CN107893062B - 一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法 - Google Patents

一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法。制备固定化纤维素酶的方法是以海藻酸钠为载体，利用海藻酸钠中OH‑和COOH‑的氧原子与Ca2+发生离子交换反应的原理形成凝胶，聚乙二醇为致孔剂和亲水剂、戊二醛为交联剂，利用壳聚糖和海藻酸钠‑聚乙二醇固定化酶之间形成的聚电解质膜提高固定化酶的稳定性。将固定化的纤维素酶用于水解纤维素，可以实现纤维素酶的重复多次利用。加入聚乙二醇和壳聚糖可以提高固定化纤维素酶的酶活固定率和酶活力、降低米氏常数、提高载体表面的孔密度，增加酶水解反应的还原糖含量、酶水解得率和TS降解率。本发明的制备及应用方法操作简便、固定条件温和、投资低、对环境友好。

Description

一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法
技术领域
本发明具体涉及到一种纤维素酶的固定化方法，以及固定化纤维素酶水解纤维素的方法。
背景技术
纤维素是自然界中分布最广、储量最大的天然高分子，是构成细胞壁的基础物质。每年植物通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，是一种取之不用之不竭的可再生资源。近年来，随着煤、石油、天然气等不可再生资源的逐步枯竭以及环境问题的日益严重，有关纤维素作为可再生资源的利用研究成为当今国际科学研究的前沿领域之一。
纤维素是由β-D-吡喃葡萄糖以(1-4)-β-糖苷键联结而成的长链不分支的均质多糖。由于自身具有较高的结晶度、分子间和分子内存在很好的氢键，天然纤维素不能熔融，也很难溶于常规溶剂，这极大地限制了纤维素的开发和利用。
纤维素在生物转化过程中，纤维素酶可将其水解为易于利用的可溶性小分子还原糖，以实现木质纤维素的高效利用。纤维素酶作为催化剂，理论上可以多次用于酶水解反应中。纤维素酶是水溶性制剂，在酶水解纤维素的过程中，会与产物融合在一起，一方面造成纤维素酶的流失，另一方面使产物的纯度降低。纤维素酶价格昂贵，其循环多次利用及提高产物纯度是酶水解工艺需解决的主要问题。
纤维素酶的固定化是实现纤维素酶多次循环使用的有效方法。文献：Rahim S NA,Sulaiman A,Hamzah F,et al.Enzymes Encapsulation within Calcium Alginate-clay Beads:Characterization and application for cassava slurrysaccharification[J].Procedia Engineering.2013,68:411-417.文中研究表明，以海藻酸钠为载体，对α-淀粉酶、糖化酶和纤维素酶进行多酶固定，循环使用5次后酶活力剩余44％。文献：陈伟兵.海藻酸钠/SiO2复合水凝胶的制备及作为固定化纤维素酶载体的研究[D].华侨大学.文中研究表明，以海藻酸钠为主要载体，经NHS和EDC活化海藻酸钠上的羧基后，以KH-550偶联剂，加入纤维素酶将其固定。固定化酶的米氏常数与游离酶相比，由0.122mg/ml增加至1.10mg/ml，增加了8倍。米氏常数的增加表明酶分子其与底物的亲和力降低。原因是由于酶分子经过固定后运动受限，从而使得与底物之间的空间位阻增加，这不利于纤维素酶发挥其有效的水解作用。
发明内容
为进一步解决以上问题，本发明的目的在于，提供一种纤维素酶的固定方法，提高固定化酶与底物的亲和力、提高固定化酶的循环使用性能，并将其用于酶水解反应当中，实现纤维素酶的重复利用。
本发明为了提高底物与酶分子之间的亲和力、减少空间阻力，提高固定化酶的循环使用次数，在以海藻酸钠为固定化纤维素酶的载体、戊二醛为交联剂的基础上，加入聚乙二醇，一方面作为致孔剂，另一方面提高固定化酶的亲水性，并采用壳聚糖对海藻酸钠-聚乙二醇固定化酶覆膜以提高载体的稳定性。交联后的纤维素酶加入到氯化钙溶液中形成凝胶。反应原理为：戊二醛的醛基可以与纤维素酶的氨基发生希夫氏碱交联反应使酶分子相互交联，海藻酸钠G单元中OH-和COO-的氧原子与Ca2+发生离子交换反应形成“Egg-box”结构将酶分子固定。聚乙二醇在海藻酸钠-Ca2+固定体系中溶出，在载体表面形成均匀的孔结构，减少传质阻力；同时其含有的羟基和聚乙二醇基与载体和纤维素酶形成氢键，增加亲水性。由于壳聚糖含有的-NH2结合质子酸后带正电，海藻酸钠中的-COO-带负电荷，因此海藻酸钠-聚乙二醇固定化酶经过壳聚糖覆膜后在表面形成聚电解质膜，提高载体的稳定性。
并且，采用以上方法制备出的固定化纤维素酶，用于微晶纤维素的酶水解反应，水解效果较未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，得到显著地提高。
具体步骤如下：
(1)固定化纤维素酶的制备：准确称取纤维素酶粉末溶于纯水中，使其浓度为2.5-12.5mg/ml，待用。
准确称取戊二醛配置成质量分数为1％戊二醛溶液，待用；
准确称取CaCl2配置成质量分数为0.5-6.0％CaCl2溶液，待用；
准确称取壳聚糖加入至体积分数为2％乙酸溶液中，使壳聚糖溶液的质量分数为1％-5％待用；
准确称取海藻酸钠和聚乙二醇加入pH为4.8的酸性缓冲溶液中，室温下混合均匀后，形成海藻酸钠—聚乙二醇溶液，待用；其中海藻酸钠与聚乙二醇的质量比为1:0.5～1:2.5，海藻酸钠溶液的质量分数为1.0-6.0％，聚乙二醇分子量为1000-6000；
准确量取上述海藻酸钠-聚乙二醇溶液，依次加入上述纤维素酶溶液和戊二醛溶液，混合均匀后，于150r/min振荡30min，之后于4℃静置反应4h；反应后混合液中海藻酸钠-聚乙二醇溶液：纤维素酶溶液：戊二醛溶液的体积比为5:1:0.5～5:1:2.5；将上述混合液逐滴加入至质量分数为0.5-6.0％的CaCl2溶液中，于30-80℃固定0.5-7.5h，过滤；更换新的CaCl2溶液后，0-6℃静置硬化1-3h；然后加入上述壳聚糖溶液，15-25℃下覆膜10min-50min；之后用NaCl溶液洗涤，滤纸吸干表面水分，4℃以下保存。优选更换新的CaCl2溶液后，4℃静置硬化2h；然后加入上述壳聚糖溶液，15-25℃下覆膜10min-50min；之后用质量分数0.9％的NaCl溶液洗涤，滤纸吸干表面水分，4℃保存。
其中，优选纤维素酶浓度为5mg/ml，海藻酸钠溶液质量分数为3.5％，聚乙二醇分子量为4000，海藻酸钠与聚乙二醇的质量比＝1:1.5，CaCl2溶液质量分数为2％，固定化反应条件为温度50℃，时间2.5h，壳聚糖溶液质量分数为3％，覆膜时间为30min，海藻酸钠-聚乙二醇溶液：纤维素酶溶液：戊二醛溶液：CaCl2溶液：壳聚糖的体积比为5:1:1.5:1:2。
(2)固定化酶水解纤维素的方法：上述固定化方法制备的固定化纤维素酶用于水解纤维素，将纤维素加入缓冲溶液中，使得纤维素质量分数为3.0-17.0％，缓冲溶液pH为3.0-6.0；固定化纤维素酶加入上述的纤维素溶液中，投加量为每克纤维素0.5-4.0g；水解温度为40-60℃，在120-180r/min条件下水解12-72h。
其中，优选海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化酶水解纤维素的优选固定化酶投加量为每克纤维素3.49g，纤维素质量分数为6.89％，pH＝4.93，水解温度60℃，在150r/min条件下水解48h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)与未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，本发明可以提高固定化纤维素酶的酶活力和酶活固定率，分别提高30％和12％。
2)固定化纤维素酶可以实现纤维素酶的多次重复利用。与未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，本发明可以提高固定化纤维素酶的循环使用效果，反应5次后剩余相对酶活力可以提高85％。
3)海藻酸钠固定化酶的米氏常数为2.964mg/ml，海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化酶的米氏常数为1.760mg/ml。与未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，本发明可以减小固定化纤维素酶的米氏常数，减小41％。表明固定化酶与底物之间的亲和力增加。
4)与未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，本发明可以提高固定化酶载体表面的孔密度，提高8％。
4)与未添加聚乙二醇和壳聚糖相比，本发明可以提高酶水解反应的酶水解得率和TS降解率，分别提高134％和7％，还原糖含量提高2.5倍。
具体实施方式
实施例1
采用海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖用于纤维素酶固定化的方法
1)准确称取纤维素酶粉末溶于纯水中，使其浓度为5mg/ml，待用。
2)准确称取1.5g壳聚糖于100ml烧杯中，加入48.5g质量分数为2％乙酸，使壳聚糖的质量分数为3％，室温下混合均匀后，形成壳聚糖溶液，待用。
3)准确称取戊二醛配置成质量分数为1％戊二醛溶液，待用；
4)纤维素酶的固定化：准确称取2.625g聚乙二醇于100ml烧杯中，加入48.25g0.05mol/L的pH＝4.8的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，室温下用玻璃棒搅拌溶解后，加入1.75g海藻酸钠，使得海藻酸钠质量分数为3.5％、海藻酸钠与聚乙二醇质量比为1:1.5。室温下混合均匀后，形成海藻酸钠—聚乙二醇溶液，待用。
用10ml注射器吸取5ml上述海藻酸钠—聚乙二醇溶液于20ml的玻璃瓶中，依次加入1ml 5mg/ml纤维素酶溶液和1.5ml质量分数为1％的戊二醛溶液，混合均匀后，于150r/min振荡30min，4℃静置反应4h。将上述混合液用5ml注射器逐滴加入至10ml质量分数为2％的CaCl2溶液中，于50℃固定2.5h。过滤、更换CaCl2，4℃静置硬化2h。用10ml注射器吸取5ml质量分数为3％的壳聚糖溶液，室温下覆膜30min。用质量分数为0.9％的NaCl溶液洗涤，滤纸吸干表面水分，4℃保存。
海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶与海藻酸钠固定化纤维素酶的固定效果和性质分析见表1。
由表1可知，添加聚乙二醇和壳聚糖后，固定化纤维素酶的酶活力和酶活固定率分别提高30％和12％；反应五次后剩余相对酶活力可以提高85％；米氏常数减小41％.
表1固定化纤维素酶的性质分析
Figure BDA0001522201720000051
实施例2
海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶的制备，操作同实施例1，固定条件分别取各因素在“发明内容”中所述的最低值和最高值，对固定化酶的条件进行优化分析，结果如表2所示。
表2固定化纤维素酶的条件优化分析
Figure BDA0001522201720000052
Figure BDA0001522201720000061
实施例3
海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶用于水解微晶纤维素
1)海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶酶水解微晶纤维素：采用50ml摇瓶。加入0.5g TS微晶纤维素，固定化酶投加量为1.745g，加入pH＝4.93的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，使底物质量分数为6.89％。封口膜密封以防止水分挥发。于60℃、150r/min下酶水解48h，反应结束后抽滤，测滤液中的还原糖含量以得到酶水解得率；将固体残渣烘干后，测反应前后的质量变化。
2)为了说明本发明固定化方法的优势，用海藻酸钠固定化纤维素酶酶水解微晶纤维素进行对比：采用50ml摇瓶。加入0.5g TS微晶纤维素，固定化酶投加量为1.785g，加入pH＝5.13的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，使底物质量分数为4.60％。封口膜密封以防止水分挥发。于60℃、150r/min下酶水解48h，反应结束后抽滤，测滤液中的还原糖含量以得到酶水解得率；将固体残渣烘干后，测反应前后的质量变化。
海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶与海藻酸钠固定化纤维素酶的酶水解微晶纤维素的效果分析见表3。
由表3可知，添加聚乙二醇，酶水解反应后的还原糖含量增加2.5倍，酶水解得率和TS降解率分别提高134％和7％。
表3固定化纤维素酶酶水解反应的效果分析
Figure BDA0001522201720000071
实施例4
海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化纤维素酶用于水解微晶纤维素，操作同实施例3。酶水解条件分别取各因素在“发明内容”中所述的最低值和最高值，对酶水解反应的条件进行优化分析，如表4所示。
表4固定化纤维素酶酶水解反应条件的优化分析
Figure BDA0001522201720000072

Claims (3)

1.一种纤维素酶固定化的方法，其特征在于，具体步骤如下：准确称取纤维素酶粉末溶于纯水中，使其浓度为5mg/ml，待用；
准确称取壳聚糖加入至体积分数为2％乙酸溶液中，使壳聚糖的质量分数为3%，室温下混合均匀后，形成壳聚糖溶液，待用；
准确称取戊二醛配置成质量分数为1％戊二醛溶液，待用；
准确称取海藻酸钠和聚乙二醇加入pH为4.8的酸性缓冲溶液中，室温下混合均匀后，形成海藻酸钠-聚乙二醇溶液，待用；其中海藻酸钠与聚乙二醇的质量比为1:1.5，海藻酸钠溶液的质量分数为3.5％，聚乙二醇分子量为4000；
准确量取上述海藻酸钠-聚乙二醇溶液，依次加入上述纤维素酶溶液和戊二醛溶液，混合均匀后，于150r/min振荡30min，之后于4℃静置反应4h；混合液中海藻酸钠-聚乙二醇溶液：纤维素酶溶液：戊二醛溶液的体积比为5:1:1.5；将上述混合液逐滴加入至质量分数为2％的CaCl2溶液中，于50℃固定2.5h，过滤；更换新的CaCl2溶液后，0-6℃静置硬化1-3h；然后加入上述壳聚糖溶液，15-25℃下覆膜30min；之后用NaCl溶液洗涤，滤纸吸干表面水分，4℃以下保存；
海藻酸钠-聚乙二醇溶液：纤维素酶溶液：戊二醛溶液：CaCl2溶液：壳聚糖溶液的体积比为5:1:1.5:1:2。
2.固定化酶水解纤维素的方法，其特征在于，具体步骤如下：权利要求1所述固定化的方法制备的固定化纤维素酶用于水解纤维素，将纤维素加入缓冲溶液中，使得纤维素质量分数为3.0-17.0％，缓冲溶液pH为3.0-6.0；固定化纤维素酶加入上述的纤维素溶液中，投加量为每克纤维素0.5-4.0g；水解温度为40-60℃，在120-180r/min条件下水解12-72h。
3.根据权利要求2所述的固定化酶水解纤维素的方法，其特征在于，其中海藻酸钠-聚乙二醇-壳聚糖固定化酶水解纤维素的固定化酶投加量为每克纤维素3.49g，纤维素质量分数为6.89％，pH＝4.93，水解温度60℃，在150r/min条件下水解48h。
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Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads;Keehoon Won等;《Process Biochemistry》;20051231;第40卷;第2149-2154页 *
海藻酸钠交联包埋法固定化纤维素酶研究;王华等;《江苏农业科学》;20131231;第41卷(第3期);第325-327页 *
海藻酸钠固定化α-淀粉酶的研究;郑璐;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20140215;第A006-219页 *
纤维素酶固定化的工艺优化;马一方等;《中国沼气》;20181231;第36卷(第2期);第13-17页 *
聚乙二醇和海藻酸钠混合固定化硝化细菌研究;南晓梅等;《安全与环境学报》;20150831;第15卷(第4期);第206-210页 *

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