CN115232803B - 固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 - Google Patents
固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115232803B CN115232803B CN202210921885.3A CN202210921885A CN115232803B CN 115232803 B CN115232803 B CN 115232803B CN 202210921885 A CN202210921885 A CN 202210921885A CN 115232803 B CN115232803 B CN 115232803B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immobilized
- solution
- cellulase
- calcium chloride
- sodium alginate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims abstract description 79
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims abstract description 48
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 41
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 31
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000005543 nano-size silicon particle Substances 0.000 claims abstract description 19
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 6
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 4
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 4
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000004208 shellac Substances 0.000 description 3
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 description 3
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 description 3
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 2
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- LHJQIRIGXXHNLA-UHFFFAOYSA-N calcium peroxide Chemical compound [Ca+2].[O-][O-] LHJQIRIGXXHNLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019402 calcium peroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- -1 i.e. Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 229940074439 potassium sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/14—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置，固定化纤维素酶的制备方法包括以下步骤：1)、将海藻酸钠溶液、纳米二氧化硅、纤维素酶以及戊二醛混合均匀后滴入氯化钙溶液中，得到固定化酶小球；2)、将步骤1)中得到的固定化酶小球浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，并经紫外线照射；3)、将经步骤2)处理过的固定化酶小球在氯化钙溶液中浸泡后取出，即得到固定化纤维素酶。本发明可使纤维素酶可多次重复利用，提高其利用率。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体的说是固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置。
背景技术
纤维素酶具有巨大的生物技术潜力，近些年来，其已经在食品、纺织工业、饲料、医疗、中药提取以及新能源等诸多邻域扮演着至关重要的角色。但是，纤维素酶在生物技术和农业应用中大多存在热稳定性和储存稳定性差的问题，这些缺陷导致纤维素酶的可重复使用率较低，造成了纤维素酶资源的极大的浪费。且游离纤维素酶对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，很容易在水溶液中失活而降低其催化能力。
发明内容
本发明旨在提供固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置，使纤维素酶可多次重复利用，提高其利用率。
为了解决以上技术问题，本发明采用的具体方案为：固定化纤维素酶的制备方法，包括以下步骤：
1)、将海藻酸钠溶液、纳米二氧化硅、纤维素酶以及戊二醛混合均匀后滴入氯化钙溶液中，得到固定化酶小球；
2)、将步骤1)中得到的固定化酶小球浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，并经紫外线照射；
3)、将经步骤2)处理过的固定化酶小球在氯化钙溶液中浸泡后取出，即得到固定化纤维素酶。
优选的，海藻酸钠、纳米二氧化硅、纤维素酶、戊二醛的质量配比为：海藻酸钠溶液20-40份、纳米二氧化硅5-15份、纤维素酶1-10份、戊二醛5-20 份，步骤1)和步骤3)中氯化钙溶液的浓度为1-3％，步骤2)中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为1-3％。
优选的，步骤2)中，紫外线波长为254nm，紫外线照射时间为0.5-1.5h。
优选的，步骤3)中，将经步骤2)处理过的固定化酶小球在氯化钙和聚乙烯亚胺混合溶液中浸泡后取出，得到固定化纤维素酶，其中聚乙烯亚胺溶液的浓度为1-3％。
优选的，将步骤3)中得到的固定化纤维素酶置于紫胶溶液中浸泡半小时，浸泡后取出即得到具有紫胶膜的固定化纤维素酶，其中紫胶溶液的浓度为 3-6％。
优选的，将步骤1)中得到的固定化酶小球经蘸取氯化钙溶液的针进行穿刺，然后再经步骤2)处理。
实施上述穿刺固定化酶小球的固定化纤维素酶的制备装置，包括用于输送球体的输送机构和夹设在输送机构上方的机架，机架上由下至上设有吸附体和升降座，吸附体中吸附有氯化钙溶液，升降座的下沿间隔设有多个穿刺针，穿刺针可随升降座而升降，并穿过吸附体后刺入位于输送带上的球体。
优选的，在机架上位于吸附体的外周均匀间隔设有多个向吸附体中通入氯化钙溶液的接头。
优选的，穿刺针的外缘为粗糙面。
固定化纤维素酶，通过前述固定化纤维素酶的制备方法制备得到。
有益效果
本发明采用固定化的方式，提高纤维素酶的利用率，通过改性优化固定化纤维素酶的酶活性。固定化纤维素酶的多次重复酶解反应，有效降低了纤维素酶的使用成本。固定化酶的反应条件和稳定性都比游离酶的范围更宽，使用射线技术聚合纳米二氧化硅/海藻酸钠固定化纤维素酶有效提高了纤维素酶的利用率，进而提高生产效率，降低生产成本。
本发明使用的纳米二氧化硅颗粒因其独特的高表面积，可以提高每单位质量固定化酶的负载量。为了提高固定化酶载体材料的化学稳定性和生物相容性，使用了戊二醛对固定化酶载体材料性能进行一定程度的提升。另外使用的海藻酸是一种食品级载体材料，因具有价格低廉、操作简单、操作条件温和等优点，被广泛应用于固定化酶领域，海藻酸钠的包覆大大增强了酶的稳定性，是包埋酶的首选材料。所以，能够有效聚合纳米二氧化硅/海藻酸钠制成固定化酶载体，可提高形成固定化纤维素酶的负载量和稳定性。
本发明使用紫外线照射技术对固定化酶进行聚合。射线技术能够催化表面功能化和聚合物表面修饰，可以改善材料的功能性能。使用射线技术聚合纳米二氧化硅/海藻酸钠固定化纤维素酶，可有效提高固定化纤维素酶的酶活和稳定性。
本发明的固定化纤维素酶反应温和，稳定性高，可多次重复使用。
在本发明的一种优选实施方式中，使用改性材料聚乙烯亚胺作为门控分子和封堵剂。其作用为在固定化酶凝胶孔径处形成一种保护机制，起到控制和封堵的作用，更好的防止固定到载体上的酶溢出，同时不影响底物进出固定化酶中。
在本发明的另一种优选实施方式中，使用封膜改性剂紫胶溶液，其作用为在固定化酶凝胶表面形成一层保护膜，更好的保护固定到载体上的酶，同时不影响底物进入固定化酶中发生催化反应。
在本发明的另另一种优选的实施方式中，在固定化酶小球外部成型后即取出，并以蘸取有氯化钙溶液的穿刺针穿刺，从而可在固定化酶小球上形成孔，且使孔内壁经穿刺针上的氯化钙溶液的作用而硬化成型，进而使终产品的固定化酶小球具有更大的比表面积，供更多的底物同时与固定化酶小球中的纤维素酶接触并反应，大幅度提高了反应速率。
附图说明
图1为本发明实施例3中用于穿刺固定化酶小球的固定化纤维素酶的制备装置的结构示意图；
图2为绘制关于葡萄糖的标准曲线图；
图中标记：1、气缸，2、机架，3、升降座，4、穿刺针，5、接头，6、输送机构，7、吸附体，8、球体。
具体实施方式
以下通过4个实施例对本发明固定化纤维素酶及其制备方法进行说明：
实施例1
本实施例的固定化纤维素酶通过以下质量份数的原材料制备：海藻酸钠 20份、纳米二氧化硅5份、纤维素酶1份、戊二醛5份，另取浓度为1％的氯化钙溶液和浓度为1％的聚乙烯亚胺溶液分别置于容器中备用；制备方法包括如下步骤：
1)、取粉状的海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠溶液；将纤维素酶、纳米二氧化硅和戊二醛分别混于水中后依次加入配好的海藻酸钠溶液中得到混合液。将混合液置于摇床内，在转速为50rpm，温度为35℃条件下持续摇匀半小时，然后匀速滴入1％浓度的氯化钙溶液中以形成直径5mm左右的固定化酶小球。本步骤过程中，由氯化钙溶液作为固化剂为海藻酸钠提供钙离子，使位于混合液的液滴外部的海藻酸钠在接触钙离子后形成海藻酸钙并凝固成凝胶样以将纤维素酶和二氧化硅包覆在内形成固定化酶小球，并在固定化酶小球上遍布由 100-200μm左右的微孔。由戊二醛作为交联剂而更好的让酶和固定化材料即海藻酸和纳米二氧化硅链接在一起。
2)、将步骤1)中得到的固定化酶小球浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，并经紫外线照射。使用的紫外线波长为254nm，紫外照射时间为0.5h。聚乙烯亚胺通过紫外线照射改性海藻酸钙和二氧化硅的表面结构，更好的促进其与纤维素酶的链接，提高固定酶的稳定性。
3)、将经步骤2)处理过的固定化酶小球使用浓度为1％的NaCl溶液和水分别清洗三遍，然后浸泡于氯化钙溶液中，使固定化酶小球内部的海藻酸钠与钙离子反应已完成整体的成型凝固，成型凝固的温度为4℃，成型凝固时间为3小时，即得到本实施例的固定化纤维素酶。
实施例2
本实施例的固定化纤维素酶通过以下质量份数的原材料制备：海藻酸钠 25份、纳米二氧化硅8份、纤维素酶3份、戊二醛10份，另取浓度为2％的氯化钙溶液和浓度为2％的聚乙烯亚胺溶液分别置于容器中备用。
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，区别在于本实施例在步骤3) 中，将步骤2)中经紫外线照射过的固定化酶小球浸泡于氯化钙和聚乙烯亚胺溶液中进行成型凝固，制得本实施例的固定化纤维素酶。本实施例中使用改性材料聚乙烯亚胺作为门控分子和封堵剂。其作用为在固定化酶凝胶孔径处形成一种保护机制，起到控制和封堵的作用，更好的防止固定到载体上的酶溢出，同时不影响底物进出固定化酶中。
实施例3
本实施例的固定化纤维素酶通过以下质量份数的原材料制备：海藻酸钠35份、纳米二氧化硅12份、纤维素酶8份、戊二醛15份，另取浓度为3％的氯化钙溶液和浓度为3％的聚乙烯亚胺溶液分别置于容器中备用。
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，区别在于本实施例在步骤3) 后，将成型凝固后的固定化酶小球置于3％-6％的紫胶溶液中，浸泡半个小时，取出后经清洗即制得本实施例的固定化纤维素酶。本实施例使用一种封膜改性剂紫胶溶液，其可在固定化酶小球表面形成一层保护膜，更好的保护固定到载体上的酶以避免其流失，同时不影响底物进入固定化酶中发生催化反应。
实施例4
本实施例的固定化纤维素酶通过以下质量份数的原材料制备：海藻酸钠 40份、纳米二氧化硅15份、纤维素酶10份、戊二醛20份，另取浓度为1％的氯化钙溶液、3％的氯化钙溶液和浓度为3％的聚乙烯亚胺溶液分别置于容器中备用。
本实施例的制备方法与实施例1基本相同，区别在于本实施例在步骤1) 中采取较低浓度的氯化钙溶液，仅是固定化酶小球周面凝结硬化，而在步骤1) 后步骤2)前增加一道工序，通过本实施例中的固定化纤维素酶制备装置在步骤 2)中得到的外周成型的固定化酶小球上进行穿刺，形成孔径为0.5-0.8mm的穿刺孔，从而增大由本实施例制得的固定化纤维素酶的最终产品的比表面积，进而在底物反应过程中大幅度提高底物与纤维素酶的接触面积以提高反应速率。在穿刺过程中，穿刺针4上蘸取有高浓度的氯化钙溶液，使穿刺针4刺入外周成型的固定化酶小球上后，立即由穿刺针4上的氯化钙溶液提供钙离子与固定化酶小球内部的海藻酸钠反应凝结硬化，并在穿刺针4拔出形成凝结硬化孔，避免漏料。
与经步骤3)完全成型凝固后再进行穿刺得到高比表面积的最终产品相比，本实施例中在步骤1)中固定化酶小球内部未凝结时进行穿刺处理，一方面避免完全成型凝固的固定化酶小球在穿刺过程中导致的纤维素酶及骨架材料(海藻酸钠、二氧化钙)材料流失，材料浪费；另一方面本实施例在通过蘸取有高浓度氯化钙溶液的穿刺针4穿刺固定化酶小球的过程中，可使其内部与钙离子快速反应凝结，从而使固定化酶小球内部包覆的纤维素酶因穿刺针4的挤压而富集于穿刺孔的孔壁位置，形成了相较于固定化酶小球的周面而更高的纤维素酶反应区，使底物的反应速度大幅度提升。
本实施例的纤维素固定化酶制备设备主要用于本前述穿刺处理，如图1 所示，其主要包括用于输送由步骤1)制得的固定化酶小球(下称球体8)并送入步骤2)生产工序的输送机构6和用于穿刺球体8的执行机构，执行机构用于在球体8随输送机构6的输送过程中对球体8进行穿刺处理。
输送机构6选用常规的带式输送机，其两侧具有挡板以防止输送的球体 8掉落，其输送方向的前端具有震荡机构以尽可能的使球体8单层平铺与输送机构6上。
执行机构包括固定在输送机构6的静止架体上的机架2。该机架2的截面为如图1所示的倒U形，前后两端与输送机构6的输送面之间的间距略大于球体8外径，避免球体8相互堆叠而进入机架2内部。在机架2上由下至上分别设有吸附体7和升降座3。其中的吸附体7为海绵，其周向固定在机架2内壁上，在机架2上间隔设有多个与吸附体7相连的接头5，接头5远离吸附体7的端部连接在高位处的高浓度氯化钙溶液容器上，通过自流的方式使吸附体7吸附氯化钙溶液，并可通过调整氯化钙溶液容器的高度来平衡氯化钙溶液的势力和吸附体7的吸附力，在保证海绵体均匀吸附氯化钙溶液的基础上，尽可能的避免吸附体 7上的氯化钙溶液自由滴落。升降座3的底部与矩形列阵方式固定设有多根沿竖向分布的穿刺针4，升降座3的顶部与固定在机架2顶部的气缸1的活塞杆固定连接，使升降座3可在气缸1作用下沿竖向升降，并可在图1所示状态下下降至接近于吸附体7上沿的位置，并使穿刺针4穿过吸附体7并蘸取氯化钙溶液后刺入位于下方的球体8中。
在穿刺针4穿刺并复位至图1所示状态后，吸附体7的下沿对球体8形成限位，避免球体8随穿刺针4持续上升。本实施例中穿刺针4的外表面为粗糙的摩擦面，使其可蘸取更多的氯化钙溶液以确保穿刺后由足够的钙离子与球体8 内部的海藻酸钠反应完成凝结成型，且利于在球体8上形成孔壁粗糙的穿刺面，以进一步扩大产品的比表面积。
通过实验对以上4个实施例得到的固定化纤维素酶进行固定化酶活和重复使用5次后相对酶活保持率实验。
固定化酶活力测定：依次将1mL的柠檬酸缓冲液、0.5g的固定化纤维素酶、3mL的羧甲基纤维素钠溶液(0.8％)加入试管，用45℃的温度进行水浴30min。然后取出固定化纤维素酶，用超纯水清洗多次后测后续酶活。将3mLDNS溶液加入已取出固定化纤维素酶的试管中，塞上橡皮塞。沸水浴10min，降到室温后，用超纯水定容，最后得到溶液25mL。在510nm下测吸光值。
DNS试剂配制：A液：量取500mL的超纯水与1L的干净烧杯中，放入 45℃水浴，然后加入6.3g3、5-二硝基水杨酸，搅拌1～2min；B液：量取200mL 超纯水于干净烧杯中，加入准确称好的21g氢氧化钠，搅拌至完全溶解；将B 液缓慢加入A液中，边加入边搅拌至溶液完全溶解后，加入182g酒石酸钾钠搅拌至完全溶解后，再加入5g重蒸苯酚，搅拌溶解后，加入5g无水硫酸铜，再次搅拌溶解后停止加热，取出烧杯冷却至室温后，加水定容，最后得到溶液1000 mL。存于棕色瓶中，做好标记，避光贮存一周后使用。
固定化酶活力、酶回收率，根据DNS法测得的固定化酶活力为吸光值，之后通过葡萄糖标准曲线，将吸光值作为纵坐标及y值，利用线性回归方程得出 x值即为葡萄糖含量后，再通过下列公式可以得出固定化酶活力：
重复使用5次后相对酶活保持率：在所有条件相同的情况下，将一定量的固定化酶与底物反应后，测定酶活力。再将新的底物溶液加入该固定化酶中，再次测固定化酶活力，重复操作5次最终得到的酶活力，记第一次酶活力为100％，重复5次的酶活力与第一次酶活力相比得到的数值即为使用5次后的酶活保持率。
葡萄糖标准溶液配置：取8支试管并编号后，按下表加入1mg/mL葡萄糖标准溶液和超纯水，配置成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。
将各试管中的溶液混合均匀后，加入2.0mLDNS溶液，混合均匀后，沸水浴10min后，冷却至室温后，用超纯水定容到25mL。用1号试管中的溶液作为参照，在于490nm处测其他各个溶液的吸光度。绘制关于葡萄糖的标准曲线如图2所示：
由此可知回归方程为y＝0.1953x+0.0407，相关系数R2＝0.9888
最终的实验结果如下表所示：
而在反应速率方面，将相同重量的以上4个实施例得到的固定化纤维素酶分别加入到相同体积和浓度的底物的反应釜中，在相同的反应条件下，各个反应釜中底物消耗至中值所消耗的时间上，实施例1-3所对应的反应时间相当，而实施例4所对应的反应时间较实施例1-3减少24-30％。
Claims (6)
1.固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）、将海藻酸钠溶液、纳米二氧化硅、纤维素酶以及戊二醛混合均匀后滴入氯化钙溶液中，得到固定化酶小球；取粉状的海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠溶液；
2）、将步骤1）中得到的固定化酶小球浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，并经紫外线照射；
3）、将经步骤2）处理过的固定化酶小球在氯化钙溶液中浸泡后取出，即得到固定化纤维素酶；
海藻酸钠、纳米二氧化硅、纤维素酶、戊二醛的质量配比为：海藻酸钠溶液20-40份、纳米二氧化硅5-15份、纤维素酶1-10份、戊二醛5-20份，步骤1）和步骤3）中氯化钙溶液的浓度为1-3%，步骤2）中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为1-3%；
步骤2）中紫外线波长为254nm，紫外线照射时间为0.5-1.5h。
2.固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）、将海藻酸钠溶液、纳米二氧化硅、纤维素酶以及戊二醛混合均匀后滴入氯化钙溶液中，得到固定化酶小球；取粉状的海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠溶液；
2）、将步骤1）中得到的固定化酶小球浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，并经紫外线照射；
3）、将经步骤2）处理过的固定化酶小球在氯化钙和聚乙烯亚胺混合溶液中浸泡后取出，得到固定化纤维素酶，其中聚乙烯亚胺溶液的浓度为1-3%；
海藻酸钠、纳米二氧化硅、纤维素酶、戊二醛的质量配比为：海藻酸钠溶液20-40份、纳米二氧化硅5-15份、纤维素酶1-10份、戊二醛5-20份，步骤1）和步骤3）中氯化钙溶液的浓度为1-3%，步骤2）中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为1-3%；
步骤2）中紫外线波长为254nm，紫外线照射时间为0.5-1.5h。
3.根据权利要求1所述的固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于：将步骤3）中得到的固定化纤维素酶置于紫胶溶液中浸泡半小时，浸泡后取出即得到具有紫胶膜的固定化纤维素酶，其中紫胶溶液的浓度为3-6%。
4.根据权利要求1所述的固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于：将步骤1）中得到的固定化酶小球经蘸取氯化钙溶液的针进行穿刺，然后再经步骤2）处理。
5.实施权利要求4中的穿刺固定化酶小球的固定化纤维素酶的制备装置，其特征在于：包括用于输送球体（8）的输送机构（6）和夹设在输送机构（6）上方的机架（2），机架（2）上由下至上设有吸附体（7）和升降座（3），吸附体（7）中吸附有氯化钙溶液，升降座（3）的下沿间隔设有多个穿刺针（4），穿刺针（4）可随升降座（3）而升降，并穿过吸附体（7）后刺入位于输送带上的球体（8）；
在机架（2）上位于吸附体（7）的外周均匀间隔设有多个向吸附体（7）中通入氯化钙溶液的接头（5）；
穿刺针（4）的外缘为粗糙面。
6.固定化纤维素酶，其特征在于：通过权利要求1-4所述的任一固定化纤维素酶的制备方法制备得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210921885.3A CN115232803B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210921885.3A CN115232803B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115232803A CN115232803A (zh) | 2022-10-25 |
| CN115232803B true CN115232803B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=83676845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210921885.3A Active CN115232803B (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115232803B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006025932A (ja) * | 2004-07-13 | 2006-02-02 | Jms Co Ltd | 生体用縫合具及び生体用縫合方法 |
| CN107893062A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-04-10 | 北京化工大学 | 一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法 |
| CN108004229A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-08 | 北京化工大学 | 一种固定化纤维素酶的制备及其酶水解纤维素的方法 |
| CN112481248A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 华南农业大学 | 一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶及其制备方法与应用 |
| CN113430077A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-09-24 | 王盛龙 | 一种含酶洗衣凝胶球及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101945638A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-01-12 | 宝洁公司 | 递送颗粒 |
-
2022
- 2022-08-02 CN CN202210921885.3A patent/CN115232803B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006025932A (ja) * | 2004-07-13 | 2006-02-02 | Jms Co Ltd | 生体用縫合具及び生体用縫合方法 |
| CN107893062A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-04-10 | 北京化工大学 | 一种纤维素酶固定化及水解纤维素的方法 |
| CN108004229A (zh) * | 2017-12-25 | 2018-05-08 | 北京化工大学 | 一种固定化纤维素酶的制备及其酶水解纤维素的方法 |
| CN112481248A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 华南农业大学 | 一种聚氨酯纳米纤维膜固定化酶及其制备方法与应用 |
| CN113430077A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-09-24 | 王盛龙 | 一种含酶洗衣凝胶球及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115232803A (zh) | 2022-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102091603B (zh) | 一种新型吸附树脂的制备方法及应用 | |
| CN106423103B (zh) | 一种具有吸附-催化降解抗生素功能的复合水凝胶的制备和应用 | |
| CN105195099B (zh) | 一种β‑环糊精改性大孔氨基葡聚糖吸附剂的制备方法 | |
| CN109759132A (zh) | 复合光催化凝胶球的制备方法和复合光催化凝胶球 | |
| CN112980827B (zh) | 一种金属有机框架材料固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 | |
| CN109046288A (zh) | 一种可自行更新甲醛吸附剂的制备方法 | |
| CN115232803B (zh) | 固定化纤维素酶、固定化纤维素酶的制备方法及制备装置 | |
| CN102321194B (zh) | 水溶性低分子量壳聚糖的制备方法 | |
| CN105441513A (zh) | 一种玉米基多孔淀粉的制备方法 | |
| CN111715194A (zh) | 一种改性银杏叶生物炭的制备方法及应用 | |
| CN105400849A (zh) | 一种新型变性淀粉 | |
| CN108097313A (zh) | 一种氮化碳/壳聚糖气凝胶复合光催化剂及其制备方法和应用 | |
| CN107213804A (zh) | 一种抗菌反渗透复合膜及其制备方法和应用 | |
| CN106400466A (zh) | 一种碳纤维改性方法制备固定化载体材料 | |
| US20150320922A1 (en) | Method of producing a urea adsorbent | |
| Kamal et al. | Immobilization of glucose isomerase onto radiation synthesized P (AA-co-AMPS) hydrogel and its application | |
| CN108976344B (zh) | 一种淀粉基吸湿性树脂的制备方法 | |
| CN111471137A (zh) | 一种高吸水性树脂及其制备方法和应用 | |
| Ghollasi | Electrospun polyethersulfone nanofibers: a novel matrix for alpha-amylase immobilization | |
| CN103012830A (zh) | 一种多孔淀粉制备的方法及其产品 | |
| CN102010858A (zh) | 一种果胶酶固定化的载体及固定化方法 | |
| CN112964772B (zh) | 一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法 | |
| CN109971043B (zh) | 一种壳聚糖-聚乙烯醇-铁复合膜的制备方法与应用 | |
| CN104031904B (zh) | 一种水凝胶固定化漆酶‑介体酶促反应器 | |
| CN102294238B (zh) | 一种贵金属催化剂工业浸渍工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: He Le Inventor after: Yang Xiaoxing Inventor after: Jiang Xinyu Inventor after: Liu Yongchuang Inventor after: Wang Zhengbing Inventor after: Sun Zhongke Inventor after: Tian Erli Inventor after: Yue Zonghao Inventor after: Chen Can Inventor after: Zheng Manman Inventor after: Cui Han Inventor before: He Le Inventor before: Yang Xiaoxing Inventor before: Jiang Xinyu Inventor before: Liu Yongchuang Inventor before: Wang Zhengbing Inventor before: Sun Zhongke Inventor before: Tian Erli Inventor before: Yue Zonghao Inventor before: Chen Can Inventor before: Zheng Manman Inventor before: Cui Han |