容量％よりも大きいボイド空間を有する
高度に多孔性のセルロースビーズが得られた。 実施例 Visc45型のセルロースアセテート（イースト
マンコダツクケミカル社）で製造した溶液を用い
て上記実施例を繰り返した。酵素固定にとつて
すぐれた性質を有する多孔性ビーズが得られた。 実施例 溶剤Ａ中のセルローストリアセテート（イース
トマンコダツク社）の10％重量／容量溶液を用い
て実施例の操作を行つた。得られたビーズは酵
素固定に対してすぐれた多孔性を示した。本発明
者達が認めた様にセルロースは酵素及び他の生物
学的活性剤の固定のための支持物質として使用す
ることができる。セルロースは安価であり、化学
的に安定であり微生物による汚染に対して耐性を
もつているので多くの研究者がセルロースを支持
体として選んでいる。また、セルロースは各アン
ヒドロ―グルコース単位上に３個の水酸基をもつ
ており、この単位は所望の物質の固定に対して大
きいキヤパシテイと高い多能性とをもたらすので
ある。 支持物質としてセルロースを用いる場合の主な
欠点はセルロースは繊維状の形状をもつており、
必要な機械的強度を欠いているということであ
る。セルロースを充填した反応器は流通性が悪
く、圧力降下が非常に大きく且つ時に偏流を生じ
る。これらの問題を解消するために本発明者等は
本発明によりセルロースをビーズの形につくつた
が、このビーズは従来のものよりもすぐれた機械
的強度と高い流通性とを示した。しかし、本発明
のセルロースビーズの構造は通常のセルロースの
構造と異つているので酵素の充填量及び固定酵素
の安定性が通常のセルロースとは異つているであ
ろう。固定酵素の製造のための化学はセルロース
ビーズ上の酵素の担持量及び安定性に影響を与え
るのみならず、セルロースビーズの機械的強度に
も影響する。セルロースビーズの機械的強度を増
大せしめる酵素の固定化のための化学的方法は実
施例から明らかな如く反応器中の流通性を向上せ
しめる。 実施例 実施例に従つて製造した多孔性セルロースビ
ーズ１ｇを水酸化ナトリウムでPH11.5に調整し且
つ20℃の定温に保つた水15ml中に分散した。１ｇ
のシアノゲンブロマイドをこの分散液に添加し
た。PHを1NNaOHで11.5に保つた。15分後、ビ
ーズをPH＝7.0且つ０℃でホスフエート緩衝剤
（0.1M）で洗浄した。次に15mlのグルコアミラー
ゼ溶液（30mg／ml）をビーズに添加した。この混
合物を一晩放置した。この様にして製造したビー
ズは60℃に於いて基質として５％マルトースを用
いた場合ビーズの乾燥重量で１ｇ当り1830単位の
酵素活性度を有していた。酵素活性度１単位は１
分につき１ミクロモルの製品を製造する単位とし
て定義する。 応用 実施例で得られた多孔性セルロースビーズ
（0.2ｇ）を５mlのアセトン中に分散した。0.2ml
のトリレン―２，４―ジイソシアネートの添加と
ともに0.2mlのトリエチルアミンを前記分散液に
添加した。30分後、ビーズをアセトンで洗浄し、
次にPH4.75のアセテート緩衝剤で洗つた。５mlの
グルコアミラーゼ溶液（25mg／ml）を添加した。
かくして酵素がビーズ上に2000単位／ｇセルロー
スビーズの活性度をもつて固定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多孔性ビーズの粒径分布を示
すグラフであり、第２図は本発明の多孔性ビーズ
の走査電子顕微鏡写真であり、第３図は本発明の
多孔性ビーズの圧力降下特性を示すグラフであ
り、第４Ａ図及び第４Ｂ図はそれぞれ本発明多孔
性ビーズの表面及び内部の走査顕微鏡写真であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 加水分解可能なセルロースアセテートを
   不活性水混和性有機溶剤中にセルロースアセテ
   ートと溶剤との比が１：20乃至１：３重量／容
   量の範囲にある様に溶解し沈澱溶液よりも密度
   の大なる溶液を形成し、 (b) 前記得られた溶液を小滴状で沈澱溶液中に分
   散せしめて、前記セルロースアセテートを均一
   多孔性のビーズの形に沈澱せしめ、 (c) 前記沈澱ビーズを溶液から分離し、 (d) この分離した多孔性ビースを水で洗浄し、 (e) 洗浄したビーズを加水分解してビーズをセル
   ロースに転換せしめ且つ酵素及び他の生物学的
   剤の付着のための活性サイトを増大せしめ、 (f) 前記加水分解したビーズを洗浄して50容量％
   よりも大なる均一に分布したボイド空間を有す
   る多孔性セルロースビーズを得る工程より成る
   実質的に球状の多孔質セルロースビーズであつ
   て、 (1) その粒径分布は0.59―0.84mm径の範囲に最
   大値を示し、 (2) 表面の全面に均一に分布した孔と、大きな
   均一多孔性の内部ボイド空間とを有し、上記
   孔の大きさは0.05―30ミクロンであり、上記
   ボイド空間は連続しており且つ少くとも50％
   （容積）を占め、 (3) カラムに充填しても崩潰又は変形せずカラ
   ムを詰まらせないような物理的、機械的強度
   を有する多孔性セルロースビーズの製造方
   法。 ２ 分散を噴射によつて行う特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 沈澱溶液が水、水とエタノール又はメタノー
   ルとの混合物、ヘキサン、シクロヘキサン、オク
   タン及びベンゼンより成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 沈澱溶液が水である特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 ５ セルロース誘導体がセルロースアセテートで
   あり、加水分解を苛性溶液中で行う特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ６ 溶剤が(a)アセトン、アセトンとメタノール又
   はエタノールとの混合物、メチルアセテート、メ
   チレンジクロライドとメタノールとの混合物、メ
   チルエチルケトン、ホルムアルデヒド及びジメチ
   ルスルホキサイドからなる群から選択した一員と
   (b)ジメチルスルホキサイド、ホルムアミド、メチ
   ルアセテート、シクロヘキサノン、メチレンジク
   ロライド、エチレンジクロライド、メチレンジク
   ロライドとメタノールとの混合物及びエチレンジ
   クロライドとメタノールとの混合物よりなる群か
   ら選んだ一員との混合物である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ７ 溶剤がジメチルスルホキサイド、ホルムアミ
   ド又はメチルアセテートである特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 ８ ビーズのボイド空間が約75乃至95％である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。