CN114807285A - 一种胆汁转化物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胆汁转化物及其制备方法，属于生物工程技术领域。该制备方法通过将工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液经过吸附、除杂、超滤浓缩后与缓冲液混匀，调节pH后加到离子交换琼脂凝胶柱中进行酶的固定化，制得固定化酶柱；将禽胆精制液与NADP+混合，调节pH后流加至固定化酶柱进行转化，取清液经减压浓缩、真空干燥后制得胆汁转化物。本发明以离子交换琼脂凝胶柱作为羟基类固醇脱氢酶固定化的载体，稳定性好、机械强度高、载量大，酶分子不易脱落，可连续反应且反应产物能够及时与酶分离，减少逆反应的发生，从而得到TUDCA：TCDCA比例更高的胆汁转化物。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种胆汁转化物及其制备方法。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，化学名称为3α,7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸，对胆结石及肝病具有明显的疗效。因此含TUDCA的胆汁转化物在保肝护胆方面有重要意义和广阔的应用前景。胆汁转化物传统的制备方法一般主要是化学合成法，近年来随着酶催化的发展，出现了一些酶催化制备的胆汁转化物。但是，酶蛋白分子对反应条件较为敏感，稳定性较差，容易失活，从而导致其催化能力的降低；而用生物技术的方法生产酶导致成本较高，并且难以回收和重复使用，这些不足大大限制了酶在工业上的大规模应用。中国发明专利CN202010469657.8以酶菌体菌悬液或者菌体破碎后的上清液进行生物转化，此方法将菌体直接与原料长时间接触，后续需要除杂步骤，而且很难保证菌体和其碎片以及其内部的外源DNA、蛋白质以及内毒素的有效去除，此外酶包裹在菌体内部会影响酶和底物的接近，从而影响转化效率。中国发明专利CN201410588581.5，以禽畜胆汁直接冷冻干燥制得的禽畜胆粉为原料，用壳聚糖固定化的7α-羟基类固醇脱氢酶和固定化的7β-羟基类固醇脱氢酶进行生物转化，此方法需要将生物转化所用到的酶固定到壳聚糖载体上制成固定化酶柱，而壳聚糖作为载体存在机械强度差、酶载量小、酶活性低和非特异性吸附等问题，同时在连续反应操作过程中容易发生破裂而导致酶脱落，影响催化效果的同时不利于反复使用，破裂后与产物混在一起很难分离，并且在对酶进行固定化处理之前，酶的纯化步骤复杂且成本高、酶活不易保持等问题，使得工艺难以放大，严重影响了制备效率，无法满足市场需求。也有一些专利利用重组蛋白的组氨酸标签与金属离子亲和层析树脂结合、或离子交换树脂来制备固定化酶，但是金属离子亲和层析树脂上的金属离子结合力较差、载量较低、易脱落，不利于重复利用，且脱落后污染产物不易分离；而离子交换树脂一般只适合氨基酸等。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种胆汁转化物的制备方法，该制备方法通过以离子交换琼脂糖凝胶作为羟基类固醇脱氢酶固定化的载体，稳定性好、机械强度高、载量大，酶分子不易脱落，可连续反应且反应产物能够及时与酶分离，减少逆反应的发生，从而得到TUDCA：TCDCA 比例更高的胆汁转化物。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种胆汁转化物的制备方法，其包括以下步骤：
S1、固定化酶的制备：
向工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液中加入质量分数为0.5～2％的活性炭，充分混匀0.5～1h，离心或过滤去除杂质，收集第一含酶清液并超滤浓缩，加入终浓度为20～100mM的缓冲液混匀，得到第二含酶清液，调节第二含酶清液的pH为7.5～9.0；将第二含酶清液加样至离子交换琼脂糖凝胶柱，弃去流穿液，用缓冲液清洗，得到7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱；
S2、禽胆精制液的制备：
对禽胆破碎取汁，过滤、浓缩，加入乙醇混匀后过夜，离心或过滤去除沉淀，清液浓缩至无醇味，得到禽胆精制液；
S3、胆汁转化物的制备：
将禽胆精制液加入NADP+混匀，调节pH至7.5～8.5，在20～30℃下流加至 7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱，取流出的反应清液经减压浓缩、真空干燥，制得胆汁转化物。
作为本发明优选的实施方式，所述工程菌为枯草芽孢杆菌、酵母、大肠杆菌中的一种。
作为本发明优选的实施方式，所述固定化酶柱中含有的目标酶酶量为 0.05～0.2g/ml，其中7α羟基类固醇脱氢酶与7β羟基类固醇脱氢酶之间的质量比为1:1～5。
作为本发明优选的实施方式，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-NaCl缓冲液、甘氨酸缓冲液中的至少一种。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S1中超滤浓缩的截留分子量为 30KD，既能保持适合的过滤速度又能避免酶的损失。
作为本发明优选的实施方式，所述离子交换琼脂糖凝胶柱在使用前用纯水冲洗2～5个柱体积后再用缓冲液平衡2～5个柱体积。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S2中加入的乙醇的终浓度为 60～85％。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S2中禽胆精制液的固含量为 100～300g/L。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S3中NADP+的终浓度为0.8-4g/L。
作为本发明优选的实施方式，所述反应清液中TUDCA与TCDCA之间的质量比为1.3～2.0:1；所述胆汁转化物中TUDCA含量≥28％，TUDCA与TCDCA 的含量之和≥45％。
本发明的目的之二在于提供一种胆汁转化物，所述胆汁转化物是由如权利要求1～9中任一项所述的制备方法制得的。
相比现有技术，上述技术方案的有益效果在于：
1、通过工程菌将酶蛋白分泌表达在培养液中，有利于二硫键的正确形成，从而降低胞内蛋白酶对酶蛋白的降解，不需要细胞破碎且杂蛋白含量少，无细菌内毒素残留，相对纯度高，无需纯化酶，含酶培养液可直接固定化处理，工序更为简单；
2、通过固定化酶实现了多酶系统共同催化的复杂反应，在反应后易于与产物分离，简化了分离提纯的工序；
3、以离子交换琼脂糖凝胶柱作为羟基类固醇脱氢酶的固化定载体，离子交换琼脂糖凝胶的离子交换剂共价结合在琼脂糖凝胶上，不易脱落，同时抗微生物能力强、稳定性好、机械强度高、载量大、非特异性吸附低、可再生能力强，循环使用，与羟基类固醇脱氢酶通过静电力结合且结合力好，减少酶的构象扭曲，避免酶的活性中心的损坏最大程度上保证了固定酶的活性，可连续反应制备胆汁转化物，提高了酶的使用率，降低了工业生产的成本，适用于工业自动化、规模化生产；
4、7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶均具有双向催化反应的能力，通过不断加入底物溶液，反应后的产物及时与酶分离，降低了产物抑制作用，减少了逆反应的发生，从而得到TUDCA：TCDCA比例更高的胆汁转化物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
一种胆汁转化物的制备方法，其包括以下步骤：
S1、固定化酶的制备：
将工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液按照7α羟基类固醇脱氢酶培养液：7β羟基类固醇脱氢酶培养液＝1:1～5 的质量比混合，并加入质量分数为0.5～2％的活性炭，充分混匀0.5～1h，离心或过滤去除宿主菌体等杂质，收集第一含酶清液并超滤浓缩，收集浓缩液，加入终浓度为20～100mM的缓冲液混匀，得到第二含酶清液，调节第二含酶清液的 pH为7.5～9.0；离子交换琼脂糖凝胶柱在使用前用纯水冲洗2～5个柱体积后再用缓冲液平衡2～5个柱体积，然后将第二含酶清液加样至离子交换琼脂糖凝胶柱，使酶与离子交换琼脂糖凝胶柱结合，弃去流穿液，用缓冲液清洗2～3个柱体积，去除残留的游离酶，从而得到7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱；
S2、禽胆精制液的制备：
对禽胆破碎取汁，采用100目滤网及多层尼龙网过滤，浓缩，加入乙醇至乙醇的终浓度为60～85％，混匀后过夜，离心或过滤去除沉淀，清液浓缩至无醇味，得到固含量为100～300g/L的禽胆精制液；
S3、胆汁转化物的制备：
将禽胆精制液加入终浓度为0.8-4g/L的NADP+混匀，调节pH至7.5～8.5，在20～30℃下流加至7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱，取流出的反应清液经减压浓缩、真空干燥，制得胆汁转化物。其中，反应清液中TUDCA与TCDCA之间的质量比为1.3～2.0:1；胆汁转化物中TUDCA含量≥28％，TUDCA与TCDCA的含量之和≥45％。
步骤S1中，分泌表达羟基类固醇脱氢酶的工程菌为枯草芽孢杆菌、酵母、大肠杆菌中的一种。7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶可以同时固定在离子交换琼脂糖凝胶柱上，也可以先固定其中一个羟基类固醇脱氢酶后再固定另一种羟基类固醇脱氢酶，根据不同羟基类固醇脱氢酶的不同等电点而调节体系的pH值，即可选择性地固定不同的酶。优选地，固定化酶柱中含有的目标酶酶量为0.05～0.2g/ml，其中7α羟基类固醇脱氢酶与7β羟基类固醇脱氢酶之间的质量比为1:1～5。缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-NaCl缓冲液、甘氨酸缓冲液中的至少一种。超滤浓缩的截留分子量为30KD。
实施例1
一种胆汁转化物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱的制备
取大肠杆菌分泌表达的0.4L含7α羟基类固醇脱氢酶培养液和1.6L7β羟基类固醇脱氢酶培养液加入质量百分数为1％的活性炭，充分混匀0.5～1h，3800rpm 离心5min去除宿主菌体等杂质，收集第一含酶清液。将第一含酶清液超滤浓缩 (截留分子量30KD)至100ml，加入5ml缓冲液(1M Tris+1M NaCl，pH 8.0) 混匀，得到第二含酶清液，将第二含酶清液以1ml/min的流速加样至离子交换琼脂糖凝胶柱Q-FF-1ml(Q-FF用纯水冲洗3ml，再用缓冲液(50mM Tris+50mM NaCl，pH8.0)平衡3ml)，弃掉流穿液，并用缓冲液(50mM Tris+50mM NaCl， pH8.0)清洗3ml，得到7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶。
S2、鸡胆精制液制备
取1kg鸡胆破碎取汁，用100目滤网及多层尼龙网过滤，浓缩至250g，膏体中加入1.2L初始浓度为95％的乙醇混匀后过夜，3800rpm离心5min去除沉淀，清液浓缩至无醇味，即为鸡胆精制液；取10ml鸡胆精制液干燥成粉，称重 2.1g。
S3、胆汁转化物制备
将10ml鸡胆精制液加入0.01g NADP+混匀，用5M NaOH调节pH至7.5， 25℃下流加至7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱，流出清液经减压浓缩、真空干燥制得胆汁转化物1.9g，其中TUDCA： TCDCA＝1.68:1(质量比)，TUDCA含量为32.5％，(TUDCA+TCDCA)的含量为 51.8％。
实施例2-16及对比例1～5
实施例2-16及对比例1～5与实施例1的区别在于固定化体系pH值、固定化酶柱体积、酶用量比例、禽胆精制液体积、禽胆精制液固含量、转化体系的 pH和温度不同，具体工艺条件如表1所示。
表1实施例2～16与对比例1～5的工艺参数表
对比例6
一种胆汁转化物的制备方法，其采用以壳聚糖为基质的固定化酶柱制备胆汁转化物，具体步骤如下：
向浓度为1％的壳聚糖(水溶性)溶液中加入适量醋酸，磁力搅拌30min，制得壳聚糖醋酸溶液。将溶液注入到三聚磷酸钠溶液中固化2h得到壳聚糖球，过滤，用去离子水洗涤多次。将制备好的壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的烧杯中，放置于37℃，170rpm的摇床中，活化4h，得到活化的壳聚糖微球。称取0.8g活化的壳聚糖微球，装入1ml层析柱。后续酶的固定和胆汁转化物制备条件参照实施例1。
对比例7
一种胆汁转化物的制备方法，其采用以壳聚糖为基质的固定化酶柱制备胆汁转化物，具体步骤如下：
取0.8g对比例5中活化的壳聚糖微球，加入20mg 7α羟基类固醇脱氢酶液和80mg 7β羟基类固醇脱氢酶液(相当于0.4L含7α羟基类固醇脱氢酶培养液和1.6L7β羟基类固醇脱氢酶培养液)，垂直混合结合6h，固定结束放出酶液，固定化酶装入1ml层析柱，用PBS缓冲液冲洗固定后酶柱5次，固定化酶柱中加入1ml鸡胆精制液(内含0.0095g NADP+)，25℃反应6小时，放出反应液。后续胆汁转化物制备条件参照实施例1。
对实施例2～16及对比例1～7所制得的胆汁转化物进行含量测定，计算 TUDCA与TCDCA的质量比、TUDCA含量以及TUDCA+TCDCA含量，结果如表2所示。
表2实施例2～16与对比例1～7的含量测定结果
由表2可知，固定化体系的pH值越大，固定的酶量越大，进而促进转化效果，pH＝9.0时效果最佳，TUDCA：TCDCA＝2.02，过大容易引起酶的失活，当 pH接近酶的等电点时，固定化的酶量降低，转化效果变差TUDCA： TCDCA＝0.42；酶用量比例为7α：7β＝1:1-1:5时，转化效果较好，且随着7β酶量增大而提高，在1:5时效果最佳，TUDCA：TCDCA＝1.71，当7α：7β＝1:0.5 时转化效果不达标，TUDCA：TCDCA＝0.73；工程菌和缓冲液的类型对反应无明显影响；禽胆精制液的体积和固定化酶柱的体积对反应影响不大，禽胆精制液体积增大10倍转化效果依然达标，固定化酶柱体积增加5倍时转化效果不变；禽胆精致液固含量在100g/L-300g/L时，含量越高转化效果越稳定，TUDCA： TCDCA＞1.6，但固含量在350g/L时TUDCA：TCDCA＝1.04，体系粘性增加，转化效果下降；转化体系的pH在7.5-8.5时转化效果TUDCA：TCDCA＞1.3，随着pH增加酶活受到影响，转化效果下降，pH9.0时TUDCA：TCDCA＝0.98；转化温度在20℃-30℃时TUDCA：TCDCA＞1.5，并随着温度增加而增加，30℃时TUDCA：TCDCA＝1.71，但当温度达到35℃酶活性降低，TUDCA： TCDCA＝0.85。
由此可见，本发明的制备方法通过以离子交换琼脂糖凝胶作为羟基类固醇脱氢酶固定化的载体，稳定性好、机械强度高、载量大，酶分子不易脱落，可连续反应且反应产物能够及时与酶分离，减少逆反应的发生，从而得到TUDCA： TCDCA比例更高的胆汁转化物
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种胆汁转化物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、固定化酶的制备：
向工程菌分泌表达的7α羟基类固醇脱氢酶培养液和7β羟基类固醇脱氢酶培养液中加入质量分数为0.5～2％的活性炭，充分混匀0.5～1h，离心或过滤去除杂质，收集第一含酶清液并超滤浓缩，加入终浓度为20～100mM的缓冲液混匀，得到第二含酶清液，调节第二含酶清液的pH为7.5～9.0；将第二含酶清液加样至离子交换琼脂糖凝胶柱，弃去流穿液，用缓冲液清洗，得到7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱；
S2、禽胆精制液的制备：
对禽胆破碎取汁，过滤、浓缩，加入乙醇混匀后过夜，离心或过滤去除沉淀，清液浓缩至无醇味，得到禽胆精制液；
S3、胆汁转化物的制备：
将禽胆精制液加入NADP+混匀，调节pH至7.5～8.5，在20～30℃下流加至7α羟基类固醇脱氢酶和7β羟基类固醇脱氢酶共固定化酶柱，取流出的反应清液经减压浓缩、真空干燥，制得胆汁转化物。
2.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述工程菌为枯草芽孢杆菌、酵母、大肠杆菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述固定化酶柱中含有的目标酶酶量为0.05～0.2g/ml，其中7α羟基类固醇脱氢酶与7β羟基类固醇脱氢酶之间的质量比为1:1～5。
4.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-NaCl缓冲液、甘氨酸缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述离子交换琼脂糖凝胶柱在使用前用纯水冲洗2～5个柱体积后再用缓冲液平衡2～5个柱体积。
6.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中加入的乙醇的终浓度为60～85％。
7.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中禽胆精制液的固含量为100～300g/L。
8.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中NADP+的终浓度为0.8-4g/L。
9.根据权利要求1所述的胆汁转化物的制备方法，其特征在于：所述反应清液中TUDCA与TCDCA之间的质量比为1.3～2.0:1；所述胆汁转化物中TUDCA含量≥28％，TUDCA与TCDCA的含量之和≥45％。
10.一种胆汁转化物，其特征在于：所述胆汁转化物是由如权利要求1～9中任一项所述的制备方法制得的。
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