CN106018347B - 一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用。该制备方法包括:(1)清洗玻璃基片后烘干;(2)制备铬膜,再在铬膜上制备金膜,得裸金芯片;(3)滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应0.5~2小时后清洗干燥;(4)滴加NHS和EDC的混合溶液,使铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应15分钟~1小时后清洗干燥;(5)滴加溴乙酸溶液,使铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应8~24小时后清洗干燥,得空白芯片。本发明的制备方法只需2天即可完成,且得到的芯片比传统葡聚糖芯片(需要5天制备)具有更好的均匀性。
Description
技术领域
本发明属于表面等离子体传感芯片制备及生物医学检测技术领域,具体地涉及一种可用于小分子检测的表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用。
背景技术
皮质醇是早期测定和诊断人是否患有抑郁症的最重要生化指标。当人承受很重工作和生活压力时,长时期处在压力状况下,或者因生活节奏紧张的人,或者每晚睡眠少于8小时等等,他们体内的血液、尿、唾液中皮质醇浓度水平将增高或长期偏高。这时皮质醇的负面效应开始显现为新陈代谢的变动:血糖升高、食欲增加、体重上升、精神抑郁以及极度疲劳等等。
皮质醇是一种类固醇类激素,可以调节血压以及心血管功能并参与很多代谢过程。人体可根据血流中皮质醇的量,来调节皮质醇的浓度水平,并控制皮质醇的分泌和产生。正常情况下,身体能很好地控制皮质醇的分泌和调节血液中皮质醇的含量。正常的皮质醇代谢遵循一定的生理节奏,24小时循环一个周期,通常在早晨皮质醇水平最高,在凌晨最低。
血液中皮质醇的正常含量为30-140ng/mL(100-500nM)。唾液中的皮质醇正常含量为1-8ng/mL(3.5-27nM)。测定皮质醇含量可判断人的生理状态。检测皮质醇的常规方法有酶联免疫法、放射性免疫法、色谱质谱法等。这些常规检测方法,检测过程比较繁琐,大多需要标记、需要复杂的设备,不能实现皮质醇的现场、快速检测。
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是发生在平面金属膜界面的一种物理光学现象。SPR对平面金属膜界面附近的折射率变化非常灵敏。利用SPR原理可以检测发生在平面金属膜界面处100多nm范围内的生物分子相互作用。SPR检测方法具有灵敏度高、无需标记、可获得反应动力学过程等优点。
SPR生化分析系统(可参考中国发明专利CN98102366.5,CN200610066542.4,CN200810113244.5)主要由光学系统、机械系统、传感芯片、微流控测量池及其流体控制系统、计算机软件等部分组成。其中,SPR传感芯片是最为核心的组件,传感芯片提供了产生SPR信号的必需的物理条件,并且分子相互作用的研究是在传感芯片表面进行的,直接影响SPR检测灵敏度和稳定性。SPR传感芯片种类多,不同SPR传感芯片检测不同的目标分析物,同时传感芯片也是一种实验耗材,需要经常更换。
现有的SPR传感芯片主要是Biacore公司(现属于GE公司)的CM5芯片,芯片表面制备了一层葡聚糖凝胶层,利用葡聚糖凝胶层固定抗体,进行免疫反应。这种商业化的CM5芯片具有重复性好、稳定性高等优点,缺点是商品化CM5芯片十分昂贵,单片芯片售价在千元以上,必须配合Biacore公司的配套仪器才能使用,而且仪器的维护费用也特别高。CM5芯片虽然可以重复使用,但是一旦通道上固定了某一种抗体后,就不能再固定第二种抗体了,缺乏灵活性。葡聚糖凝胶层的制备过程(Masson J.F.,Battaglia T.M.,Davidson M.J.,Yoon-Chang K.,Prakash A.M.C.,Stephen B.,“Biocompatible polymers for antibodysupport on gold surfaces”,Talanta,2005,67(5),pp.918-925.)也十分繁琐,需要时间也很长,通常都需要5天时间。同时,根据同本发明芯片的测试结果对比可得,葡聚糖修饰SPR芯片固定的蛋白分子数量较少,进而影响检测灵敏度。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用。本发明的制备方法所需时间大为缩短,只需2天即可制备完成,且得到的芯片比传统葡聚糖芯片(需要5天制备)具有更好的均匀性。
具体地,本发明提供一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法,其包括如下步骤:
(1)清洗玻璃基片:依次以浓硫酸和去离子水煮洗玻璃基片,烘干;
(2)采用溅射或沉积的方法,在玻璃基片上制备出厚度为3-10nm的铬膜,然后在铬膜上面制备厚度为45-55nm的金膜,该金膜作为表面等离子体共振传感芯片的固相载体,制得裸金芯片;
(3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,采用自组装的方式对金膜表面进行化学修饰,室温反应0.5~2小时,然后清洗和干燥芯片;
(4)滴加NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺)的混合溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片;
(5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得交联的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室温反应8~24小时,然后清洗和干燥芯片,即制得空白芯片。
根据小分子检测的SPR传感芯片线下固定和线上固定的区别,所述制备方法还包括下述步骤(6)或(6’)。
所述步骤(6)包括如下子步骤:
a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片;
b)在芯片上滴加以醋酸缓冲液为溶剂的小分子偶联物溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,37度反应10分钟~2小时,然后清洗和干燥芯片;
c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,反应10分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片,即制得线下固定的小分子检测芯片。
所述步骤(6’)包括如下子步骤:
a’)将空白芯片安装在表面等离子体共振生化分析仪上,固定配套流通池;
b’)流动通入NHS和EDC的混合溶液,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应7分钟~0.5小时,然后用PBS缓冲液流动清洗;
c’)流动通入以醋酸缓冲液为溶剂的小分子偶联物溶液,室温反应10分钟~1小时,然后用PBS缓冲液流动清洗;
d’)流动通入乙醇胺溶液,然后用PBS缓冲液流动清洗,即制得在线固定的小分子检测芯片。
其中,优选地,步骤(2)中,在所述制得裸金芯片后,所述裸金芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,可置于常温保存待用。步骤(2)中的金可以银进行替代,即在铬膜上面制备银膜。
步骤(3)中,所述的改性牛血清白蛋白为本领域常规,一般采用改性试剂(包括二硫苏糖醇,Dithiothreitol,简称DTT;三(2-羧乙基)膦,Tris(2-carboxyethyl)phosphine,简称TCEP;β-巯基乙醇,β-Mercaptoethanol,简称ME或β-ME;)与普通牛血清蛋白进行混合反应制得,所述改性试剂的浓度优选为0.01~0.1g/L,所述普通牛血清白蛋白的浓度优选为1~20g/L,所述混合反应的溶液中优选含有0.5%-2%的NaCl,室温反应0.5~2小时,即获得改性牛血清白蛋白。所述的改性牛血清白蛋白,还可以以改性卵清蛋白(VOA)、改性生物蛋白等进行替代。
优选地,步骤(5)中,在所述制得空白芯片后,所述空白芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,可置于常温保存待用。
步骤(5)中,所述溴乙酸优选溶于1~4mol/L的NaOH溶液中,所述溴乙酸的浓度优选为0.5-2mol/L。
在步骤(3)、(4)、(5)和(6)中,所述清洗和干燥芯片可以是本领域常规的方法,具体优选:先用PBS缓冲液清洗,再用去离子水清洗,洗掉芯片上的未结合物质,最后用纯氮气吹干芯片。
优选地,步骤(4)、(6)和(6’)中,所述NHS和EDC的混合溶液是体积比为1:1的混合溶液,其中,所述NHS的浓度更优选0.1mol/L,所述EDC的浓度更优选0.4mol/L。
优选地,步骤(6)和(6’)中,所述乙醇胺溶液的浓度为1mol/L,pH值为8.5。
步骤(6)和(6’)中,所述小分子偶联物为本领域常规,一般为蛋白质与小分子的偶联物,所述蛋白质可以选自牛血清白蛋白(BSA)、牛血清丙种球蛋白(BGG)、卵清蛋白(VOA)、鸡丙种球蛋白(CGG)、钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)和人工合成多聚赖氨酸(PLL),优选牛血清白蛋白,所述小分子偶联物的浓度优选为10-1000mg/L,更优选为100mg/L。所述醋酸缓冲液为本领域常规,优选0.1M、pH值为4.5的醋酸缓冲液。所述小分子可以是皮质醇,也可以是其他的小分子,比如叶酸、生物素、多巴胺、小分子农药、小分子兽药(如磺胺、莠去津)、小分子添加剂等,凡是可以通过偶联物产生抗体的小分子都可以在本发明中使用,优选皮质醇。所述小分子偶联物是由无免疫原性的小分子化合物(被称为半抗原)和免疫原性蛋白质(被称为载体)组成。半抗原小分子化合物本身无免疫原性,单独免疫动物不能对其产生抗体;当半抗原与载体偶联再免疫动物则能对其产生抗体,并能单独与其抗体结合时,该偶联物与抗体对应,类似抗原-抗体。
优选地,在子步骤c)中,在所述制得线下固定的小分子检测芯片后,所述线下固定的小分子检测芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,可置于常温保存待用。
优选地,在子步骤b’)、c’)和d’)中,所述流动通入均是以本领域技术人员可以掌握的缓慢的速度连续流动通入。
本发明中,步骤(5)制得的空白芯片可以保存一年,优选6个月内使用;步骤(6)制得的线下固定的小分子检测芯片,可以保存半年,优选3个月内使用;步骤(6’)在线固定的小分子检测芯片可以2周内使用有效,优选即时使用。
本发明同时提供由上述制备方法制得的表面等离子体共振传感芯片。
本发明还提供上述表面等离子体共振传感芯片在生物医学检测领域中的应用。
所述应用包括利用表面等离子体共振传感芯片通过竞争抑制法检测小分子的步骤。优选地,所述应用包括如下检测步骤:
A)角度扫描:
通入PBSt缓冲液1-5min,流速100μl/min-1000ml/min,静置,然后扫描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲线,角度扫描范围为55-70度;
B)定点监测:
在步骤A)中所述的SPR吸收峰曲线中选择线性区域中的一个角度,进行角度定位,然后进行定点监测;通入PBSt缓冲液1-5min,流速100μl/min-1000ml/min;通入含有待测样品和已知抗体浓度的混合溶液,进行免疫竞争抑制反应5-15min,流速10μl/min-100ml/min,连续流动反应;反应结束,通入PBSt缓冲液,1-5min,流速100μl/min-1000ml/min;通入再生溶液,连续流动0.5-1min,流速100μl/min-500ml/min;再生结束,通入PBSt缓冲液1-5min,流速100μl/min-1000ml/min;
C)建立标准曲线:
将待测物的标准品用PBSt缓冲液配制成不同浓度的标准溶液,将该不同浓度的标准溶液分别与定量待测物小分子的抗体混合,静置,得到各个标准溶液与定量待测物小分子的抗体的混合溶液;以PBSt缓冲液为基准,各个标准溶液与定量待测物抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流控测量池,与表面等离子体共振传感芯片上的小分子偶联物发生免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行步骤B)的定点监测,记录SPR信号(反射光强RU)的变化,获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线,以标准溶液浓度作为横坐标,SPR信号变化(ΔRU)作为纵坐标,绘制工作曲线,并进行曲线拟合,获得标准曲线;
D)未知样品的检测:
将未知样品和定量待测物小分子的抗体的混合溶液流动通入微流控测量池进行免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行表面等离子体共振扫描,记录SPR信号变化(ΔRU),获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线,结合步骤(C)得到的标准曲线,计算出未知样品中待测物小分子的浓度。
其中,所述小分子可以是皮质醇,也可以是其他的小分子,比如叶酸、生物素、多巴胺、小分子农药、小分子兽药(如磺胺、莠去津)、小分子添加剂等,凡是可以通过偶联物产生抗体的小分子都可以在本发明中使用,优选皮质醇。
步骤A)、B)和C)中所述的PBSt缓冲液为本领域常规,优选在PBS缓冲液中加入0.5%(v/v)的Tween-20得到。
步骤C)中,所述标准溶液的浓度范围如本领域常规,一般为0.01~5000μg/L,优选为0.1-1000μg/L,更优选为1-100μg/L。
步骤D)中的未知样品可以是唾液、血清或血浆,优选经过简单的过滤处理。
步骤C)和D)中,所述的定量待测物小分子的抗体在混合溶液中的终浓度优选为1-30mg/L,更优选为10mg/L。
所述检测步骤优选还包括在检测完成后的清洗和准备下一样品检测的步骤E):
步骤D)中的免疫反应结束后,微流通池流动通入PBSt缓冲液清洗1-5min,流速100μl/min-1000ml/min;再通入再生溶液,连续流动0.5-1min,流速100μl/min-500ml/min;使抗原-抗体结合物解离;然后通入PBSt缓冲液清洗1-5min,流速100μl/min-1000ml/min;SPR信号值降回基线,继续检测下一个样品。
在上述各步骤中,所述再生溶液为本领域常规,优选pH为1.5-2.5的Tris溶液,或者浓度在5mM-30mM的HCl、H3PO4或NaOH溶液。
本发明具有下述有益效果:
本发明制备的空白芯片具有很好的SPR特性,不仅具有周期短的优点,2天即可以制备完成,而且制备得到的芯片比传统葡聚糖芯片(需要5天制备)具有更好的均匀性,不仅如此,本发明制备的空白芯片还具有更高的固定容量,可以固定更多的偶联物。实验还表明,相比现有技术,本发明制得的空白芯片在线修饰小分子偶联物后,在与相应抗体结合时,具有更高的检测灵敏度。
附图说明
图1是本发明的制备方法的流程示意图。
图2是不同芯片的SPR吸收峰曲线图。
图3是不同芯片线上固定偶联物的实时监测结果图。
图4(A)和图4(B)是不同芯片固定皮质醇偶联物后,不同抗体浓度与SPR信号变化的关系图。
图5是应用实施例1检测皮质醇的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
制备实施例1
如图1所示,其为本发明的制备方法的流程示意图。具体地,本发明的表面等离子体共振传感芯片的制备方法包括如下步骤:
(1)清洗玻璃基片:依次以浓硫酸和去离子水煮洗玻璃基片,烘干;
(2)采用溅射或沉积的方法,在玻璃基片上制备出厚度为3-10nm的铬膜,然后在铬膜上面制备厚度为45-55nm的金膜,该金膜作为表面等离子体共振传感芯片的固相载体,制得裸金芯片;
(3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,采用自组装的方式对金膜表面进行化学修饰,室温反应0.5~2小时,然后清洗和干燥芯片;
(4)滴加NHS和EDC的混合溶液(1比1混合,NHS的浓度0.1mol/L,EDC的浓度0.4mol/L),使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片;
(5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得交联的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室温反应8~24小时,然后清洗和干燥芯片,制得空白芯片,制得的芯片可以真空封装或充纯氮气封装,常温保存待用。空白芯片可以保存一年,6个月内使用为佳。
为了与现有技术的芯片比较均匀性,发明人进行了原子力显微镜测试。结果表明,本发明制备的空白芯片,不仅具有周期短的优点,2天可以制备完成;而且本发明制得的空白芯片在裸金芯片上固定改性牛血清白蛋白,牛血清白蛋白含有1个自由巯基键和17个二硫键,采用本发明的方法将牛血清白蛋白的二硫键打开,因此一个蛋白质分子就具有了35个自由巯基键,采用本发明的方法均匀结合到裸金芯片上作为载体层,原子力显微镜测试结果显示本发明制备得到的芯片比传统葡聚糖芯片(需要5天制备)具有更好的均匀性。
制备实施例2
线下固定的小分子检测SPR传感芯片制备方法还包括下述步骤(6),以皮质醇芯片为例。
所述步骤(6)包括如下子步骤:
a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液(1比1混合,NHS的浓度0.1mol/L,EDC的浓度0.4mol/L),使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片;
b)在芯片上滴加以0.1M醋酸缓冲液为溶剂的皮质醇偶联物溶液,耦联物的浓度为300mg/L,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,37度反应10分钟~2小时,然后清洗和干燥芯片;
c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,反应10分钟~1小时,然后清洗和干燥芯片,即制得线下固定的皮质醇检测芯片,制得的芯片可以真空封装或充纯氮气封装,常温保存待用,可以保存半年,3个月内使用为佳。
制备实施例3
线上固定的小分子检测SPR传感芯片制备方法还包括下述步骤(6),以皮质醇芯片为例。
所述步骤(6’)包括如下子步骤:
a’)将空白芯片安装在表面等离子体共振生化分析仪上,固定配套流通池;
b’)流动通入NHS和EDC的混合溶液(1比1混合,NHS的浓度0.1mol/L,EDC的浓度0.4mol/L),使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应7分钟~0.5小时,然后用PBS缓冲液流动清洗;
c’)流动通入以0.1M醋酸缓冲液为溶剂的皮质醇偶联物溶液,耦联物的浓度为100mg/L,室温反应10分钟~1小时,然后用PBS缓冲液流动清洗;
d’)连续缓慢流动通入乙醇胺溶液,浓度为1mol/L,pH值为8.5,然后用PBS缓冲液流动清洗,在线固定偶联物完成,即制得在线固定皮质醇检测芯片,该芯片可以即时使用,2周内使用有效。
应用实施例1
以制备实施例2制得的皮质醇芯片检测未知样品中皮质醇的浓度,包括如下步骤:
A)角度扫描:
通入PBSt缓冲液(PBS缓冲液中,含有0.5%的Tween-20),1-5min,流速100μl/min-1000ml/min,静置,然后扫描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲线,角度扫描范围:55-70度。
B)定点监测:
在以上SPR吸收峰曲线中选择线性区域中的一个角度,进行角度定位,然后进行定点监测。通入PBSt缓冲液(PBS缓冲液中,含有0.5%的Tween-20),1-5min,流速100μl/min~1000ml/min;通入含有检测样品(标准品或未知样品)和已知抗体浓度的混合溶液,进行免疫竞争抑制反应,5-15min,流速10μl/min~100ml/min,连续流动反应;反应结束,通入PBSt缓冲液,1-5min,流速100μl/min~1000ml/min;通入再生溶液,连续流动0.5~1min,流速100μl/min~500ml/min;再生结束,通入PBSt缓冲液,1-5min,流速100μl/min~1000ml/min。
C)建立标准曲线:
皮质醇标准品用PBSt缓冲液配制成不同浓度的标准溶液,不同浓度的皮质醇标准溶液分别与定量皮质醇抗体溶液混合,静置,得到各个标准溶液与定量皮质醇抗体的混合溶液;以PBSt缓冲液为基准,各个标准溶液与定量皮质醇抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流控测量池,与表面等离子体共振传感芯片上的皮质醇耦联物(小分子偶联物)发生免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行表面步骤B)中的等离子体共振的定点监测,记录SPR信号(反射光强RU)的变化,获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线,以标准溶液浓度作为横坐标,SPR信号变化(ΔRU)作为纵坐标,绘制工作曲线,并进行曲线拟合,获得标准曲线;
D)未知样品的检测:
将未知样品和定量皮质醇抗体的混合溶液流动通入微流控测量池进行免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行表面等离子体共振扫描,记录SPR信号变化(ΔRU),获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线,结合步骤C)得到的回归标准曲线,计算出未知样品中皮质醇小分子的浓度;
E)下一样品的检测:
步骤D)中的免疫反应结束后,微流通池流动通入PBSt缓冲液清洗1-5min,流速100μl/min~1000ml/min;再通入再生溶液(可以是Tris溶液pH为1.5-2.5,也可以是HCl,H3PO4,NaOH溶液,浓度在5mM-30mM),连续流动0.5~1min,流速100μl/min~500ml/min;使抗原-抗体结合物解离;然后通入二PBSt缓冲液清洗1-5min,流速100μl/min~1000ml/min;SPR信号值降回基线,继续检测下一个样品。
以下是结果分析,主要通过图2~图5来展示结果。
图2是不同芯片的SPR吸收峰曲线图。
图3是不同芯片线上固定偶联物的实时监测结果图。
图4(A)和图4(B)是不同芯片固定皮质醇偶联物后,不同抗体浓度与SPR信号变化的关系图。
图5是应用实施例1检测皮质醇的标准曲线。
图2显示不同芯片的SPR吸收峰,可以看出,本发明制备的空白芯片具有和传统方法制备的葡聚糖的芯片有类似的SPR吸收峰,吸收峰深度也与裸金片的SPR吸收峰相当,说明具有很好的SPR特性。
采用本发明制备的空白芯片和传统方法制备的葡聚糖芯片同时在线固定皮质醇偶联物,SPR系统监测固定过程,结果如图3所示。从图3可以看出,本发明制备的空白芯片具有更高的固定容量,可以固定更多的偶联物。
采用本发明制备的空白芯片和传统方法制备的葡聚糖芯片在线固定皮质醇偶联物后,利用SPR系统监测不同浓度皮质醇抗体与芯片反应,记录SPR信号变化的ΔRU值,结果如图4所示。从图4可以看出,本发明制备的空白芯片在线修饰皮质醇偶联物后,与皮质醇抗体的结合,具有更高的灵敏度,即本发明的芯片仅需更低浓度的皮质醇抗体就能够获得跟传统葡聚糖芯片相当SPR相对光强信号变化(ΔRU)值。
采用本发明的方法制得的皮质醇检测SPR传感芯片用于皮质醇检测的检测结果如图5所示,检测限为1ng/ml,检测范围是1-100ng/ml。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)清洗玻璃基片:依次以浓硫酸和去离子水煮洗玻璃基片,烘干;
(2)采用溅射或沉积的方法,在玻璃基片上制备出厚度为10nm的铬膜,然后在铬膜上面制备厚度为45-55nm的金膜,该金膜作为表面等离子体共振传感芯片的固相载体,制得裸金芯片;
(3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,采用自组装的方式对金膜表面进行化学修饰,室温反应0.5小时,然后清洗和干燥芯片;其中,所述改性牛血清白蛋白采用改性试剂与普通牛血清蛋白进行混合反应制得,改性试剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巯基乙醇,所述改性试剂的浓度为0.01~0.1g/L,所述普通牛血清白蛋白的浓度为1~20g/L,所述混合反应的溶液中含有0.5%~2%的NaCl,室温反应0.5~2小时,即获得所述改性牛血清白蛋白;
(4)滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟,然后清洗和干燥芯片;
(5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得交联的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室温反应8小时,然后清洗和干燥芯片,即制得空白芯片;
(6)继续执行包括如下子步骤的步骤:
a’)将空白芯片安装在表面等离子体共振生化分析仪上,固定配套流通池;
b’)流动通入NHS和EDC的混合溶液,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应7分钟,然后用PBS缓冲液流动清洗;
c’)流动通入以醋酸缓冲液为溶剂的小分子偶联物溶液,室温反应10分钟,然后用PBS缓冲液流动清洗;
d’)流动通入乙醇胺溶液,然后用PBS缓冲液流动清洗,即制得在线固定的小分子检测芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,在制得裸金芯片后,所述裸金芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,置于常温保存待用;
步骤(2)中的金用银进行替代,即在铬膜上面制备银膜。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)和(6)中,所述NHS和EDC的混合溶液是体积比为1:1的混合溶液;
步骤(6)中,所述乙醇胺溶液的浓度为1mol/L,pH值为8.5;
步骤(6)中,所述小分子偶联物为蛋白质与小分子的偶联物,所述蛋白质选自牛血清白蛋白BSA、牛血清丙种球蛋白BGG、卵清蛋白VOA、鸡丙种球蛋白CGG、钥孔嘁血蓝蛋白KLH和人工合成多聚赖氨酸PLL。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)、(6)中,所述NHS的浓度为0.1mol/L,所述EDC的浓度为0.4mol/L;
步骤(6)中,所述蛋白质选自牛血清白蛋白,所述小分子偶联物的浓度为10-1000mg/L;
所述醋酸缓冲液为0.1M、pH值为4.5的醋酸缓冲液;
所述小分子为皮质醇。
5.一种表面等离子体共振传感芯片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)清洗玻璃基片:依次以浓硫酸和去离子水煮洗玻璃基片,烘干;
(2)采用溅射或沉积的方法,在玻璃基片上制备出厚度为10nm的铬膜,然后在铬膜上面制备厚度为45-55nm的金膜,该金膜作为表面等离子体共振传感芯片的固相载体,制得裸金芯片;
(3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,采用自组装的方式对金膜表面进行化学修饰,室温反应0.5小时,然后清洗和干燥芯片;其中,所述改性牛血清白蛋白采用改性试剂与普通牛血清蛋白进行混合反应制得,改性试剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β-巯基乙醇,所述改性试剂的浓度为0.01~0.1g/L,所述普通牛血清白蛋白的浓度为1~20g/L,所述混合反应的溶液中含有0.5%~2%的NaCl,室温反应0.5~2小时,即获得所述改性牛血清白蛋白;
(4)滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟,然后清洗和干燥芯片;
(5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得交联的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室温反应8小时,然后清洗和干燥芯片,即制得空白芯片;
(6)继续执行包括如下子步骤的步骤:
a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白进行化学交联反应,室温反应15分钟,然后清洗和干燥芯片;
b)在芯片上滴加以醋酸缓冲液为溶剂的小分子偶联物溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,37度反应10分钟,然后清洗和干燥芯片;
c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均匀铺满整个芯片,继续滴加直至浸泡整个芯片,密封振荡反应,反应10分钟,然后清洗和干燥芯片,即制得线下固定的小分子检测芯片。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,在制得裸金芯片后,所述裸金芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,置于常温保存待用;
步骤(2)中的金用银进行替代,即在铬膜上面制备银膜。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,在所述制得空白芯片后,所述空白芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,置于常温保存待用;
步骤(5)中,所述溴乙酸溶于1~4mol/L的NaOH溶液中,所述溴乙酸的浓度为0.5-2mol/L;
在步骤(3)、(4)、(5)和(6)中,所述清洗和干燥芯片具体为:先用PBS缓冲液清洗,再用去离子水清洗,洗掉芯片上的未结合物质,最后用纯氮气吹干芯片。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)、(6)中,所述NHS和EDC的混合溶液是体积比为1∶1的混合溶液;
步骤(6)中,所述乙醇胺溶液的浓度为1mol/L,pH值为8.5;
步骤(6)中,所述小分子偶联物为蛋白质与小分子的偶联物,所述蛋白质选自牛血清白蛋白BSA、牛血清丙种球蛋白BGG、卵清蛋白VOA、鸡丙种球蛋白CGG、钥孔嘁血蓝蛋白KLH和人工合成多聚赖氨酸PLL;
在子步骤c)中,在制得所述线下固定的小分子检测芯片后,所述线下固定的小分子检测芯片以真空封装或充纯氮气封装后保存,置于常温保存待用。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)、(6)中,所述NHS的浓度为0.1mol/L,所述EDC的浓度为0.4mol/L;
步骤(6)中,所述蛋白质选自牛血清白蛋白,所述小分子偶联物的浓度为10~1000mg/L;
所述醋酸缓冲液为0.1M、pH值为4.5的醋酸缓冲液;
所述小分子为皮质醇。
10.权利要求1~9任一项所述的制备方法制得的表面等离子体共振传感芯片。
11.权利要求10所述的表面等离子体共振传感芯片在生物医学检测领域中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述应用为利用表面等离子体共振传感芯片通过竞争抑制法检测小分子,其具体包括如下检测步骤:
A)角度扫描:
通入PBSt缓冲液1~5min,流速100μl/min~1000ml/min,静置,然后扫描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲线,角度扫描范围为55-70度;
B)定点监测:
在步骤A)中所述的SPR吸收峰曲线中选择线性区域中的一个角度,进行角度定位,然后进行定点监测;通入PBSt缓冲液1~5min,流速100μl/min~1000ml/min;通入含有待测样品和已知抗体浓度的混合溶液,进行免疫竞争抑制反应5~15min,流速10μl/min~100ml/min,连续流动反应;反应结束,通入PBSt缓冲液,1~5min,流速100μl/min~1000ml/min;通入再生溶液,连续流动0.5~1min,流速100μl/min~500ml/min;再生结束,通入PBSt缓冲液1~5min,流速100μl/min~1000ml/min;
C)建立标准曲线:
将待测物的标准品用PBSt缓冲液配制成不同浓度的标准溶液,将该不同浓度的标准溶液分别与定量待测物小分子的抗体混合,静置,得到各个标准溶液与定量待测物小分子的抗体的混合溶液;以PBSt缓冲液为基准,各个标准溶液与定量待测物抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流控测量池,与表面等离子体共振传感芯片上的小分子偶联物发生免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行步骤B)的定点监测,记录SPR信号的变化,获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线,以标准溶液浓度作为横坐标,SPR信号变化作为纵坐标,绘制工作曲线,并进行曲线拟合,获得标准曲线;
D)未知样品的检测:
将未知样品和定量待测物小分子的抗体的混合溶液流动通入微流控测量池进行免疫反应,对表面等离子体共振传感芯片反应区进行表面等离子体共振扫描,记录SPR信号变化,获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线,结合步骤C)得到的标准曲线,计算出未知样品中待测物小分子的浓度。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,
其中,所述小分子为皮质醇;
步骤A)、B)和C)中所述的PBSt缓冲液为在PBS缓冲液中加入0.5%(v/v)的Tween-20得到;
步骤C)中,所述标准溶液的浓度范围为0.1~1000μg/L;
步骤D)中的未知样品为唾液、血清或血浆;
步骤C)和D)中,所述定量待测物小分子的抗体在混合溶液中的终浓度为1~30mg/L;
各步骤中,所述再生溶液是pH值为1.5~2.5的Tris溶液,或者浓度在5~30mM的HCl、H3PO4或NaOH溶液。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于,
步骤C)中,所述标准溶液的浓度范围为1~100μg/L;
步骤C)和D)中,所述定量待测物小分子的抗体在混合溶液中的终浓度为10mg/L。
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