CN107037009B - 一种表面等离子共振仪芯片的制作方法 - Google Patents

一种表面等离子共振仪芯片的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表面等离子共振仪芯片的制作方法。该芯片包括BK7玻璃片基底，上面镀有2‑3nm的铬层和47‑48nm的金膜层，两亲性的粘蛋白通过蛋白骨架的疏水基团连接到金膜表面，然后利用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺将粘蛋白侧链上糖残基的羧基基团活化并用于偶联赖氨酸，从而获得基于赖氨酸改性的粘蛋白表面等离子共振仪芯片。该方法制作的芯片在单一蛋白体系以及pH＝7.4的复杂体系均具有较强的抗污染性能，且易于自组装到各种表面，形成稳定规整的单分子层；该芯片具有优良的抗污染性能和高稳定性，且制备方法相对简便，有很好的可行性和普适性。

Description

一种表面等离子共振仪芯片的制作方法
技术领域
本发明涉及表面等离子共振谱仪抗污染芯片制备领域，特别是涉及一种表面等离子共振仪芯片的制作方法。
背景技术
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)仪是20世纪80年代出现的一种生物传感器技术，当入射光从高折射率介质入射到低折射率介质时，会发生全反射，此时若在介质交界面处镀一层金属薄膜(金或银)，入射光产生的渐逝波会引起金属表面自由电子发生集体振荡，进而形成等离子体，当渐逝波与表面等离子体振荡的频率和波数相等时，即产生共振现象(SPR)，导致能量从渐逝波转移到表面等离子波中，使反射光的强度大大减弱，呈现衰减全反射现象，当反射光的强度为零时的入射角称为共振角。共振角与金属薄膜界面介质折射率有关，而折射率又随结合在金属薄膜表面的分子质量而变化，故可通过分析共振角来获得分子间相互作用的信息，由于其具有检测快速且无需标记等特点，已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并且显示出广阔的应用前景。
SPR芯片是表面等离子共振仪最为核心的组件，提供产生SPR信号的必须物理条件，主要包括耦合器件、金属膜和表面基质。然而，应用表面等离子共振仪进行分析测试时，传感芯片的表面污染是一个普遍存在的问题，来自样品中的生物分子或微生物的非特异性吸附将降低定量检测的准确性，产生假阳性结果。因此，开发有效抵抗非特异性吸附的表面是提高表面等离子共振传感器灵敏度和精确度的首要问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于赖氨酸改性的粘蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制作方法，该方法相对简便且制得的芯片具有较强的抗蛋白能力。
本发明是通过以下技术方案加以实现的：
一种基于赖氨酸改性、粘蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制作方法，包括以下步骤：
a)裸金芯片制备：采用电子束蒸发镀膜技术在基底上涂覆一层2-3nm厚铬层和一层47-48nm厚金膜，获得裸金芯片；
b)裸金芯片预处理：将步骤a)获得的裸金芯片浸入水、30wt％浓氨水与30wt％双氧水按体积比3:1:1组成的混合溶液中，在70-90℃下浸泡10-20min，然后取出，用去离子水清洗3次，用氮气吹干备用；
c)粘蛋白溶液预处理：用pH为7.4的磷酸缓冲液配制3-5mg/mL粘蛋白溶液，所得的溶液以9000-12000rpm离心10分钟，去除聚集的蛋白；
d)粘蛋白修饰：将氮气吹干后的SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上，以pH为6-8的磷酸缓冲液为流动相，流速为50-100μL/min持续流过SPR芯片表面，待基线稳定时，注入100μL预处理后的粘蛋白，并以30-50μL/min的速度流过流通池，当出现信号时，停止流速，孵育10-20min，再以50-100μL/min的流速走缓冲液10-30min，用于清洗未结合牢固的粘蛋白；
e)赖氨酸改性：以pH为6-8的磷酸缓冲液为流动相，流速为50-100μL/min，待基线平稳后，往定量环内注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液，所述混合溶液中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为0.2-0.6M，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为0.1-0.2M，经流动相推动所述混合溶液到达粘蛋白修饰后的芯片表面，10-20min后注入100μL浓度为1-4mg/mL的赖氨酸，经流动相推动赖氨酸溶液到达芯片表面，经过乙醇胺封闭后，10-30min后获得赖氨酸改性的SPR传感芯片。
所述的基底为玻璃片或光纤，玻璃片基底优选BK7玻璃片。
步骤1)中所述的金膜还可以是银膜、硅烷膜或银/金复合膜。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明制备的SPR芯片在单一蛋白体系以及pH＝7.4的复杂体系均具有较强的抗污染性能，在本发明的一个实施例中，对单一蛋白溶液如溶菌酶、牛血清蛋白、羊免疫球蛋白溶液中蛋白的非特异性吸附量分别为3.68ng/cm2、6.20ng/cm2、8.64ng/cm2，相比裸金对复杂体系如10％、50％人血浆中蛋白的非特异性吸附量分别降低了88.9％和84.7％。
2)本发明制备的SPR芯片由于其组成为蛋白以及氨基酸，故具有良好的生物相容性。
3)本发明制备的SPR芯片具有高稳定性，干燥状态下储存2个月或室温条件下储存3个月后，抗污染性能无变化。
4)本发明的制备方法相对简便快速，有很好的可行性和普适性，解决了以往多步繁琐的制备过程，极大地提高了芯片表面修饰的效率。
5)本发明制备的SPR芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性。
6)本发明制备的SPR芯片易于自组装到各种表面，形成稳定规整的单分子层。
附图说明
图1为本发明的方法制备的SPR芯片的结构示意图；
图2本发明的一个实施例中赖氨酸改性的粘蛋白SPR芯片对2mg/mL溶菌酶、2mg/mL牛血清蛋白(BSA)以及0.5mg/mL的羊免疫球蛋白(IgG)溶液中蛋白的非特异性吸附量。
其中：
1-玻璃片基底 2-铬层 3-金膜层 4-赖氨酸改性的粘蛋白自组装单分子层。
具体实施方式
本发明的方法制作的芯片包括基底(优选BK7玻璃片)，上面镀有2-3nm的铬层和47-48nm的金膜层，两亲性的粘蛋白通过蛋白骨架的疏水基团连接到金膜表面，然后利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺将粘蛋白侧链上糖残基的羧基基团活化并用于偶联赖氨酸，从而获得基于赖氨酸改性的粘蛋白表面等离子共振仪芯片。
下面结合具体实施例对本发明的制作方法进行详细说明。
实施例1
一种基于赖氨酸改性、粘蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制作方法，包括以下步骤：
a)采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底上涂覆一层2nm厚的铬层和一层48nm厚的金膜，获得了裸金芯片。
b)裸金芯片预处理：将获得的裸金芯片浸入水、30％浓氨水与30％双氧水(体积比3:1:1)的混合溶液中，70℃下浸泡20min。然后取出，用去离子水清洗3次，用氮气吹干备用。
c)粘蛋白溶液预处理：用pH为7.4的磷酸缓冲液配制5mg/mL粘蛋白(从猪的胃部分泌得)溶液，所得的溶液以11000rpm离心10分钟去除聚集的蛋白。
d)粘蛋白修饰将氮气吹干后的SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为100μL/min持续流过SPR芯片表面，待基线稳定时，注入100μL预处理后的粘蛋白，并以50μL/min的速度流过流通池，当出现信号时，停止流速，孵育20min，再以100μL/min的流速走缓冲液10min，用于清洗未结合牢固的粘蛋白。
e)赖氨酸改性：以pH值为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为100μL/min。待基线平稳后，往定量环中内注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC，浓度为0.4M)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS，浓度为0.1M)的混合溶液，经流动相推动EDC/NHS溶液到达芯片表面。10min后注入100μL赖氨酸(lysine，2mg/mL)，经流动相推动赖氨酸溶液到达芯片表面，经过乙醇胺封闭后，30min后获得赖氨酸改性的SPR传感芯片。
以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为100μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入100μL 0.5mg/mL的羊免疫球蛋白(IgG)或2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)或2mg/mL的溶菌酶(lysozyme)或10％人血浆或50％人血浆，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量分别为：8.64ng/cm2、6.20ng/cm2、3.68ng/cm2，相比裸金对复杂体系如10％、50％人血浆中蛋白的非特异性吸附量分别降低了88.9％和84.7％。
该芯片在干燥状态下储存2个月或室温条件下储存3个月后，抗污染性能无变化。
实施例2
一种基于赖氨酸改性、粘蛋白修饰的表面等离子共振仪芯片的制作方法，包括以下步骤：
a)采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底上涂覆一层3nm厚铬层和一层47nm厚金膜，获得了裸金芯片。
b)裸金芯片预处理：将获得的裸金芯片浸入水、30％浓氨水与30％双氧水(体积比3:1:1)混合溶液中，80℃下浸泡10min。然后取出用去离子水清洗3次，用氮气吹干备用。
c)粘蛋白溶液预处理：用pH为7.4的磷酸缓冲液配制3mg/mL粘蛋白(从猪的胃部分泌得)溶液，所得的溶液以9000rpm离心十分钟去除聚集的蛋白。
d)粘蛋白修饰：将清洗后的SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50μL/min持续流过表面，待基线稳定时，注入100μL的预处理后的粘蛋白，并以30μL/min的速度流过流通池，当出现信号时，停止流速，孵育10min，再以50μL/min的流速走缓冲液20min，用于清洗未结合牢固的粘蛋白。
e)赖氨酸改性：以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50μL/min。待基线平稳后，往定量环中内注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC，浓度为0.6M)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS，浓度为0.2M)的混合溶液，经流动相推动EDC/NHS溶液到达芯片表面。20min后注入100μL赖氨酸(lysine，1mg/mL)，经流动相推动赖氨酸溶液到达芯片表面，经过乙醇胺封闭后，10min后获得赖氨酸改性的SPR传感芯片。
以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为50μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入100μL 0.5mg/mL的羊免疫球蛋白(IgG)或2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)或2mg/mL溶菌酶或10％人血浆或50％人血浆，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量分别为：9.81ng/cm2、7.52ng/cm2、3.96ng/cm2，相比裸金对复杂体系如10％、50％人血浆中蛋白的非特异性吸附量分别降低了85.6％和82.4％。
该芯片在干燥状态下储存2个月或室温条件下储存3个月后，抗污染性能无变化。

Claims (3)

1.一种表面等离子共振仪芯片的制作方法，其特征在于包括以下步骤：
a)裸金芯片制备：采用电子束蒸发镀膜技术在基底上涂覆一层2-3nm厚铬层和一层47-48nm厚金膜，获得裸金芯片；
b)裸金芯片预处理：将步骤a)获得的裸金芯片浸入水、30wt％浓氨水与30wt％双氧水按体积比3:1:1组成的混合溶液中，在70-90℃下浸泡10-20min，然后取出，用去离子水清洗3次，用氮气吹干备用；
c)粘蛋白溶液预处理：用pH为7.4的磷酸缓冲液配制3-5mg/mL粘蛋白溶液，所得的溶液以9000-12000rpm离心10分钟，去除聚集的蛋白；
d)粘蛋白修饰：将氮气吹干后的SPR芯片用柏油贴合到SPR系统的棱镜上，以pH为6-8的磷酸缓冲液为流动相，流速为50-100μL/min持续流过SPR芯片表面，待基线稳定时，注入100μL预处理后的粘蛋白，并以30-50μL/min的速度流过流通池，当出现信号时，停止流速，孵育10-20min，再以50-100μL/min的流速走缓冲液10-30min，用于清洗未结合牢固的粘蛋白；
e)赖氨酸改性：以pH为6-8的磷酸缓冲液为流动相，流速为50-100μL/min，待基线平稳后，往定量环内注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合溶液，所述混合溶液中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为0.2-0.6M，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为0.1-0.2M，经流动相推动所述混合溶液到达粘蛋白修饰后的芯片表面，10-20min后注入100μL浓度为1-4mg/mL的赖氨酸，经流动相推动赖氨酸溶液到达芯片表面，经过乙醇胺封闭后，10-30min后获得赖氨酸改性的SPR传感芯片。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述的基底为玻璃片或光纤。
3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于：所述的玻璃片为BK7玻璃片。
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