CN112964772B - 一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶的固定方法,属于酶生物传感技术领域。具体步骤包括:纳米传感材料的合成;传感浆料的合成以及羧基化处理;芯片的丝网印刷;芯片的活化以及酶的固定。本发明基于共价键合法的酶固定化原理,通过在丝网印刷浆料中引入羧基(‑COOH),印刷出一种工作电极含有大量羧基的丝网印刷电极芯片,再将电极上的羧基活化,使其具有反应活性,与酶蛋白中的氨基(‑NH2)发生缩合反应,通过共价键将酶连接并固定到芯片上,实现酶的固定化。操作简单、固定化效率高,使酶在丝网印刷芯片上固定的同时,又不影响酶的活性,制备的酶电极具有很好的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于酶生物传感技术领域,涉及一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法。
背景技术
在电化学实验中,我们需要使用工作电极、参比电极和对电极组成三电极体系,再连接电化学工作站上对应的导线进行实验。丝网印刷芯片的出现极大推动了传感器的发展,实现了微型化、便捷式、批量化的生产。丝网印刷机刮刀将导电碳浆印刷在基板上,通过设计丝网板上芯片的构型可以制备出各种所需的芯片构型。
酶的固定化是生物传感领域一个重要的步骤,通过固定化步骤将游离的水溶性酶固定在电极表面,使酶的活性中心靠近电极表面,方便电子的收集与传输,并且酶电极可以重复多次使用。酶的固定化方法包括物理吸附、包埋法、交联法和共价键合法等。
目前使用最多的是戊二醛交联法,通过简单的混合使酶交联形成网络结构达到固定化的目的。然而戊二醛对酶活有很大抑制作用,尤其是乳酸氧化酶和丙酮酸氧化酶等,在极少量的戊二醛存在下也会使酶失活。而共价键合法将酶的非活性组分与电极通过共价键固定,限制酶的移动,因其稳定性高,重复性好而受到广泛关注,然而也受到电极和酶蛋白上官能团种类和强弱的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,通过对传统的丝网印刷传感芯片进行改性,使得印刷的芯片工作电极携带大量羧基,进而将羧基活化使其具有较高的反应活性,再与酶蛋白的氨基反应,使酶在丝网印刷芯片上固定的同时,又不影响酶的活性,具有很好的生物相容性,可以很好的应用于电化学生物传感领域。
为了达到上述目的,本发明是采用下述的技术方案实现的:
一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其具体步骤如下:
(1)纳米传感材料的合成:配置前驱体溶液普鲁士蓝A溶液(PBA)和普鲁士蓝B溶液(PBB),将Fe3O4纳米颗粒分散在PBB溶液中,将其转移至30℃水浴锅中磁力搅拌一段时间,再通过注射泵向其注入PBA溶液,加完后取出经过离心后得到Fe3O4@PB纳米传感材料;所述前驱体PBA溶液溶质为K3Fe(CN)6或 K4Fe(CN)6,所述前驱体PBB溶液溶质为FeCl3或FeCl2,溶剂均为水;
(2)传感浆料的合成以及羧基化处理:将导电碳浆与步骤(1)中的传感材料按比例混合均匀,再加入谷氨酸钠,充分搅拌至完全溶解,将传感浆料保存在-20℃冰箱中;
(3)芯片的丝网印刷:以步骤(2)中的传感浆料作工作电极,氯化银浆作参比电极,导电碳浆作对电极,通过丝网印刷得到三电极传感芯片;
(4)芯片的活化以及酶的固定:配置羧基活化剂溶液,将传感芯片浸泡至其中,一定时间后取出用去离子水冲洗,干燥后将酶溶液均匀滴涂在传感芯片工作电极表面,放置在4℃冰箱中保存;
优选步骤(1)中Fe3O4溶液的质量浓度为0.02-0.1mg/mL;PBA/PBB溶液浓度为10-100mM;磁力搅拌的时间为0.5-5h;注射泵的速率为100-1000μL/min。
优选步骤(2)中所述传感浆料与导电碳浆的混合比例为1:(1-20);加入的谷氨酸钠与导电碳浆的混合比例为1:(1-10),均为质量比。
优选步骤(4)中羧基活化剂溶液中溶质为一种缩合剂EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和一种保护剂NHS(N-羟基丁二酰亚胺),缩合剂的浓度范围为10-30mM,保护剂的浓度范围为20-100mM;浸泡时间为3-36h;(混合)酶溶液的浓度为0.05-1U/μL;滴涂于工作电极上的(混合)酶溶液为10-50μL/cm-2。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
本发明基于丝网印刷芯片和共价键合法的酶固定化原理,通过在丝网印刷浆料中加入氨基酸使其引入羧基,印刷出携带大量羧基的传感芯片,再使用羧基活化剂溶液使芯片上不具备反应活性的羧基活化,与酶蛋白中的氨基发生缩合反应,使酶蛋白通过共价键固定在电极表面。本发明操作简单、固定化效率高,使酶在丝网印刷芯片上固定的同时,又不影响酶的活性,制备的酶电极具有很好的稳定性。
附图说明
图1为Fe3O4@PB纳米传感材料电镜图。
图2为导电碳浆改性前后的傅里叶红外线光谱图。
图3为各实施例在pH为7的PBS缓冲液中的计时电流图线,B为丝网印刷芯片活化羧基24h条件下的it图,C为丝网印刷芯片活化羧基36h条件下的it图,D为丝网印刷芯片活化羧基12h条件下的it图,E为丝网印刷芯片活化羧基6h条件下的it图,F为丝网印刷芯片活化羧基3h条件下的it图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
下述各实施例中,为了合成一种高催化活性的传感材料,先配制普鲁士蓝A溶液(PBA)和普鲁士蓝B溶液(PBB),其中PBA溶液为K3Fe(CN)6或 K4Fe(CN)6的水溶液,所述前驱体PBB溶液为FeCl3或FeCl2的水溶液。将Fe3O4纳米颗粒分散在有PBB溶液的烧杯中,并将其转移至30℃水浴锅中磁力搅拌一段时间,使PBB溶液中的阳离子通过分子间作用力静电吸附在Fe3O4纳米颗粒上,再通过注射泵向其注入PBA溶液,PBA溶液中的阴离子与Fe3O4纳米颗粒上的阳离子发生反应,在Fe3O4纳米颗粒上原位生长一层普鲁士蓝纳米颗粒,滴加完后取出经过离心后得到Fe3O4@PB纳米传感材料;将传感材料与导电碳浆按比例混合得到传感浆料,同时加入氨基酸盐混合均匀使得传感浆料中携带大量羧基官能团;将上述传感浆料通过丝网印刷形成工作电极,印刷氯化银浆料形成参比电极,印刷导电碳浆形成对电极并连接三电极组成传感芯片;称取EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺),配制成羧基活化剂溶液,将印刷的芯片浸泡其中使芯片上碳浆中的羧基被活化剂活化,密封在冰箱中保存一段时间后取出用去离子水反复冲洗三次,在室温下晾干后将酶溶液均匀滴涂在工作电极表面,放置在4℃冰箱中保存。
各实施例中所用到的丝网印刷芯片采用如下步骤制得:
将传感浆料通过丝网板印刷在PET基底上形成工作电极,将氯化银浆料通过丝网板印刷在PET基底上形成参比电极,将导电碳浆通过丝网板印刷在PET基底上形成对电极并连接三电极,最后置于55℃烘箱中固化。
实施例1
称取1mg Fe3O4纳米颗粒分散到盛有50mL 10 mM FeCl2溶液的烧杯中,将烧杯转移至30℃水浴锅中磁力搅拌0.5h,将50mL 30mM K3Fe(CN)6溶液通过注射器固定在注射泵上,设置注射泵以1000μL/min的速率向烧杯内注入,注射结束后将烧杯的产品离心清洗得到传感材料。
将传感材料、谷氨酸钠与导电碳浆以1:1:6的质量比例混合均匀得到传感浆料,将传感浆料印刷在基底上形成工作电极,依次印刷参比电极、对电极得到传感芯片。
配制含有10mM EDC·HCl和20 mM NHS的羟基活化剂50mL,将传感芯片浸泡在活化剂里,在4℃冰箱中保存24h后取出芯片,用去离子水反复冲洗芯片表面三次,室温下阴干后滴涂5μL酶溶液(酶的种类不做限制,可以是单一酶或者混合酶溶液,浓度为0.8 U/μL),滴涂在工作电极上的酶溶液为30μL/cm-2,将酶电极保存在4℃冰箱中。
将所得到的电极芯片与电化学工作站连接,在-0.05V的电位下进行计时电流检测:本实施例所制备的电极芯片对底物检测的灵敏度为60.92μA·mM-1·cm-2,经过600次检测,其响应信号为初始信号的90%,表明该固定化方法制备的酶电极芯片具有较好的灵敏度和稳定性。
实施例2
称取3mg Fe3O4纳米颗粒分散到盛有50mL 40 mM FeCl2溶液的烧杯中,将烧杯转移至30℃水浴锅中磁力搅拌2h,将50mL 50mM K3Fe(CN)6溶液通过注射器固定在注射泵上,设置注射泵以800μL/min的速率向烧杯内注入,注射结束后将烧杯的产品离心清洗得到传感材料。
将传感材料、谷氨酸钠与导电碳浆以1:2:18的质量比例混合均匀得到传感浆料,将传感浆料印刷在基底上形成工作电极,依次印刷参比电极、对电极得到传感芯片。
配制含有10mM EDC·HCl和30 mM NHS的羟基活化剂50mL,将传感芯片浸泡在活化剂里,在4℃冰箱中保存36h后取出芯片,用去离子水反复冲洗芯片表面三次,室温下阴干后滴涂5μL酶溶液(酶的种类不做限制,可以是单一酶或者混合酶溶液,浓度为0.5 U/μL),滴涂在工作电极上的酶溶液为40μL/cm-2,将酶电极保存在4℃冰箱中。
将所得到的电极芯片与电化学工作站连接,在-0.05V的电位下进行计时电流检测:此例所制备的电极芯片对底物检测的灵敏度为46.82μA·mM-1·cm-2。经过600次检测,其响应信号为初始信号的81%,表明该固定化方法制备的酶电极芯片具有较好的灵敏度和稳定性。
实施例3
称取4mg Fe3O4纳米颗粒分散到盛有50mL 60 mM FeCl3溶液的烧杯中,将烧杯转移至30℃水浴锅中磁力搅拌3.5h,将50mL 60mM K4Fe(CN)6溶液通过注射器固定在注射泵上,设置注射泵以600μL/min的速率向烧杯内注入,注射结束后将烧杯的产品离心清洗得到传感材料。
将传感材料、谷氨酸钠与导电碳浆以1:2:12的质量比例混合均匀得到传感浆料,将传感浆料印刷在基底上形成工作电极,依次印刷参比电极、对电极得到传感芯片。
配制含有20mM EDC·HCl和50 mM NHS的羟基活化剂50mL,将传感芯片浸泡在活化剂里,在4℃冰箱中保存12h后取出芯片,用去离子水反复冲洗芯片表面三次,室温下阴干后滴涂5μL酶溶液((酶的种类不做限制,可以是单一酶或者混合酶溶液,浓度为0.05U/μL)),滴涂在工作电极上的酶溶液为50μL/cm-2,将酶电极保存在4℃冰箱中。
将所得到的电极芯片与电化学工作站连接,在-0.05V的电位下进行计时电流检测:此例所制备的电极芯片对底物检测的灵敏度为45.57μA·mM-1·cm-2。经过600次检测,其响应信号为初始信号的88%,表明该固定化方法制备的酶电极芯片具有较好的灵敏度和稳定性。
实施例4
称取2mg Fe3O4纳米颗粒分散到盛有50mL 80 mM FeCl3溶液的烧杯中,将烧杯转移至30℃水浴锅中磁力搅拌5h,将50mL 70mM K4Fe(CN)6溶液通过注射器固定在注射泵上,设置注射泵以300μL/min的速率向烧杯内注入,注射结束后将烧杯的产品离心清洗得到传感材料。
将传感材料、谷氨酸钠与导电碳浆以1:1:10的质量比例混合均匀得到传感浆料,将传感浆料印刷在基底上形成工作电极,依次印刷参比电极、对电极得到传感芯片。
配制含有20mM EDC·HCl和80 mM NHS的羟基活化剂50mL,将传感芯片浸泡在活化剂里,在4℃冰箱中保存6h后取出芯片,用去离子水反复冲洗芯片表面三次,室温下阴干后滴涂5μL酶溶液(酶的种类不做限制,可以是单一酶或者混合酶溶液,浓度为0.3 U/μL),滴涂在工作电极上的酶溶液为20μL/cm-2,将酶电极保存在4℃冰箱中。
将所得到的电极芯片与电化学工作站连接,在-0.05V的电位下进行计时电流检测:此例所制备的电极芯片对底物检测的灵敏度为33.83μA·mM-1·cm-2。经过600次检测,其响应信号为初始信号的90%,表明该固定化方法制备的酶电极芯片具有较好的灵敏度和稳定性。
实施例5
称取5mg Fe3O4纳米颗粒分散到盛有50mL 100 mM FeCl2溶液的烧杯中,将烧杯转移至30℃水浴锅中磁力搅拌3h,将50mL 100mM K3Fe(CN)6溶液通过注射器固定在注射泵上,设置注射泵以100μL/min的速率向烧杯内注入,注射结束后将烧杯的产品离心清洗得到传感材料。
将传感材料、谷氨酸钠与导电碳浆以1:2:15的质量比例混合均匀得到传感浆料,将传感浆料印刷在基底上形成工作电极,依次印刷参比电极、对电极得到传感芯片。
配制含有30mM EDC·HCl和100 mM NHS的羟基活化剂50mL,将传感芯片浸泡在活化剂里,在4℃冰箱中保存3h后取出芯片,用去离子水反复冲洗芯片表面三次,室温下阴干后滴涂5μL酶溶液(酶的种类不做限制,可以是单一酶或者混合酶溶液,浓度为0.2 U/μL),滴涂在工作电极上的酶溶液为10μL/cm-2,将酶电极保存在4℃冰箱中。
将所得到的电极芯片与电化学工作站连接,在-0.05V的电位下进行计时电流检测:此例所制备的电极芯片对底物检测的灵敏度为26.53μA·mM-1·cm-2。经过600次检测,其响应信号为初始信号的82%,表明该固定化方法制备的酶电极芯片具有较好的灵敏度和稳定性。
附图1-3为实施例1中得到的各材料表征图。其中,
附图1为Fe3O4@PB纳米传感材料电镜图。从图1中可以看出通过微速化学合成法能够在Fe3O4纳米颗粒表面生长出一层PB颗粒,颗粒大小分布较均匀。
图2为导电碳浆改性前后的傅里叶红外线光谱图。从图2中可以看出氨基酸的加入给碳浆引入了大量羧基官能团。
图3为各实施例在pH为7的PBS缓冲液中的计时电流图线,B为丝网印刷芯片活化羧基24h条件下的it图,C为丝网印刷芯片活化羧基36h条件下的it图,D为丝网印刷芯片活化羧基12h条件下的it图,E为丝网印刷芯片活化羧基6h条件下的it图,F为丝网印刷芯片活化羧基3h条件下的it图。从图3中可以看出传感芯片随着活化时间的延长,灵敏度不断提升,表明此时芯片上负载的有效酶量更多;但是当活化时间太久时,灵敏度反而降低且it曲线波动较大。表明有限的工作电极表面负载的酶量过多,会影响传感芯片电阻。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)纳米传感材料合成:配制前驱体的PBA溶液和PBB溶液,将Fe3O4纳米颗粒分散在PBB溶液中,得到分散液;转移至水浴锅中磁力搅拌,再通过注射泵注入PBA溶液,离心,得到Fe3O4@PB纳米传感材料;
其中PBA溶液和PBB溶液成分为:
PBA溶液溶质为K3Fe(CN)6 、PBB溶液溶质为FeCl2,
或 PBA溶液溶质为K4Fe(CN)6、PBB溶液溶质为FeCl3;
(2)传感浆料的合成以及羧基化处理:将导电浆料与Fe3O4@PB纳米传感材料混合,加入谷氨酸钠,搅拌后热处理,得到传感浆料,置于低温下保存备用;
(3)芯片的丝网印刷:传感浆料为工作电极、氯化银浆作参比电极、导电碳浆作对电极,通过丝网印刷得到三电极传感芯片;
(4)芯片的活化以及酶的固定:配制羧基活化剂溶液,加入三电极传感芯片浸泡,然后取出用去离子水冲洗,干燥,将酶溶液均匀滴涂在工作电极表面,低温下保存。
2.根据权利要求1所述基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,所述分散液中Fe3O4纳米颗粒质量浓度为0.02-0.1mg/mL;PBA/PBB溶液浓度为10-100mM;水浴锅温度为30℃,磁力搅拌的时间为0.5-5h;注射泵的速率为100-1000μL/min。
3.根据权利要求1所述基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,步骤(2)中所述Fe3O4@PB纳米传感材料与导电碳浆的质量比为1:(1-20);谷氨酸钠与导电碳浆的质量比为1:(1-10);热处理温度为50℃,热处理时间为30min,低温保存温度为-20℃。
4.根据权利要求1所述基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,步骤(4)中羧基活化剂溶液的溶质为EDC·HCl和NHS,EDC·HCl在溶液中的浓度为10-30mM,NHS在溶液中的浓度为20-100mM。
5.根据权利要求1所述基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,步骤(4)中浸泡时间为3-36h;低温下保存温度为4℃。
6.根据权利要求1所述基于丝网印刷芯片上酶的固定方法,其特征在于,步骤(4)中酶溶液的浓度为0.05-1U/μL;滴涂于工作电极上的酶溶液的量为10-50μL/cm-2。
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