CN113231049A - 一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用,所述制备方法包括如下步骤:(1)将含琼脂糖的分散相与含乳化剂的连续相于微通道反应装置中反应,所得反应液于收集液中固化,得到琼脂糖微球;(2)将步骤(1)所得琼脂糖微球依次经如下步骤处理后得到交联琼脂糖亲和介质;(i)溶胀、活化、多羟基聚合物修饰;(ii)交联;(iii)活化、偶联亚氨基二乙酸配基;(iv)螯合镍离子。经修饰后的微球,用于酶的纯化和固定,解决了酶在复杂的分离纯化的过程中易失活和无法回收再利用等问题,同时合成的亲和介质用于酶的纯化,降低了酶液中杂酶对产物的影响,此方法制备胞苷酸,具有反应条件温和,绿色环保等优势。
Description
技术领域
本发明属于酶的催化及应用技术领域,具体是一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与在纯化酶和酶催化产胞苷酸中的应用。
背景技术
酶是一种由细胞产生的具有催化能力的生物催化剂,其本质上是一种蛋白质,它具有较高的催化效率,高度的专一特性,生物体内的各种化学反应都是在酶的催化作用下完成的。
酶的催化合成可以是一种或多种酶催化反应,反应既可以为平行进行的,也可以是并联合成更加复杂的化合物。在多酶体系中,酶进行有效催化需要辅酶因子的参与,如NADH、ATP等。ATP作为反应中的磷酸供体,价格昂贵。但用乙酸激酶催化乙酰磷酸和ADP生成ATP,可形成ATP的能量再生循环,促进反应的进行,乙酰磷酸价格便宜,利用乙酸激酶催化的ATP的再生,达到了节约成本的目的。
为了满足对一些大分子量的底物进行有效的催化,需要将酶工程重组的酶破碎获得粗提液,进行分离纯化得到的酶可用于底物的高效催化。目前蛋白质的分离纯化有沉淀法如盐析、生物碱或酸沉淀法;层析法如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析;离心法等。对于不同的目标酶而言,不同的纯化方法有其特定的优点和缺点。固定化金属离子亲和层析(IMAC)是一种高效的亲和层析方法。因其螯合介质制备简单,吸附容量大,容易再生等优点得到越来越多的应用。用于IMAC的亲和配基有亚氨基二乙酸(IDA)、三羧甲基乙二胺(TED)和次氮基三乙酸(NTA)。基本原理就是蛋白表面的组氨酸残基的咪唑环或半胱氨酸残基与过渡金属离子(Ni2+、Cu2+、Zn2+),螯合形成配体,达到分离纯化目标蛋白的目的。同时,IMAC柱可以再生重复使用。正因如此,固定化金属螯合层析法在蛋白质与核酸的分离纯化、蛋白质的定向固定中得到广泛应用。
然而,游离酶对外界环境非常敏感,易受热、强酸、强碱等极端条件的影响而失去活性,从而限制了其在工业应用的发展。
近年来,酶的固定化是酶的一项重要的应用技术,解决了上述酶存在的问题,酶的固定化是指以有机或无机固体材料作为载体,采用物理或化学方法将酶束缚、限制于其表面和微孔中。与游离酶相比,“定制”得到具有特殊用途的固定化酶的稳定性得到改进、能在苛刻的环境中表现优良的活性,增强了酶的使用寿命,节约了经济成本。酶的固定化方法有物理法和化学法两大类,物理法包括吸附和包埋法,化学法包括交联和共价结合法。酶的固定化方法各有其优缺点,因此设计和合成优异性能的酶固定化材料是解决酶的固定化问题的方法之一。
酶的固定化载体有无机载体(如石墨、羟基磷石灰等),有机载体(如一些天然高分子材料等),生物大分子载体(如海藻酸钠、壳聚糖等)。载体的物理化学性质极大的影响着蛋白质的吸附过程,选择适合的酶固定化载体要考虑到载体的机械强度、化学及热稳定性、生物相容性、比表面积和酶的类型等。近年来,琼脂糖因其良好的生物相容性与可降解性,在生物分离纯化领域中得到广泛应用。琼脂糖作为常用的载体材料,主要有以下优点:(1)具有多孔性:琼脂糖微球的大孔可容许大分子量物质的扩散;(2)具有亲水性:琼脂糖分子表面含有大量羟基,便于在亲水的环境中进行;(3)具有衍生性:琼脂糖表面由密度适宜的活性基团羟基容易与一些功能基团键合,衍生出阴、阳离子交换介质、亲和层析介质等,在整个生物产品的分离过程中起到了十分重要的作用。目前,琼脂糖微球的制备方法有传统的搅拌乳化法、喷雾干燥法、膜乳化法等。但通过上述方法容易导致合成的交联琼脂糖粒径不均一,设备要求高等问题。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述交联琼脂糖亲和介质在纯化酶中的应用。
本发明进一步要解决的技术问题是提供上述交联琼脂糖亲和介质在酶催化产胞苷酸中的应用。
为了解决上述第一个技术问题,本发明公开了一种交联琼脂糖亲和介质的制备方法,包括如下步骤:
(1)将含琼脂糖的分散相与含乳化剂的连续相于微通道反应装置中反应,所得反应液于收集液中固化,得到琼脂糖微球;
(2)将步骤(1)所得琼脂糖微球依次经如下步骤处理后得到交联琼脂糖亲和介质;
(i)溶胀、活化、多羟基聚合物修饰;
(ii)交联;
(iii)活化、偶联亚氨基二乙酸配基;
(iv)螯合镍离子。
步骤(1)中,所述分散相为琼脂糖与水按照质量比为1:15-20组成的混合物。
其中,所述分散相的制备方法为将琼脂糖与水的混合物搅拌形成水溶液;优选地,所述搅拌的温度为70-90℃;优选地,所述搅拌的时间为4-6h。
步骤(1)中,所述连续相为乳化剂与环己烷按照体积比为1-2:3-6组成的混合物。
其中,所述乳化剂包括但不限于司盘;优选地,所述乳化剂为司盘85。
其中,所述连续相的制备方法为将乳化剂与环己烷混合后超声,加热;优选地,所述超声的时间为5-10min;优选地,所述加热的温度为70-85℃。
步骤(1)中,所述微通道反应装置包括第一注射泵、第二注射泵和T形微流体通道;其中,所述T形微流体通道含有两个入口、一个出口。
其中,所述微通道反应装置为聚合物管制备的;优选地,所述聚合物管为Teflon管、聚乙烯管、聚氯乙烯管或聚丙烯管。
步骤(1)中,所述分散相的流速为1-15μL/min。
步骤(1)中,所述连续相的流速为40-100μL/min。
步骤(1)中,所述反应的温度为60-70℃。
步骤(1)中,所述收集液为乳化剂与环己烷的混合溶液;优选地,所述混合溶液中乳化剂与环己烷的体积比为1:1.75-7;进一步优选地,所述混合溶液中乳化剂与环己烷的体积比为1:3.75-5。
步骤(1)中,所述所得反应液于收集液中固化为将反应液滴入或流入收集液中,再置于冰浴中固化成微球;优选地,在5-30min内固化成微球。
步骤(1)中,所得琼脂糖微球依次用乙醇、水洗涤。
步骤(i)中,所述溶胀为将步骤(1)所得琼脂糖微球通过碱溶液处理后溶胀,得到溶胀的琼脂糖微球。
其中,所述碱包括但不限于氢氧化钠。
其中,所述碱溶液的浓度为1-3M;优选地,所述碱溶液的浓度为2M。
其中,所述琼脂糖微球与碱溶液的用量比为10-30g:8-20mL。
其中,所述处理为搅拌;优选地,所述搅拌的温度为常温;优选地,所述搅拌的时间为0.5-1h。
步骤(i)中,所述活化为将溶胀处理后的琼脂糖微球与乙二醇二缩水甘油醚反应,得到活化的琼脂糖微球。
其中,所述乙二醇二缩水甘油醚与步骤(1)所得琼脂糖微球的用量比为7-20mL:10-30g。
其中,所述反应为搅拌状态下反应。
其中,所述反应的温度为40-60℃。
其中,所述反应的时间为16-20h。
其中,所述反应结束后,依次用乙醇、水洗涤。
步骤(i)中,所述多羟基聚合物修饰为碱性条件下,将活化后的琼脂糖微球与多羟基聚合物溶液反应,得到多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球。
其中,所述多羟基聚合物包括但不限于葡甘聚糖、聚乙二醇。
其中,所述多羟基聚合物溶液的溶剂为水。
其中,所述多羟基聚合物溶液的浓度为0.1-0.6g/mL。
其中,所述碱性条件为碱溶液提供;优选地,通过氢氧化钠水溶液提供;进一步优选地,通过1M氢氧化钠水溶液提供。
其中,所述碱溶液、羟基聚合物溶液与活化后的琼脂糖微球的用量比为0.4-1mL:1-3mL:1-4g。
其中,所述反应的温度为25-45℃;优选地,所述反应温度为30-40℃。
其中,所述反应的时间为15-25h。
步骤(ii)中,所述交联为将多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球先进行一次交联,再进行二次交联。
其中,所述一次交联为将多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球混合液与丁二醇双缩水甘油醚、环氧氯丙烷、碱溶液和NaBH4反应,降温,过滤,洗涤,即得一次交联琼脂糖微球。
其中,所述多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球混合液的溶剂为丙酮与水的混合物;优选地,所述丙酮与水的体积比为1:0.5-1.5;进一步优选地,所述丙酮与水的体积比为1:1。
其中,所述多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球混合液中多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球与溶剂的用量比为5-15g:10-30mL。
其中,所述碱溶液为氢氧化钠水溶液;优选地,所述碱溶液为1M氢氧化钠水溶液。
其中,所述多羟基聚合物修饰的琼脂糖微球与丁二醇双缩水甘油醚、环氧氯丙烷、碱溶液的用量比为5-15g:3-10mL:3-10mL:1-4mL。
其中,所述NaBH4的终浓度8-12g/L。
其中,所述反应的温度为35-40℃。
其中,所述反应的时间为2-4h。
其中,所述降温为降至室温。
其中,所述洗涤为经乙醇、水洗涤。
其中,所述二次交联为将一次交联琼脂糖微球于DMSO中与环氧氯丙烷、碱溶液反应,降温,过滤,洗涤,得到二次交联琼脂糖微球。
其中,所述碱溶液为含有1%w/w NaBH4的2M氢氧化钠水溶液。
其中,所述一次交联琼脂糖微球、DMSO、环氧氯丙烷、碱溶液的用量比为5-15g:10-30mL:2-8mL:1-4mL。
其中,所述反应的温度为30-45℃。
其中,所述反应的时间为24h。
其中,所述降温为降至室温。
其中,所述洗涤为用乙醇、水洗涤。
步骤(iii)中,所述活化为将二次交联琼脂糖微球与碱溶液、环氧氯丙烷反应,中和,洗涤,得到活化的交联琼脂糖微球。
其中,所述碱溶液为氢氧化钠水溶液;优选地,所述碱溶液为2M氢氧化钠水溶液。
其中,所述二次交联琼脂糖微球与碱溶液、环氧氯丙烷的用量比为10-20g:4-8mL:2-5mL。
其中,所述反应的温度为25-40℃。
其中,所述反应的时间为3-6h。
其中,所述中和为用1-3mM盐酸进行中和。
步骤(iii)中,所述偶联亚氨基二乙酸配基为将活化的交联琼脂糖微球与含亚氨基二乙酸、碳酸钠、NaBH4的混合溶液反应,洗涤,得到带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒。
其中,所述活化的交联琼脂糖微球与混合溶液的用量比为5-15g:50-100mL。
其中,所述混合溶液的溶剂为水。
其中,所述混合溶液中,每50-100mL混合中,亚氨基二乙酸、碳酸钠、NaBH4和水的含量分别为6-8g、2-5g、0.1-0.3g。
其中,所述反应的温度为40-60℃。
其中,所述反应为在搅拌状态下反应;优选地,所述反应的转速为150-180rpm。
其中,所述反应的时间为7-11h。
其中,所述洗涤为用水洗涤。
步骤(iv)中,所述螯合镍离子为带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒与氯化镍溶液反应,洗涤,抽滤,得到交联琼脂糖亲和介质。
其中,所述氯化镍溶液的溶剂为水。
其中,所述氯化镍溶液的浓度为80-130mM;优选地,所述氯化镍溶液的浓度为100mM。
其中,所述反应的温度为25-30℃。
其中,所述反应为在搅拌状态下反应;优选地,所述反应的转速为150-200rpm。
其中,所述反应的时间为2-4h。
其中,所述洗涤为用水洗涤。
其中,上述反应结束后,将交联琼脂糖亲和介质保存在20%乙醇中。
上述方法制备得到的交联琼脂糖亲和介质也在本发明的保护范围之内。
为了解决上述第二个技术问题,本发明公开了上述交联琼脂糖亲和介质在纯化酶中的应用。
其中,所述交联琼脂糖亲和介质在纯化酶中的应用包括如下步骤:
S1:向含交联琼脂糖亲和介质的层析柱加入粗酶液,混匀吸附,弃去余液;
S2:向步骤S1处理后的层析柱中加入0.01-0.05M(pH 6.0-9.0)咪唑,混匀除杂,弃去吸杂液;重复;
S3:向步骤S2处理后的层析柱中加入0.2-0.5M(pH 6.0-9.0)咪唑,混匀洗脱,收集纯化后的酶液,即得;
S4:向步骤S3处理后的层析柱中加入0.5M咪唑,洗脱,得到再生的酶液。
步骤S1中,所述含交联琼脂糖亲和介质的层析柱通过醋酸缓冲液平衡。
步骤S1中,所述粗酶液为菌体浓度为1-200g/L的细胞悬浊液超声破碎后离心所得上清液。
步骤S1中,所述琼脂糖亲和介质的用量与粗酶液的酶活没有关系,主要与粗酶液的蛋白浓度和体积有关;优选地,所述粗酶液的蛋白浓度为20-30g/L;所述粗酶液与交联琼脂糖亲和介质的用量比为3-10mL:0.1-3g;进一步优选地,所述粗酶液的蛋白浓度为25g/L;所述粗酶液与交联琼脂糖亲和介质的用量比为4-5mL:1-1.5g。
步骤S1中,所述吸附的温度为2-6℃;优选地,所述吸附的温度为4℃。
步骤S2中,控制0.01-0.05M咪唑的加入量,使其与交联琼脂糖亲和介质的用量比为5-10mL:0.1-3g。
步骤S1中,所述除杂的温度为2-6℃;优选地,所述除杂的温度为4℃。
步骤S2中,所述重复的次数为2-3次。
步骤S3中,控制0.2-0.5M咪唑的加入量,使其与交联琼脂糖亲和介质的用量比为5-10mL:0.1-3g。
步骤S3中,所述洗脱的温度为2-6℃;优选地,所述洗脱的温度为4℃。
步骤S4中,控制0.5M咪唑的加入量,使其与交联琼脂糖亲和介质的用量比为4mL:0.1-3g。
步骤S4中,所述再生的温度为2-6℃;优选地,所述再生的温度为4℃。
为了解决上述第三个技术问题,本发明公开了上述交联琼脂糖亲和介质在酶催化产胞苷酸中的应用。
其中,所述交联琼脂糖亲和介质在酶催化产胞苷酸中的应用包括如下步骤:
(a)将交联琼脂糖亲和介质、含有6xHis标记酶的粗酶液和缓冲液震荡反应,固液分离,得到固定化的酶;
(b)向步骤(a)所得固定化的酶中加入缓冲液、胞苷和乙酰磷酸,反应,即得胞苷酸。
步骤(a)中,所述含有6xHis标记酶包括但不限于腺苷酸环化酶、尿苷-胞苷激酶、乙酸激酶。
步骤(a)中,所述交联琼脂糖亲和介质与含有6xHis标记酶的粗酶液的用量比为0.1-3g:0.1-2mL。
步骤(a)中,所述缓冲液包括但不限于醋酸缓冲液;优选地,所述缓冲液为20-80mM的醋酸缓冲液;进一步优选地,所述缓冲液为50mM的醋酸缓冲液。
步骤(a)中,所述交联琼脂糖亲与缓冲液的用量比为0.1-3g:2-5mL。
步骤(a)中,所述反应的温度为5-15℃。
步骤(a)中,所述反应为震荡反应;优选地,所述反应的转速为150-200rpm。
步骤(a)中,所述反应的时间为0.5-2h。
步骤(a)中,所述固液分离包括但不限于抽滤。
步骤(b)中,所述缓冲液包括但不限于醋酸缓冲液;优选地,所述缓冲液为20-80mM的醋酸缓冲液;进一步优选地,所述缓冲液为50mM的醋酸缓冲液。
步骤(b)中,控制所述缓冲液的量,使其与步骤(a)中所述交联琼脂糖亲和介质的用量比为0.1-5mL:0.1-3g。
步骤(b)中,所述胞苷和乙酰磷酸的体积比为1.8:2-4.4;优选地,所述胞苷和乙酰磷酸的体积比为1.8:3.2。
步骤(b)中,控制胞苷和乙酰磷酸的总量,使其与步骤(a)中所述交联琼脂糖亲和介质的用量比为4-8mL:0.1-3g。
步骤(b)中,所述反应的温度为20-40℃。
步骤(b)中,所述反应为震荡反应;优选地,所述反应的转速为150-200rpm。
步骤(b)中,所述反应的时间为0.5-1h。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优势:
(1)采用微流控技术制备琼脂糖微球,经固化后的微球尺度均一、制备的微球粒径在60-130μm,形貌规整,且制备过程简单,易于微球的大量制备。
(2)经修饰后的微球,用于酶的纯化和固定,解决了酶在复杂的分离纯化的过程中易失活和无法回收再利用等问题,同时合成的亲和介质用于酶的纯化,降低了酶液中杂酶对产物的影响,此方法制备胞苷酸,具有反应条件温和,绿色环保等优势。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明中以微流控技术制备琼脂糖微球的显微形貌图。
图2为本发明中葡甘聚糖修饰的琼脂糖微球的红外谱图。
图3为本发明中交联琼脂糖亲和介质纯化腺苷酸环化酶(AC)的蛋白质凝胶电泳图;其中,Marker:蛋白凝胶电泳用的标准参照品,用于指示目标蛋白的大小;R:细胞破碎后离心得到的粗酶液;P:0.5M咪唑洗下来的目标蛋白;Washing:0.02M咪唑第二次除杂液;Re:0.5M咪唑第二次洗涤液;S:酶液吸附后残余的上清。
图4为本发明中交联琼脂糖亲和介质分别纯化尿苷-胞苷激酶(UCK)和乙酸激酶(Ack)的蛋白质凝胶电泳图;其中,Marker:蛋白凝胶电泳用的标准参照品,用于指示目标蛋白的大小;R:细胞破碎后离心得到的粗酶液;S:酶液吸附后残余的上清;Washing-1:0.02M咪唑第一次除杂液;Washing-2:0.02M咪唑第二次除杂液;P:0.5M咪唑洗下来的目标蛋白;Re:0.5M咪唑第二次洗涤液。
图5为本发明中尿苷-胞苷激酶纯化液各部分酶活测试结果图,其中,F:细胞破碎后的粗酶液;S:酶液吸附后残余的上清;Washing:0.02M咪唑洗脱液;P:0.5M咪唑洗下来的目标蛋白;Re:0.5M咪唑第二次洗涤液。
图6为本发明中未纯化的酶和纯化后的酶用于胞苷酸的生产的高效液相色谱结果对比。
图7为本发明中不同尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶固定比列下的胞苷酸的产率。
图8为本发明中使用常规方法制备琼脂糖微球的显微形貌图。
图9为本发明中微流控技术和常规方法制备的交联琼脂糖亲和介质纯化尿苷-胞苷激酶各部分相对酶活测试结果对比图。
具体实施方式
以下参照具体的实例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中,所述NaOH溶液均为NaOH的水溶液。
实施例1:交联琼脂糖亲和介质的制备
(1)选取3根长度为8cm,内径600μm,重均分子量10万的聚乙烯管,制备带有一个分散相和一个连续相的入口和一个出口的T形微流体通道,称取15g琼脂糖加至250mL去离子水中,于80℃水浴搅拌,加热4h,形成水溶液作为分散相。200mL环己烷和40mL司盘85组成的油相中,超声5min,作为连续相,并放在70℃水浴中预热。将分散相和连续相分别装入针筒,固定在数字控制注射泵上并接至相应的管道入口。调节分散相的流速8μL/min,连续相的流速50μL/min,在65℃水中反应,将流出液直接滴入含有17%司盘85的环己烷溶液的收集杯中收集液滴,将收集杯置于冰水浴中30min,使液滴固化成微球,并依次用乙醇、去离子水洗涤,得到琼脂糖微球,其显微形貌图如图1所示,从图中可以看出,所得微球颗粒均匀。
(2)称取步骤(1)中抽干的琼脂糖微球15g,加入10mL 2M NaOH溶液,常温搅拌0.5h进行溶胀处理,再加入15mL乙二醇二缩水甘油醚,于45℃搅拌反应18h,然后依次用乙醇、去离子水洗涤得到活化的琼脂糖微球。将5mL 1M NaOH和10mL 0.2g/mL葡甘聚糖水溶液与10g活化的琼脂糖微球混合,30℃反应20h,得到葡甘聚糖修饰的琼脂糖微球,其红外谱图如图2所示,3400-3500cm-1的钝峰是形成分子间氢键的羟基吸收峰,1100cm-1处为C-OH的面内弯曲震动吸收峰,表明介质表面羟基的成功修饰。
(3)将10g步骤(2)中抽干的葡甘聚糖修饰的琼脂糖微球加入到20mL的丙酮与水的等体积混合液中,与5mL 1,4丁二醇双缩水甘油醚和5mL环氧氯丙烷充分混合,室温下向该反应体系加入2mL 1M NaOH溶液和0.3g的NaBH4反应3h后,体系升温至40℃,继续反应4h,降至室温,过滤,收集交联的琼脂糖微球,并用乙醇、去离子水洗涤,得到一次交联琼脂糖微球。称取10g一次交联微球加至14mL DMSO和6mL环氧氯丙烷混合,并加入3mL 2M NaOH溶液(含1%w/w NaBH4),35℃反应24h,降至室温,过滤,收集交联的琼脂糖微球,用乙醇、去离子水清洗净,得到二次交联琼脂糖微球。
(4)取10g抽干的二次交联琼脂糖微球,加入5mL 2M的氢氧化钠、3mL环氧氯丙烷进行混合,在35℃的条件下,反应4h,结束后用1mM盐酸进行中和,并用去离子水洗涤,得到活化的交联琼脂糖微球。
(5)将10g活化的交联琼脂糖凝加入50mL含6.7g亚氨基二乙酸、4g碳酸钠和0.1gNaBH4的水溶液中混合均匀,于50℃,180rpm搅拌8h后,用去离子水洗涤,得到带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒。
(6)将12g带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒与120mL 100mM的氯化镍水溶液混合,在25℃、180rpm条件下振荡2h后,用去离子水洗涤介质至流出液中无镍离子,抽滤得镍金属亲和介质,即为交联琼脂糖亲和介质。
实施例2:交联琼脂糖亲和介质的制备
(1)选取3根长度为10cm,内径600μm,重均分子量10万的Teflon管,制备带有一个分散相和一个连续相的入口和一个出口的T形微流体通道,称取15g琼脂糖加至270mL去离子水中,于70℃水浴搅拌,加热4h,形成水溶液作为分散相。300mL环己烷和80mL司盘85组成的油相中,超声5min,作为连续相,并放在75℃水浴中预热。将分散相和连续相分别装入针筒,固定在数字控制注射泵上并接至相应的管道入口,调节分散相的流速12μL/min,连续相的流速55μL/min,在70℃水中反应。将流出液接入含有27%司盘85的环己烷溶液的收集杯中收集液滴,将收集杯置于冰水浴中30min,使液滴固化成微球,并依次用乙醇、去离子水洗涤,得到琼脂糖微球。
(2)称取步骤(1)中抽干的琼脂糖微球20g,加入15mL 2M NaOH溶液,常温搅拌1h进行溶胀处理,再加入15mL乙二醇二缩水甘油醚,于45℃搅拌反应16h,然后依次用乙醇、去离子水洗涤得到活化的琼脂糖微球。将5mL 1M NaOH和15mL 0.2g/mL聚乙二醇水溶液与10g活化的琼脂糖微球混合,40℃反应16h,得到聚乙二醇修饰的琼脂糖微球。
(3)将10g抽干的聚乙二醇修饰的琼脂糖微球加入到20mL的丙酮与水的等体积混合液中,与5mL 1,4丁二醇双缩水甘油醚和5mL环氧氯丙烷充分混合,室温下向该反应体系加入2mL 1M NaOH溶液和0.3g的NaBH4反应3h后,体系升温至35℃,继续反应2h,降至室温,过滤,收集交联的琼脂糖微球,并用乙醇、去离子水洗涤,得到一次交联琼脂糖微球。称取10g一次交联微球加至15mL DMSO和8mL环氧氯丙烷混合,并加入3mL 2M NaOH溶液(含1%w/w NaBH4),35℃反应24h,降至室温,过滤,收集交联的琼脂糖微球,用乙醇、去离子水清洗净,得到二次交联琼脂糖微球。
(4)取10g抽干的二次交联琼脂糖微球,加入4mL 2M的氢氧化钠、3mL环氧氯丙烷进行混合,在35℃的条件下,反应4h,结束后用1mM盐酸进行中和,并用去离子水洗涤,得到活化的交联琼脂糖微球。
(5)将10g活化的交联琼脂糖凝加入70mL含7g亚氨基二乙酸、4g碳酸钠和0.2gNaBH4的水溶液中混合均匀,于50℃,150rpm搅拌7h后,用去离子水洗涤,得到带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒。
(6)将10g带有螯合配基的交联琼脂糖凝胶颗粒与130mL 100mM的氯化镍水溶液混合,在25℃、180rpm条件下振荡2h后,用去离子水洗涤介质至流出液中无镍离子,抽滤得镍金属亲和介质,即为交联琼脂糖亲和介质。
实施例3:酶的纯化
向购买的亲和层析空柱中,加入1.5g实施例1合成的交联琼脂糖亲和介质,用50mM的醋酸缓冲液10mL对介质平衡3次后,再加入破碎离心的25g/L腺苷酸环化酶(AC)粗酶液5mL,混匀于4℃充分吸附,然后弃去余液。加入0.02M咪唑10mL,混匀于4℃充分除杂,弃去吸杂液,重复3次。再加入0.5M咪唑5mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到纯化的酶液,加入0.5M咪唑5mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到再生的酶液。其纯化效果如图3所示,纯化后的腺苷酸环化酶条带清晰,纯度较高。
实施例4:酶的纯化
(1)向购买的亲和层析空柱中加入1g实施例2合成的交联琼脂糖亲和介质,用50mM的醋酸缓冲液10mL对介质平衡3次后,再加入破碎离心的25g/L尿苷-胞苷激酶(UCK)粗酶液4mL,混匀于4℃充分吸附,然后弃去余液。加入0.02M咪唑10mL,混匀于4℃充分除杂,弃去吸杂液,重复3次。再加入0.5M咪唑4mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到纯化的酶液;再加入0.5M咪唑4mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到再生的酶液。
(2)按照上述步骤纯化乙酸激酶(AcK)。
纯化结果分别如图4和图5所示,图4为交联琼脂糖亲和介质分别纯化尿苷-胞苷激酶(UCK)和乙酸激酶(Ack)的蛋白质凝胶电泳图对比图。由图中可知,经纯化后的尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的条带清晰,纯度高。图5为纯化过后的尿苷-胞苷激酶纯化液各部分酶活测试结果图。由图中可知,尿苷-胞苷激酶洗脱较为完全,酶活性几乎没有损失。图6为本发明中未纯化的酶和纯化后的酶用于胞苷酸的生产的高效液相色谱结果对比。与未纯化的酶相比,纯化后的酶在催化产胞苷酸时几乎不存在副产物。
实施例5:酶的固定化和胞苷酸的制备
(1)取破碎离心后的0.3mL的尿苷-胞苷激酶和0.1mL的乙酸激酶(浓度均为25g/L),加4.6mL 50mM醋酸缓冲液和以胞苷和乙酰磷酸为底物的5mL反应液,其中胞苷为1.8mL,乙酰磷酸为3.2mL,构成10mL的游离酶反应体系,并在33℃,180rpm条件下震荡反应,于15min取样,灭活后进行胞苷酸浓度测定。
(2)向2g交联琼脂糖亲和介质中加入破碎离心后的0.3mL的尿苷-胞苷激酶和0.1mL的乙酸激酶,加4.6mL 50mM醋酸缓冲液,体系在10℃,180rpm条件下震荡1h,结束后,弃去上清,抽滤得到固定化的酶。加5mL 50mM醋酸缓冲液和以胞苷和乙酰磷酸为底物的5mL反应液,其中胞苷为1.8mL,乙酰磷酸为3.2mL,构成10mL的固定化酶体系,并在33℃,180rpm条件下震荡反应,于15min取样,灭活后进行胞苷酸含量测定。
(3)同步骤(1)和步骤(2),改变尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的体积比,分别为15:15、15:10、15:7.5、15:5、15:2.5、15:1。
不同游离酶的比例和不同固定化酶比列对应的胞苷酸的产率如图7所示。同样的胞苷酸产率情况下,粗酶液中AcK所需比例较高,因粗酶液中存在的杂质会消耗产生的胞苷酸;经纯化后的多酶催化体系所需要的AcK比例较低,这与图6的液相色谱结果相符,说明纯化可基本消除酶催化过程中的副产物。
对比例1
(1)称取15g琼脂糖加至250mL去离子水中,于80℃水浴搅拌,加热4h进行溶胀处理,作为水相。趁热缓慢加入预热的由200mL环己烷和40mL司盘85组成的油相中,调节转速为1300rpm,60℃乳化30min。乳化完成后,用冰水浴使乳液在30min之内固化成微球。依次用乙醇、去离子水洗涤,得到琼脂糖微球。其形貌如图8所示,所得的微球呈球形,粒径大小不一。
(2)琼脂糖的修饰交联及螯合配基步骤同实施例1。
(3)向购买的亲和层析空柱中,加入1g合成的交联琼脂糖亲和介质,用50mM的醋酸缓冲液10mL对介质平衡3次后,再加入破碎离心的25g/L尿苷-胞苷激酶(UCK)粗酶液4mL,混匀于4℃充分吸附,然后弃去余液。加入0.02M咪唑10mL,混匀于4℃充分除杂,弃去吸杂液,重复3次。再加入0.5M咪唑4mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到纯化的酶液;再入0.5M咪唑4mL,混匀于4℃充分洗脱,收集得到再生的酶液。
纯化过后的尿苷-胞苷激酶纯化液各部分相对酶活测试结果如图9所示,其中,介质C为微流控技术制备的琼脂糖微球;介质D为常规方法制备的琼脂糖微球。介质D纯化所得的目标蛋白相对酶活仅约为介质C的一半,蛋白载量较低。
本发明提供了一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (12)
1.一种交联琼脂糖亲和介质的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将含琼脂糖的分散相与含乳化剂的连续相于微通道反应装置中反应,所得反应液于收集液中固化,得到琼脂糖微球;
(2)将步骤(1)所得琼脂糖微球依次经如下步骤处理后得到交联琼脂糖亲和介质;
(i)溶胀、活化、多羟基聚合物修饰;
(ii)交联;
(iii)活化、偶联亚氨基二乙酸配基;
(iv)螯合镍离子。
2.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述分散相为琼脂糖与水按照质量比为1:15-20组成的混合物。
3.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述连续相为乳化剂与环己烷按照体积比为1-2:3-6组成的混合物。
4.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述分散相的流速为1-15μL/min;所述连续相的流速为40-100μL/min。
5.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述反应的温度为60-70℃。
6.权利要求1-5中任意一项所述方法制备得到的交联琼脂糖亲和介质。
7.权利要求6所述交联琼脂糖亲和介质在纯化酶中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,包括如下步骤:
S1:向含交联琼脂糖亲和介质的层析柱加入粗酶液,混匀吸附,弃去余液;
S2:向步骤S1处理后的层析柱中加入0.01-0.05M咪唑,混匀除杂,弃去吸杂液;重复;
S3:向步骤S2处理后的层析柱中加入0.2-0.5M咪唑,混匀洗脱,收集纯化后的酶液,即得。
9.根据权利要求8所述应用,其特征在于,步骤S1中,所述粗酶液与交联琼脂糖亲和介质的用量比为3-10mL:0.1-3g。
10.权利要求6所述交联琼脂糖亲和介质在酶催化产胞苷酸中的应用。
11.根据权利要求10所述应用,其特征在于,包括如下步骤:
(a)将交联琼脂糖亲、含有6xHis标记酶的粗酶液和缓冲液反应,固液分离,得到固定化的酶;
(b)向步骤(a)所得固定化的酶中加入缓冲液、胞苷和乙酰磷酸,反应,即得胞苷酸。
12.根据权利要求11所述应用,其特征在于,步骤(a)中,所述交联琼脂糖亲和介质与含有6xHis标记酶的粗酶液的用量比为0.1-3g:0.1-2mL。
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