BRPI0719118A2 - Conjugado anti-idiotipo e seu uso como um padrão em um imunoensaio - Google Patents

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJU- GADO ANTI-IDIOTIPO, SEU USO COMO UM PADRÃO EM UM IMUNOEN- SAIO E MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA CLASSE DE IMU- NOGLOBULINAS DE UM ANTICORPO ANTI-IDIOTIPO".
A presente invenção refere-se a um conjugado e seu uso como
um padrão ou controle positivo em um imunoensaio para a determinação de anticorpos antifármaco.
Antecedentes da Invenção
Imunoensaios de fase sólida padrão com anticorpos monoclo- nais que envolvem a formação de um complexo entre um anticorpo adsorvido sobre um suporte sólido (anticorpo de captura), o antígeno, e um anticorpo a outro epítope do antígeno conjugado com uma etiqueta detectável (anticorpo traçador). Portanto, forma-se um sanduíche: suporte sólido-anticorpo de captura-antígeno-anticorpo traçador. No sanduíche, a intensidade do anticorpo conjugado a etiqueta detectável é proporcional à concentração do antígeno no meio de incubação. O método de sanduíche padrão também é denominado imunoensaio de dupla ligação de antígeno porque anticorpos de captura e traçador ligam a diferentes epítopes do antígeno. Hoesel, W., et al., em J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110, reportam uma prova de ligação anti-antígeno EPO dupla em que foi usada uma mistura de rhEPO imobilizado acoplado a grupamentos amino e a carboidrato.
Imunoensaios tais como o ELISA de ligação dupla de antígenos são tipos de ensaio comuns na investigação de uma resposta imunogênica 25 de um paciente a um anticorpo fármaco (anticorpo terapêutico ou diagnós- tico). Mire-Sluis, A.R., et al., em J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16, resu- mem as recomendações para o design e otimização de imunoensaios usando detecção de anticorpos hospedeiros contra produtos de biotecnologia. De acordo com Mire-Sluis et al. os formatos de prova de anticorpos natifármacos 30 de conhecimento geral mostram desvantagens consideráveis. Provas de na- ticorpos antifármacos são mencionadas, por exemplo, na patente internacional No. WO 2005/045058; e na patente internacional No. WO 90/006515. Pro- vas de anticorpos anti-idiotípicos são mencionadas, por exemplo, na pa- tente dos Estados Unidos No. US 5.219.730; na patente internacional No. WO 87/002778; na patente europeia No. EP O 139 389; e na patente euro- peia No. EP 0 170 302. Wadhwa, M., et al., em J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17, reportam estratégias para a detecção, medição e caracteriza- ção de anticorpos indesejados induzidos por terapêuticos biológicos.
Análise sorológica de anticorpos humanos anti-humanos é des-
crita em Ritter, G., Cancer Res. 61 (2001) 6851-6859, e na patente interna- cional No. WO 2003/016909. A identificação de anticorpos humanos anti- humanos da classe de IgG requer uma etapa adicional de precipitação de proteína G antes da prova.
Sumário da Invenção
A invenção compreende um conjugado compreendendo um anti- corpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um an- ticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina.
Preferencialmente a referida imunoglobulina de referência não
está ligando especificamente o referido anticorpo anti-idiotipo e o referido anticorpo parental.
A invenção compreende adicionalmente o uso de um conjugado de acordo com a invenção como um padrão em um imunoensaio para a de- terminação de um anticorpo antianticorpo parental em uma amostra de um ser humano.
Preferencialmente o referido conjugado é usado como um pa- drão ou um controle positivo em uma determinação imunológica de um anti- corpo antianticorpo parental em uma amostra usando um imunoensaio san- duíche compreendendo um anticorpo de captura e um anticorpo traçador.
Preferencialmente o referido anticorpo de captura ou o referido anticorpo traçador é o referido anticorpo parental.
Preferencialmente o referido anticorpo antianticorpo parental é um anticorpo anti-idiotipo contra o referido anticorpo parental.
Preferencialmente o referido anticorpo parental é um anticorpo
terapêutico ou um anticorpo diagnóstico.
Preferencialmente o anticorpo de captura é selecionado entre o grupo compreendendo a cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, um fragmento Fab, Fab1, F(ab)2, ou F(ab')2 do referido anticorpo parental.
Preferencialmente conjugação do anticorpo de captura ao supor- te sólido é realizada por adsorção passiva.
Preferencialmente o anticorpo de captura é imobilizada através
de um par de ligação específica.
Preferencialmente o anticorpo de captura é conjugado a biotina e é realizada imobilização através de Avidina ou Estreptavidina imobilizadas.
Preferencialmente o anticorpo traçador é conjugado a uma eti- qeuta detectável através de um par de ligação específica.
Preferencialmente o anticorpo traçador é conjugado a digoxige- nina e é realizada ligação à etiqueta detectável através de um anticorpo con- tra digoxigenina.
Preferencialmente a determinação imunológica é realizada por ressonância de plasmon superficial.
Preferencialmente conjugação do anticorpo de captura e/ou tra- çador a seu parceiro de conjugação é realizada ligando-o quimicamente a- través de grupamentos de N-terminal e/ou c-amino (lisina), grupamentos c- amino de diferentes lisinas, grupamentos funcionais carbóxi-, sulfidril-, hidro- 20 xil-, e/ou fenólicos da espinha dorsal de aminoácidos do anticorpo, e/ou gru- pamentos de álcoois de açúcar da estrutura de carboidrato do anticorpo.
Preferencialmente o anticorpo de captura é conjugado ao supor- te sólido por adsorção passiva e portanto o anticorpo de captura conjugado ao suporte sólido compreende uma mistura de no mínimo dois anticorpos de 25 captura os quais são conjugados ao suporte sólido através de sítios de anti- corpos diferentes. Adsorção passiva é descrita, por exemplo, por Butler, I.E., Solid Phases in Immunoassay1 em: Immunoassays, Diamandis, E.P. e Chris- topoulos, T.K. (eds.), Academic Press San Diego (1996), pp. 205-225.
Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo de captura é imobilizado através de um par de ligação específica. Um par de ligação semelhante (primeiro componente/segundo componente) é, por e- xemplo, Estreptavidina ou Avidina/biotina, anticorpo/antígeno (vide, por e- xemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugated Techniques, Academic Press, 1996), lectina/polissacarídeo, esteróide/proteína de ligação de este- róides, hormônio/receptor hormonal, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G, e etc. Preferencialmente, o anticorpo parental de captura é conjugado a 5 biotina e é realizada imobilização através de Avidina ou Estreptavidina imobi- lizadas.
Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo traça- dor é conjugado a uma etiqueta detectável, preferencialmente conjugado através de um par de ligação específica. Um par de ligação semelhante (pri- 10 meiro componente/segundo componente) é, por exemplo, Estreptavidina ou Avidina/biotina, anticorpo/antígeno (vide, por exemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugated Techniques, Academic Press, 1996), lecti- na/polissacarídeo, esteróide/proteína de ligação de esteróides, hormô- nio/receptor hormonal, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G, e etc.
Preferencialmente, o anticorpo parental traçador é conjugado
através de digoxigenina e um anticorpo contra digoxigenina à etiqueta detec- tável.
Alternativamente o anticorpo parental traçador é conjugado a uma etiqueta eletroquimiluminescente, como um complexo de rutênio bispiri- dil.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção compreende um conjugado compreenden- do um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única 25 classe de imunoglobulina. Preferencialmente o referido anticorpo parental é um anticorpo terapêutico. Preferencialmente o referido anticorpo parental é um anticorpo diagnóstico.
O termo "anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo parental" de acordo com a invenção denota um anticorpo cultivado contra um anticorpo parental em um animal não- humano, isto é, um anticorpo não-humano. Preferencialmente o referido an- ticorpo cultivado contra um anticorpo parental é cultivado em um roedor ou um símio do gênero Macacus, especialmente preferencial em um camun- dongo, um coelho, ou um cynomolgus, ou obtido por uma técnica de display, preferencialmente por display de fago ou de ribossoma. Preferencialmente o anticorpo anti-idiotipo é um anticorpo policlonal. Também preferencialmente
o anticorpo anti-idiotipo é um anticorpo monoclonal. A imunização do animal é realizada preferencialmente com o anticorpo parental ou fragmentos do mesmo. Em uma etapa adicional, imunoglobulina do referido animal é isola- da e purificada usando adsorção por afinidade a uma/à região(ões) de CDR do anticorpo parental. O termo " região de CDR de um anticorpo parental" 10 denota as regiões de CDR da cadeia leve e pesada do anticorpo parental, isto é, compreende a cadeia leve do anticorpo parental CDR1, CDR2, CDR3, a cadeia pesada do anticorpo parental CDR1, CDR2, CDR3.
O termo "anticorpo parental" de acordo com a invenção denota um anticorpo o qual pode ser administrado como um fármaco (anticorpo fár- maco ou anticorpo terapêutico) ou como um meio diagnóstico (anticorpo di- agnóstico) a um indivíduo, de modo que uma amostra do referido indivíduo é suspeita de compreender o referido anticorpo parental depois da administra- ção. Dentro de um teste realizado de acordo com a invenção o anticorpo parental, o anticorpo de captura (parental), e/ou o anticorpo traçador (paren- tal) compreendem a "mesma" molécula de anticorpo, por exemplo, produzida recombinantemente com o mesmo vetor de expressão e compreendendo a mesma seqüência de aminoácidos. Anticorpos fármacos (anticorpos mono- clonais terapêuticos) estão sendo usados amplamente para o tratamento de várias doenças tais como doenças oncológicas (por exemplo, malignidades hematológicas e sólidas incluindo Iinfoma não-Hodgkin, câncer de mama, e câncer colorretal). Os anticorpos referidos são descritos, por exemplo, por Levene, A.P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146- 152. Os anticorpos referidos são, por exemplo, anticorpos contra CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, HLA-DR, CD33, CD40, CD52, CD80, CSF-1R, CTLA-4, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), EGFR, G250, GD3,
. HER2/neu, HER3, HER4, antígeno de membrana próstata-específico (PS- MA), CD56, VEGF, VEGF2, TLSPR, TIE-1, TIE-2, TNF-alpha, TNF como indutor fraco de apoptose (TWEAK), CEA1 Ep-CAM1 TRAIL, TRAIL-receptor 1, TRAIL-receptor 2, beta receptor de linfotoxina, antígeno Y de Levis, hep- sina, condroitina sulfato proteoglicano associado a melanoma (MCSP), IL-1 receptor, IL-6 receptor, VEGF-receptor 1, VEGFreceptor 2, ou IGF-1 recep- tor. Anticorpos terapêuticos também são descritos por Groner, B., et al., Curr. Mol. Med. 4 (2004) 539-547, e Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292- 302.
O termo "imunoglobulina de referência" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota uma imunoglobulina completa, isto é, uma imunoglobulina compreendendo uma região Fab e uma região Fc, bem como fragmentos de uma imunoglobulina completa, tais como a região Fc, o domínio CH2, ou o domínio Ch3. A imunoglobulina de referência é preferen- cialmente uma imunoglobulina humana. Preferencialmente a "imunoglobuli- na de referência" é uma imunoglobulina humana ou uma região Fc de uma imunoglobulina humana. A "imunoglobulina de referência" não está ligando especificamente o anticorpo anti-idiotipo e não ligando especificamente o anticorpo parental do conjugado de acordo com a invenção. A região Fe de uma imunoglobulina é obtida por clivagem por pepsina ou papaína de uma imunoglobulina completa. A imunoglobulina de referência é de uma "única classe de imunoglobulina". O termo "única classe de imunoglobulina" denota que a imunoglobulina de referência compreende uma seqüência de aminoá- cidos de região constante específica de classe de imunoglobulina seleciona- da entre as classes de imunoglobulinas A, Ε, M, e G. Para classe de imuno- globulina seqüências de aminoácidos de região constante específica vide, por exemplo, Pink, J.R., et al., Biochem. J. 117 (1970) 33-47.
Um "anticorpo antianticorpo parental" é um anticorpo ligando especificamente o anticorpo parental, isto é, um anticorpo contra um anticor- po parental. Do mesmo modo é um anticorpo antianticorpo anti-IL-6R um anticorpo ligando especificamente um anticorpo anti-IL-6R. Um " anticorpo antianticorpo parental" é um anticorpo dirigido contra qualquer região do an- ticorpo parental, como a região variável, a região constante ou a glicoestrutu- ra do anticorpo parental. Os anticorpos antianticorpo parental referidos po- dem ocorrer durante terapia com anticorpo como uma reação imunogênica de um paciente (vide Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49). Um "anticor- po anti-idiotipo" é um anticorpo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo parental. Um anticorpo anti-idiotipo especificamente liga à região CDR1 de cadeia leve, à região CDR2 de cadeia leve, à região CDR3 de cadeia leve, à região CDR1 de cadeia pesada, à região CDR2 de cadeia pesada, ou à região CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo paren- tal.
Um exemplo de anticorpo parental (preferencialmente monoclo- nal) é um anticorpo contra o IL-6 receptor (anticorpo anti-IL-6R). Um anticor- po semelhante é descrito, por exemplo, por Mihara, M., et al., Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326, Nishimoto, N., et al., Blood 106 (2005) 2627-2632, no experimento clínico NCT00046774, ou na patente internacional No. WO 2004/096274.
Um exemplo de anticorpo parental (preferencialmente monoclo-
nal) é um anticorpo contra IGF-1 receptor (anticorpo anti-IGF-1 R). Um anti- corpo semelhante é descrito, por exemplo, na patente internacional No. WO 2004/087756, ou na patente internacional No. WO 2005/005635.
O termo "ligando" ou "ligando especificamente" de acordo com a invenção se refere a ligar um antígeno, uma região constante de uma imu- noglobulina, um anticorpo parental, ou uma região de CDR de um anticorpo parental com um valor KD de menos de 10"6 M (M = mol/1) (por exemplo, 10" 12 M), mais preferencialmente por um valor KD na faixa de a partir de 10"9 M a IO15M em um ensaio BIAcore. "Ligação não-específica" é encontrada se o valor KD for maior do que 10 5 M (por exemplo, 10"4 M).
Os princípios de diferentes imunoensaios são descritos, por e- xemplo, por Hage, D.S., in Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R. Lu, B., et al., em Analyst 121 (1996) 29R-32R, reportam a imobilização orientada de anti- corpos para o uso em imunoensaios. Imunoensaios mediados por avidina- biotina são reportados, por exemplo, por Wilchek, M. e Bayer, E.A., em Me- thods Enzymol. 184 (1990) 467-469.
Anticorpos, especialmente seus domínios constantes, contêm funcionalidades de cadeia lateral de aminoácido, isto é, grupamentos reati- vos químicos, para acoplamento a um parceiro de ligação como uma super- fície, uma proteína, um polímero (tal como PEG, Celulose, ou Poliestirol), uma enzima, ou um membro de um par de ligação. Grupamentos reativos químicos de anticorpos são, por exemplo, grupamentos amino (grupamentos épsilon amino de lisinas, grupamentos alfa-amino), grupamentos tiol (cisti- nas, cisteínas, e metioninas), grupamentos ácido carboxílico (ácidos aspárti- cos, ácidos glutâmicos), e grupamentos alcoólicos de açúcar. Os métodos referidos são, por exemplo, descritos por Aslam, M. e Dent, A., Bioconjugati- on, MacMiIIan Ref. Ltd. (1999) 50-100.
Para conjugação de polipeptídeos, por exemplo, a suportes sóli- dos, são requeridos agentes de proteção química adequados. Estes formam, por exemplo, ligações em aminas de cadeia lateral desprotegida e são me- nos estáveis e diferentes das ligações no N-término. São conhecidos muitos agentes de proteção química semelhantes (vide, por exemplo, a patente eu- ropeia No. EP 0 651 761). Agentes de proteção química preferenciais inclu- em anidridos de ácidos dicarboxílicos cíclicos como anidridos maléicos ou citraconílicos.
O termo "amostra" inclui, mas não está limitado a, qualquer quantidade de uma substância de um ser humano. Semelhantes substâncias incluem, mas não estão limitadas a, sangue total, soro, ou plasma de um indivíduo, as quais são as fontes mais amplamente usadas de amostra na rotina clínica.
Suportes sólidos para imunoensaios de acordo com a invenção são amplamente descritos no estado da arte (vide, por exemplo, Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23).
O termo "suporte sólido" denota uma substância não-fluida, e inclui chips, vasos, e partículas (incluindo micropartículas e contas) feitas de materiais tais como polímero, metal (partículas paramagnéticas, ferromagné- ticas), vidro, e cerâmica; substâncias em gel tais como sílica, alumina, e géis de polímero; capilares, os quais podem ser feitos de polímero, metal, vidro, e/ou cerâmica; zeólitos e outras substâncias porosas; eletrodos; lâminas de microtítulo; tiras sólidas; e cuvettes, tubos ou outros recipientes de amostras de espectrômetro. Um componente de suporte sólido de um ensaio é dife- renciado de superfícies sólidas inertes com as quais o ensaio pode estar em contato em que um "suporte sólido" contém no mínimo uma porção sobre sua superfície, a qual se pretende que interaja com o anticorpo de captura, quer diretamente ou indiretamente. Um suporte sólido pode ser um compo- nente estacionário, tal como um tubo, tira, cuvette, ou lâmina de microtítulo, ou pode ser componentes não-estacionários, tais como contas e micropartí- culas. Micropartículas também podem ser usadas como um suporte sólido para formatos de ensaios homogêneos. Pode ser usada uma variedade de micropartículas que permitem tanto fixação não-covalente ou covalente de proteínas e outras substâncias. As partículas referidas incluem partículas de polímeros tais como poliestireno e poli(metilmetacrilato); partículas de ouro tais como nanopartículas de ouro e colóides de ouro; e partículas de cerâmi- ca tais como partículas de sílica, vidro, e óxidos metálicos. Vide, por exem- plo, Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
Um "chip" é um material sólido, não poroso, tal como metal, vi- dro ou plásticos. O material pode opcionalmente ser revestido, inteiramente ou em algumas áreas. Sobre a superfície do material qualquer série de pon- tos está presente, ou visível ou em coordenadas. Sobre cada ponto pode ser imobilizado um polipeptídeo definido, com ou sem encadeador ou espaçador para a superfície do material. Todos os documentos mencionados aqui, neste requerimento de
patente, tanto acima quanto abaixo, são por este incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
Cromogênios (pigmentos e grupamentos fluorescentes ou Iumi- nescentes), enzimas, grupamentos NMR-ativos ou partículas de metal, hap- tenos (por exemplo, digoxigenina), são exemplos de etiquetas detectáveis. A etiqueta detectável também pode ser um grupamento de reticulação fotoati- vável, por exemplo, um grupamento azido ou um azirina. Quelatos metálicos os quais podem ser detectados por eletroquimoluminescência também são grupamentos emissores de sinais preferenciais usados como etiquetas de- tectáveis, com particular preferência sendo dada a quelatos de rutênio, tais como, por exemplo, um quelato de (bispiridi1)32+ rutênio. Grupamentos de marcação de rutênio adequados são descritos, por exemplo, na patente eu- ropeia No. EP 0 580 979, na patente internacional No. 90/05301, na patente internacional No. WO 90/11511, e na patente internacional No. WO 92/14138.
A invenção compreende um conjugado compreendendo um anti- corpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um an- ticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina.
A invenção compreende um conjugado compreendendo um anti- corpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um an- ticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina selecionada entre o grupo compreendendo imunoglobulina humana E, imunoglobulina humana G, imunoglobulina humana M, ou imu- noglobulina humana A, isto é, a imunoglobulina de referência é ou da classe de IgE humana, ou da classe de IgG humana, ou da classe de IgM humana, ou da classe de IgA humana.
Preferencialmente a presente invenção compreende um conju- gado compreendendo um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo parental e uma imunoglobulina de refe- rência de uma única classe de imunoglobulina não ligando especificamente o referido anticorpo anti-idiotipo e não ligando especificamente o referido anticorpo parental.
Preferencialmente o referido anticorpo parental é um anticorpo terapêutico ou um anticorpo diagnóstico. Preferencialmente a referida imu- noglobulina de referência é uma imunoglobulina não funcionável de uma ú- nica classe de imunoglobulina ou uma região Fc de uma imunoglobulina de uma única classe de imunoglobulina.
O termo "anticorpo diagnóstico" denota um anticorpo o qual é ou um anticorpo natural ou um anticorpo produzido recombinantemente e o qual é usado para a detecção e visualização de seu antígeno alvo. Um anticorpo diagnóstico é usado, por exemplo, em sistemas de teste (por exemplo, ELI- SA), ou para estudo por imagens in vitro. Um anticorpo diagnóstico pode ser, por exemplo, um anticorpo terapêutico marcado.
Preferencialmente a referida imunoglobulina de referência é uma imunoglobulina humana ou uma região Fc de imunoglobulina humana.
A imunoglobulina de referência proporciona uma região constan- te específica de classe de imunoglobulina que pode ser especificamente Ii- gada por um anticorpo anticlasse de imunoglobulina, tal como um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. Portanto a imunoglobulina de referência pro- porciona o conjugado de acordo com a invenção com uma etiqueta específi- ca de classe de imunoglobulina, a qual pode ser especificamente identificada por um anticorpo etiqueta específico. Por exemplo, se a etiqueta for uma região constante de imunoglobulina G um anticorpo etiqueta específico é um anticorpo anti-imunoglobulina G.
Preferencialmente o referido anticorpo anti-idiotipo é um anticor- po policlonal e a referida imunoglobulina de referência é uma imunoglobulina policlonal. Também preferencialmente o referido anticorpo anti-idiotipo é um anticorpo policlonal e a referida imunoglobulina de referência é uma imuno- globulina monoclonal. Ainda preferencialmente o referido anticorpo anti- idiotipo é um anticorpo monoclonal and a referida imunoglobulina de referên- cia é uma imunoglobulina monoclonal.
O conjugado de acordo com a invenção é obtido por conjugação química de um anticorpo anti-idiotipo e uma imunoglobulina de referência.
No conjugado de acordo com a invenção é o anticorpo anti- idiotipo uma imunoglobulina funcionável e a imunoglobulina de referência uma imunoglobulina não funcionável. Isto denota que o anticorpo anti- idiotipo está ligando especificamente a seu anticorpo alvo, ao passo que o anticorpo de referência não está ligando especificamente qualquer antígeno humano. O anticorpo de referência é proporcionado de modo a apresentar uma região Fc tão similar quanto possível a imunoglobulinas que ocorrem naturalmente e não ligar um antígeno. Também está dentro do âmbito da presente invenção que o anticorpo anti-idiotipo e o anticorpo de referência não são o mesmo anticorpo, isto é, diferem por no mínimo 20 % dos resí- duos aminoácidos, isto é, têm uma identidade baseada na seqüência de a- minoácidos de 80 % ou menos. O anticorpo de referência pode ser um anti- corpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. O termo "monoclonal" confor- me usado dentro do presente requerimento denota uma população de anti- corpos produzidos por uma única célula e/ou sua progênie. O termo denota que os anticorpos têm a mesma seqüência de aminoácidos, isto é, os anti- corpos têm a seqüência de aminoácidos idêntica apesar de mutações inad- vertidas ocorrendo durante a propagação da(s) célula(s) produzindo esta.
O termo "imunoglobulina não funcionável" conforme usado den- tro deste requerimento denota uma imunoglobulina que liga a um antígeno humano com um valor K0 (afinidade de ligação) de 10"5 mol/l ou superior (por exemplo, 10"3 mol/l), preferencialmente com um valor KD de 10"6 mol/l ou superior. A afinidade de ligação é determinada com um prova de ligação de rotina, tal como técnica de ressonância de plasmon superficial (BlAcore®). Este valor de afinidade de ligação não deve ser tratado como um valor exa- to; é simplesmente um ponto de referência. É usado para determinar e/ou selecionar imunoglobulinas que não apresentam ligação específica imuno- globulina-típica para antígenos humanos e portanto não têm atividade tera- pêutica em humanos. Isto não exclui que a imunoglobulina apresenta uma ligação específica para antígenos não-humanos. Esta ligação específica de um antígeno não-humano é associada com um valor K0 de 10'7 mol/l ou infe- rior (por exemplo, 10"10 mol/l), preferencialmente com um valor K0 de 10"8 mol/l ou inferior.
Com base em transfectomas, isto é, em células linfóides conten- do genes de imunoglobulina transfectados obtidos de camundongos imuni- zados, um conjugado de acordo com a invenção pode ser obtido por conju- gação no nível de ácidos nucléicos.
A administração de fármacos a mamíferos originários do exterior do organismo receptor, por exemplo, a administração de polipeptídeos tera- pêuticos exógenos, resulta em uma resposta imune do mamífero receptor. Esta resposta imune se torna evidente pela ocorrência de anticorpos anti- fármacos. Para a avaliação de uma resposta imune semelhante é necessário um método para a detecção dos anticorpos contra o fármaco.
O conjugado de acordo com a invenção pode ser usado como
padrão no imunoensaio. Deste modo, a invenção compreende o uso de um conjugado compreendendo um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamen- te a uma região de CDR de um anticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina como um padrão em um imunoensaio para a determinação de um anticorpo antianticorpo parental em uma amostra de um ser humano.
Além disso o conjugado de acordo com a invenção pode ser u- sado como um controle positivo em um imunoensaio. Permite, por exemplo, o estabelecimento de um limite de detecção. Portanto, a invenção compre- ende o uso de um conjugado compreendendo um anticorpo anti-idiotipo li- gando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo parental e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina como um controle positivo em um imunoensaio para a determinação de um anticorpo antianticorpo parental em uma amostra de um ser humano. Prefe- rencialmente o referido conjugado é adicionado nesta modalidade à amostra de um ser humano antes do imunoensaio.
O anticorpo parental é preferencialmente um anticorpo terapêuti- co. Também preferencialmente o anticorpo parental é um anticorpo murino, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, ou anticorpo humano. Preferen- cialmente o anticorpo parental é um anticorpo quimérico, anticorpo humani- zado, ou anticorpo humano. Especialmente preferencialmente o referido an- ticorpo parental é um anticorpo terapêutico quimérico, humanizado, ou hu- mano. Para a detecção de anticorpos contra um anticorpo parental podem ser empregados diferentes métodos, tais como radioimunoensaio (RIA), en- saio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ensaios imunorradiométricos (IRMA), ou ressonância de plasmon superficial (SPR).
O termo "anticorpo terapêutico" e equivalentes gramaticais do mesmo usados dentro deste requerimento denotam um anticorpo, preferen- cialmente monoclonal, o qual se pretende que seja administrado a mamífe- ros, preferencialmente humanos, para uso no tratamento, terapia, ou diag- nóstico de uma doença. Um anticorpo terapêutico é geralmente produzido por meios recombinantes, por exemplo, pela cultura de uma célula eucarióti- ca transfectada com um ácido nucléico codificando o referido anticorpo tera- pêutico. Preferencialmente o anticorpo terapêutico é um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. O anticorpo terapêu- tico é administrado para obter um efeito desejado, tal como, por exemplo, depleção de células-alvo, ou mediação de ADCC (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos), ou mediação de CDC (citotoxicida- de dependente do complemento). Células-alvo podem ser, por exemplo, cé- lulas cancerígenas, ou células infectadas por vírus. Àra mediar ADCC ou CDC o anticorpo terapêutico deve ligar à célula alvo e portanto é específico para, isto é, ligando especificamente, por exemplo, um antígeno tumoral.
Um "antígeno tumoral", conforme usado aqui, neste requerimen- to de patente, inclui o significado conhecido na técnica, o qual inclui qualquer molécula expressada sobre (ou associada com o desenvolvimento de) uma célula tumoral que é conhecida ou que se imagina que contribua para uma característica tumorigênica da célula tumoral. Numerosos antígenos tumo- rais são conhecidos na técnica. Se uma molécula é um antígeno tumoral também pode ser determinado de acordo com técnicas e testes de conheci- mento geral daqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, provas clonogênicas, provas de transformação, provas de formação de tumor in vi- tro ou in vivo, provas de migração em gel, análise de nocaute genético, e etc. Preferencialmente o termo "antígeno tumoral" quando usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma proteína transmembrana humana, isto é, uma proteína da membrana celular a qual é ancorada na bicamada lipídica das células. A proteína transmembrana humana geralmente compre- enderá um "domínio extracelular" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o qual pode ligar um ligante, um domínio transmembrana lipofíli- co, um domínio intracelular conservado, por exemplo, um domínio tirosina quinase, e um domínio de sinalização de terminal carboxila portando vários resíduos tirosina os quais podem ser fosforilados. O antígeno tumoral inclui moléculas tais como EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, EpCAM, CEA, TRAIL, TRAIL-receptor 1, TRAIL-receptor 2, beta receptor de linfotoxina, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), hepsina, condroitina sulfato proteoglicano associado com melanoma (MCSP), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), VEGF receptor 1, VEGF receptor 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE- 1, TIE-2, TNF-alfa, TNF como indutor fraco de apoptose (TWEAK), ou IL-1R. Preferencialmente o conjugado de acordo com a invenção é u-
sado como um padrão em uma determinação imunológica de um anticorpo antianticorpo parental em uma amostra, usando um imunoensaio sanduíche compreendendo um anticorpo de captura e um anticorpo traçador. Especi- almente preferencial o referido anticorpo de captura ou o referido anticorpo traçador é o referido anticorpo parental.
Por exemplo, provas de anticorpos antifármaco são menciona- das na patente internacional No. WO 2005/045058, e na patente internacio- nal No. WO 90/006515, provas de anticorpos anti-idiotípicos são menciona- da na patente dos Estados Unidos No. US 5.219.730, na patente internacio- nal No. WO 87/002778, na patente europeia No. EP 0 139 389, e na patente europeia No. EP 0 170 302.
Preferencialmente o referido anticorpo anti-idiotipo é um anticor- po monoclonal e a referida imunoglobulina de referência é uma imunoglobu- Iina policlonal humana. Também preferencialmente o referido anticorpo anti- idiotipo é um anticorpo monoclonal e a referida imunoglobulina de referência é uma imunoglobulina monoclonal humana.
O conjugado de acordo com a invenção é preferencialmente u- sado como um padrão na determinação imunológica de um anticorpo anti- idiotipo contra um anticorpo parental em uma amostra. Para a determinação imunológica são empregados um anticorpo de captura e um anticorpo traça- dor. Em uma modalidade o anticorpo de captura é o anticorpo parental. Pre- ferencialmente o anticorpo parental usado como o anticorpo de captura é um anticorpo completo, isto é, compreende uma cadeia leve e uma pesada em que a cadeia leve compreende um domínio variável e um domínio constante, e em que a cadeia pesada compreende um domínio variável, um Ch1, um Ch2, um Ch3, e um domínio Ch4 opcional e uma região de articulação. Pre- ferencialmente o anticorpo de captura é selecionado entre o grupo compre- endendo a cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, um fragmento Fab1 Fab', F(ab)2, ou F(ab')2 do referido anticorpo parental, isto é, é ou a ca- deia leve, a região variável da cadeia pesada, o fragmento Fab, ou Fab', ou F(ab)2, ou F(ab')2 do referido anticorpo parental. Em uma outra modalidade o anticorpo traçador é o anticorpo parental. Nesta modalidade, por exemplo, o conjugado de acordo com a invenção é ligado através de uma imunoglobu- Iina ligando especificamente a imunoglobulina de referência do conjugado ao suporte sólido.
A conjugação de um anticorpo traçador e/ou de captura a seu parceiro de conjugação pode ser realizada por diferentes métodos, tais como adsorção passiva, ligação química, ou ligação através de um par de ligação específica. O termo "parceiro de conjugação" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota por exemplo, suportes sólidos, polipeptí- deos, etiquetas detectáveis, membros de pares de ligação específica. Em uma modalidade a conjugação do anticorpo de captura e/ou traçador a seu parceiro de conjugação é realizada ligando quimicamente através de grupa- mentos de N-terminal e/ou c-amino (lisina), grupamentos c-amino de diferen- tes lisinas, grupamentos funcionais carbóxi-, sulfidril-, hidroxil-, e/ou fenólicos da espinha dorsal de aminoácidos do anticorpo, e/ou grupamentos alcoólicos de açúcar da estrutura de carboidrato do anticorpo. Em uma modalidade o anticorpo de captura e/ou traçador são/é conjugado a seu parceiro de conju- gação através de um par de ligação específica. Preferencialmente o anticor- po de captura é conjugado a biotina e é realizada imobilização a um suporte sólido atravás de avidina ou estreptavidina imobilizada sobre suporte sólido. Preferencialmente o anticorpo traçador é conjugado a digoxigenina e ligação à etiqueta detectável é realizada através de um anticorpo contra digoxigeni- na. O anticorpo de captura é em outra modalidade conjugado ao suporte sólido por adsorção passiva. Um anticorpo conjugado ao suporte sólido por adsorção passiva compreende uma mistura de anticorpos conjugados ao suporte sólido através de diferentes sítios de anticorpos. Portanto, o anticor- po de captura conjugado ao suporte sólido por adsorção passiva é uma mis- tura de dois ou mais conjugados diferentes em que os conjugados diferem nos sítios de anticorpo, isto é, os resíduos de anticorpo, com os quais a con- jugação ao suporte sólido é efetuada. Adsorção passiva é descrita, por e- xemplo, por Butler, J.E., em "Solid Phases in Immunoassay", page 205-225; Diamandis, E.P. e Christopoulos, T.K. (Editors): Immunoassays (1996), Aca- demic Press, San Diego.
Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo de captura é imobilizado através de um par de ligação específica. Um par de ligação semelhante (primeiro componente/segundo componente) é, por e- xemplo, estreptavidina ou avidina/biotina, anticorpo/antígeno (vide, por e- xemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugated Techniques1 Academic Press, 1996), lectina/polissaccarídeo, esteróide/proteína de ligação de este- róides, hormônio/receptor hormonal, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G e/ou L, etc. Preferencialmente, o anticorpo parental de captura é conjuga- do a biotina e é realizada imobilização através de avidina ou estreptavidina imobilizada. Em uma outra modalidade preferencial da invenção, o anticorpo traçador é conjugado a uma etiqueta detectável, preferencialmente conjuga- do através de um par de ligação específica. Um par de ligação semelhante (primeiro componente/segundo componente) é, por exemplo, Estreptavidina ou Avidina/biotina, anticorpo/antígeno, lectina/polissacarídeo, esterói- de/proteína de ligação de esteróides, hormônio/receptor hormonal, enzi- ma/substrato, IgG/Proteína A e/ou G e/ou L, etc. Preferencialmente, o anti- corpo traçador parental é conjugado através de digoxigenina e um anticorpo contra digoxigenina à etiqueta detectável. Alternativamente o anticorpo tra- çador parental é conjugado à etiqueta eletroquimiluminescente, como um complexo de bispiridil rutênio.
Se o conjugado de acordo com a invenção for usado como um padrão em um imunoensaio para a determinação de um anticorpo anti- idiotipo contra um anticorpo parental em uma amostra de um ser humano é preferencialmente usado em duas ou mais concentrações diferentes. Com as respostas determinadas para as diferentes concentrações do padrão é/pode ser calculada uma curva de calibração.
Se o conjugado de acordo com a invenção for usado como um
padrão em um imunoensaio para a determinação de um anticorpo anti- idiotipo contra um anticorpo parental em uma amostra de um ser humano pode ser empregado um anticorpo adicional (opcional) ligando especifica- mente a referida imunoglobulina de referência do referido conjugado. O con- jugado de acordo com a invenção pode ser usado como um padrão sozinho ou em combinação com o anticorpo anti-imunoglobulina humana adicional opcional (figuras 3 e 4).
O termo "padrão" ou "substância padrão" os quais podem ser usados de modo intercambiável dentro deste requerimento denotam um pon- to de referência para um método analítico e são usados para determinar um valor contra o qual outros resultados do mesmo método analítico são compa- rados. O termo "controle positivo" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, denota uma substância padrão com a qual, caso empregada em um método analítico, será obtida uma resposta acima de um valor de corte ou limiar definido. O valor de corte é em geral o valor médio obtido na análi- se de amostras não contendo anticorpos antifármaco mais duas vezes, pre- ferencialmente três vezes, o desvio padrão dos valores obtidos.
A invenção adicionalmente compreende um método para o uso de um conjugado de acordo com a invenção como um padrão em um imu- noensaio compreendendo as seguintes etapas a) contactar o conjugado de acordo com a invenção com um anticorpo de captura, b) detectar a ligação do referido conjugado ao referido anticorpo de captura. A detecção da liga- ção na etapa a) pode ser realizada quer diretamente, por exemplo, através de uma alteração no espírito do SPR, ou indiretamente, por exemplo, atra- vés de um anticorpo traçador e/ou uma etiqueta detectável.
A invenção adicionalmente compreende um método para a de- terminação se um antifármaco anticorpo está ligando à região Fc ou à região Fab de um anticorpo parental e cuja classe de imunoglobulina o referido an- ticorpo antifármaco tem (vide, por exemplo, a figura 7). Neste método a liga- ção de uma amostra é determinada com anticorpo parental imobilizado, re- gião Fc imobilizada do referido anticorpo parental, e/ou região Fab imobiliza- da do referido anticorpo parental. Isto pode ser realizado, por exemplo, sobre um chip BIAcore1 no qual um dos quatro canais contém o anticorpo parental imobilizado, um contém a região Fc imobilizada do anticorpo parental, um contém a região Fab imobilizada do anticorpo parental, e um não contém anticorpo parental imobilizado. Dependendo de quais canais e portanto quais parte(s) do anticorpo parental apresentam ligação de um anticorpo antifár- maco da amostra pode ser determinada a região de ligação de um anticorpo antifármaco. A classe de imunoglobulina é determinada por ligação de anti- corpo anti-imunoglobulina E humana, anticorpo antiimunoglobulina M huma- na, anticorpo anti-imunoglobulina G humana, ou anticorpo anti- imunoglobulina A humana. Os anticorpos anti-imunoglobulina humana são ou usados seqüencialmente ou concomitantemente, preferencialmente se- qüencialmente. O conjugado de acordo com a invenção pode ser usado co- mo um padrão neste método.
A invenção adicionalmente compreende um método para a de- terminação da classe de imunoglobulina de um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente uma região de CDR de um anticorpo parental em uma a- mostra usando um imunoensaio sanduíche compreendendo um anticorpo de captura, um anticorpo traçador, e um conjugado de acordo com a invenção, compreendendo as seguintes etapas: a) contactar a referida amostra com o anticorpo de captura sob condições adequadas para a formação de um complexo de anticorpo de captu- ra/anticorpo anti-idiotipo, b) contactar separadamente
i) um anticorpo anti-imunoglobulina A humana,
ü) um anticorpo anti-imunoglobulina E humana,
πι) um anticorpo anti-imunoglobulina M humana, e
iv) um anticorpo anti-imunoglobulina G humana como anticorpos traçadores com o referido complexo de anticorpo de captu- ra/anticorpo anti-idiotipo,
c) determinar a ligação de cada um dos referidos anticorpos traçadores ao referido complexo e deste modo determinar a classe de imunoglobulina do referido anticorpo anti-idiotipo,
em que um conjugado de acordo com a invenção é usado como um controle positivo.
Um esquema deste método e um diagrama de resposta exem- plar são dados nas figuras 1 e 2. Preferencialmente os referidos anticorpos traçadores são con-
tactados na ordeem i) anticorpo anti-imunoglobulina A humana, ii) anticorpo anti-imunoglobulina E humana, iii) anticorpo anti-imunoglobulina M humana, e iv) anticorpo anti-imunoglobulina G humana com o referido complexo de anticorpo de captura/anticorpo anti-idiotipo, isto é, os anticorpos traçadores são contactados seqüencialmente.
Preferencialmente o referido anticorpo de captura é selecionado entre o grupo compreendendo a cadeia leve, a região variável da cadeia pe- sada, um fragmento Fab1 Fab', F(ab)2, ou F(ab')2 do referido anticorpo pa- rental.
A invenção adicionalmente compreende um anticorpo policlonal
ligando especificamente uma região de CDR de um anticorpo anti-IL-6R. Um método para a preparação de um anticorpo policlonal de acordo com a in- venção é descrito no Exemplo Ia).
Preferencialmente o método para a determinação da classe de imunoglobulina de um anticorpo anti-idiotipo de acordo com a invenção compreende as seguintes etapas:
a) contactar a referida amostra com o anticorpo de captura sob condições adequadas para a formação de um complexo de anticorpo de captu- ra/anticorpo anti-idiotipo, b) contactar um anticorpo traçador selecionado entre o grupo de anticor- pos traçadores compreendendo anticorpo anti-imunoglobulina G humana, anticorpo anti-imunoglobulina E humana, anticorpo anti-imunoglobulina M humana, anticorpo anti-imunoglobulina A humana com o referido complexo de anticorpo de captura/anticorpo anti-idiotipo,
c) determinar a ligação do referido anticorpo traçador ao referido comple- xo,
d) desintegrar o referido complexo de anticorpo de captura/anticorpo anti- idiotipo,
e) repetir as etapas a) a d) com um anticorpo traçador não previamente selecionado,
f) determinar a classe de imunoglobulina do referido anticorpo anti- idiotípico para ser a imunoglobulina do referido anticorpo traçador ligando
especificamente o referido complexo de anticorpo de captura/anticorpo anti- idiotipo.
O anticorpo traçador é preferencialmente selecionado entre anti- corpos anti-imunoglobulina G humana, ou anticorpos anti-imunoglobulina E humana, ou anticorpos anti-imunoglobulina M humana, ou anticorpos anti- imunoglobulina A humana.
O termo "sob condições adequadas para a formação de um complexo [...]" e equivalentes gramaticais dos mesmos conforme usado den- tro deste requerimento denota condições nas quais um anticor- po/imunoglobulina de interesse, por exemplo, um anticorpo anti-idiotipo, liga a um segundo anticorpo quando trazido em contato com este. Isto não deno- ta necessariamente que 100% do anticorpo de interesse é ligado mas es- sencialmente 100% do anticorpo de interesse é ligado, isto é, no mínimo 85% do anticorpo de interesse é ligado, preferencialmente no mínimo 90% do anticorpo de interesse é ligado, preferencialmente no mínimo 95% do an- ticorpo de interesse é ligado, mais preferencialmente mais de 95% do anti- corpo de interesse é ligado ao segundo anticorpo.
Os exemplos e figuras seguintes são proporcionados para auxi- liar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiro âmbito é determi- nado nas reivindicações anexadas. É entendido que podem ser feitas modi- ficações nos procedimentos determinados sem se afastar do espírito da in- venção. Descrição das figuras
Figura 1 - Esquema para a detecção de anticorpos antianticorpo parental em uma amostra com determinação da subclasse subsequente op- cional.
Figura 2 - Diagrama BIAcore SPR para a determinação da sub-
classe de um anticorpo antiiidiotipo de acordo com a invenção. (1) Injeção de amostra, (2) + (3) injeção de anticorpo anti-imunoglobulina E humana, (4) injeção de anticorpo anti-imunoglobulina G humana.
Figura 3 - Esquema para o uso de um conjugado de acordo com a invenção como um padrão com um anticorpo específico de classe opcio- nal.
Figura 4 - Diagrama BIAcore SPR para o uso de um composto de acordo com a invenção como padrão (primeira resposta) com um anticor- po anti-subclasse de imunoglobulina padrão subsequente opcional (segunda resposta).
Figura 5 - Esquema de uma determinação por ELISA de um an- ticorpo anti-idiotípico.
Figura 6 - Curva padrão de uma ELISA para a determinação de
anticorpo anti-idiotípico. Figura 7 - Esquema de uma detecção de múltiplo canal da regi-
ão de ligação de um anticorpo antianticorpo parental com determinação da classe de imunoglobulina subsequente.
O uso de um anticorpo contra o receptor de IL-6 nos seguintes exemplos é somente para exemplificar a invenção e não significa limitar o âmbito da invenção. Exemplo 1
Preparação de uma composição de um anticorpo policlonal anti- idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo pa- rental e uma imunoglobulina sérica humana policlonal de classe E, G, A, e M.
Anticorpos policlonais antianticorpo anti-IL-6R (pAb anti-mAb
anti-IL-6R) i) Preparação de anticorpos policlonais contra anticorpo anti-IL-6R monoclo- nal
Purificação de anticorpos policlonais de soro de coelho
Coelhos foram imunizados com anticorpo anti-IL-6R monoclonal de acordo com métodos de rotina. No soro bruto de cinco coelhos imuniza- dos os componentes lipídicos foram removidos por deslipidação com Aerosil (1,5 % (em peso/vol)) e as imunoglobulinas foram precipitadas com sulfato de amônio (1,7 M). Depois de tratamento ácido (30 min., pH 5,5) e diálise contra 15 mM de tampão de fosfato de potássio, suplementado com 50 mM de NaC1, pH 7,0, a mistura foi separada por cromatografia de permuta iônica DEAE em pH 7,0. A fração de imunoglobulina G estava no fluxo direto (= pAb anti-mAb anti-IL-6R de coelho) e foi concentrada até cerca de 25 mg/ml. Preparação de anticorpos anti-mAb anti-lL-6R de coelho ligando especifica- mente uma região de CDR do anticorpo parental contra IL-6R A fração de IgG concentrada da etapa anterior foi transferida
para um sistema tampão com 50 mM de fosfato de potássio, suplementado com 150 mM de NaC1, pH 7,5 (PBS). O imunossorvente com anticorpo anti- IL-6R imobilizado (anticorpo parental), preparado por conjugação de anticor- po anti-IL-6R a NHS-sepharose por meio de técnicas do estado da arte, foi acondicionado em uma coluna e equilibrado com 50 mM de tampão de fosfa- to de potássio, suplementado com 150 mM de NaC1, pH 7,5.
mg da fração de imunoglobulina G concentrada/ml de imu- nossorvente foram aplicados à coluna equilibrada com PBS. A coluna foi lavada sucessivamente com PBS, 0,5 M de NaC1 suplementado com 0,05 % (em peso/ vol) de Tween® 20, e 30 mM de NaCI. A IgG ligada especifica- mente ao imunossorvente foi elutriada com 3 mM de HC1 e 1 M de ácido propiônico. O elutriado foi dialisado contra PBS.
Para eliminar anticorpos com reatividade cruzada para a região constante da imunoglobulina G humana (IgG) os anticorpos purificados por afinidade foram aplicados a uma coluna de afinidade com IgG humana imo- bilizada, preparada por conjugação de IgG humana inespecífica a NHS- sepharose por meio de técnicas do estado da arte. A coluna foi equilibrada com PBS. Cerca de 6 mg de IgG/ml de imunossorvente foram aplicados à coluna. A fração de IgG policlonal específica desejada está no fluxo direto. Depois de regeneração da coluna com 0,5 M de NaC1 suplementado com 0,05 % (em peso/ vol) de Tween® 20, 30 mM de NaCI1 1 M de ácido propiô- nico, e PBS. A imunossorção de anticorpos não ligando especificamente à região constante da IgG humana foi repetida duas vezes para eliminar com- pletamente anticorpos com reatividade cruzada contra IgG humana.
O anticorpo antianticorpo anti-IL-6R policlonal purificado resul- tante sem reatividade cruzada para região constante da IgG humana foi con- centrado até cerca de 4 mg/ml e armazenado a -80°C.
ii) Conjugação do anticorpo antianticorpo anti-IL-6R policlonal a imunoglobu- Iina E humana policlonal, imunoglobulina G humana, imunoglobulina A hu- mana, e imunoglobulina M humana
Preparação de um conjugado de anticorpo antianticorpo anti-lL-6R policlonal de coelho (aa-IL-6R pAb) com imunoglobulina G humana Etapa 1: Preparação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho
O aa-IL-6R pAb foi dialisado contra 100 mM de tampão de fosfa- to de potássio, contendo 150 mM de NaCI, pH 7,8, e a solução de proteína foi ajustada para uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml. N- succinimidil-3-acetiltiopropionato (SATP) foi dissolvido em DMSO e adicio- nado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:5 (aa-IL-6R pAb:SATP). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina em uma concen- tração final de 10 mM e o excesso de SATP foi removido por diálise contra 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1.
Etapa 2: Preparação de imunoglobulina G policlonal humana-MH humana
O anticorpo policlonal humano foi dialisado contra 30 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,4, e a solução de proteína foi depois disso ajustada para uma concentração de proteína de cerca de 25 mg/ml. Éster de maleimidohexanoil-N-hidroxissuccinimida (MHS) foi dissolvido em DMSO e adicionado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:6 (lgG:MHS). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada 60 min a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina para uma concen- tração final de 10 mM, o pH foi ajustado para pH 6,2, e o excesso de MHS foi removido por diálise contra 10 mM de tampão de fosfato de potássio, con- tendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1.
Etapa 3: Conjugação de aa-IL-6R pAb-SATP com imunoglobulina G policlo- nal humana-MH
aa-IL-6R pAb-SATP foi desacetilado para aa-IL-6R pAb-SH por incubação com 2 % (v/v) de 1 M de hidroxilamina, pH 7,5, e incubado por 45 min. a 25°C. O anticorpo desacetilado foi misturado com imunoglobulina G policlonal humana-MH (proporção molar de lgG-SH:lgG-MH = 1:3) e diluído com 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1, para uma concentração final de 1,5 mg/ml sw aa-IL- 6R pAb-SH e 4,5 mg/ml de imunoglobulina G policlonal humana-MH. O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada a 25°C. O processo de con- jugação foi analisado com uma coluna de filtração por gel analítica (por e- xemplo, TSK 3000). A conjugação foi niterrompida geralmente depois de 45 min. pela adição de cisteína para uma concentração final de 1 mM. Depois de um tempo de incubação adicional de 30 min. N-metilmaleimida (NMM) foi adicionada para uma concentração final de 5 mM e o pH foi ajustado para pH 7,5. Depois de 60 min. de incubação a 25°C o conjugado foi purificado por cromatografia por filtração por gel S300 para eliminar anticorpos não conjugados.
Preparação de um conjugado de aa-IL-6R pAb de coelho com imunoglobuli- na humana M
Etapa 1: Preparação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho
O aa-IL-6R pAb foi dialisado contra 100 mM de tampão de fosfa- to de potássio, contendo 150 mM de NaCI, pH 7,8, e a solução de proteína foi ajustada para uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml. N- succinimidil-3-acetiltiopropionato (SATP) foi dissolvido em DMSO e adicio- nado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:5 (aa-IL-6R pAb:SATP). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina em uma concen- tração final de 10 mM e o excesso de SATP foi removido por diálise contra mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1.
Etapa 2: Preparação de imunoglobulina M policlonal humana-MH
O anticorpo policlonal humano foi dialisado contra 30 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,4, e a solução de proteína obtida foi ajustada depois disso para uma concentração de proteína de cerca de 20 mg/ml. Éster de maleimidohexanoil- N-hidroxissuccinimida (MHS) foi dissol- vido em DMSO e adicionado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:50 (lgM:MHS). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incu- bada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina para uma concentração final de 10 mM. O pH foi ajustado para pH 6,2 e o exces- so de MHS foi removido por diálise contra 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1. Etapa 3: Conjugação de aa-IL-6R pAb-SATP com imunoglobulina M policlo- nal humana-MH
aa-IL-6R pAb-SATP foi desacetilado para aa-IL-6R pAb-SH por incubação com 2 % (v/v) de 1 M de hidroxilamina, pH 7,5, e incubado por 45 min. a 25°C. O anticorpo desacetilado foi misturado com imunoglobulina M policlonal humana-MH (proporção molar de aa-IL-6R pAb-SH:lgM-MH = 1:2) e diluído com 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1, para uma concentração final de cerca de 0,9 mg/ml de aa-IL-6R pAb-SH e 9,1 mg/ml de imunoglobulina M policlonal humana-MH. O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada a 25°C. O processo de conjugação foi monitorado com uma coluna de filtração por gel analítica (por exemplo, TSK 5000). A reação de conjugação foi interrom- pida geralmente depois de 60 min. adicionando cisteína para uma concen- tração final de 1 mM. Depois de um tempo de incubação adicional de 30 min. N-metilmaleimida (NMM) foi adicionada para uma concentração final de 5 mM e o pH foi ajustado para pH 7,5. Depois de 60 min. de incubação a 25°C o conjugado foi purificado por cromatografia por filtração por gel S400 para eliminar anticorpos não conjugados.
Preparação de um conjugado de aa-lL-6R pAb de coelho com imunoqlobuli- na E policlonal humana
Etapa 1: Preparação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho O aa-IL-6R pAb foi dialisado contra 100 mM de tampão de fosfa-
to de potássio, contendo 150 mM de NaCI, pH 7,8, e a solução de proteína foi ajustada para uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml. N- succinimidil-3-acetiltiopropionato (SATP) foi dissolvido em DMSO e adicio- nado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:5 (aa-IL-6R pAb:SATP). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina em uma concen- tração final de 10 mM e o excesso de SATP foi removido por diálise contra mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1. Etapa 2: Preparação de imunoglobulina E policlonal humana-MH
O anticorpo policlonal humano foi dialisado contra 30 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,4, e a solução de proteína obtida foi ajustada para uma concentração de proteína final de cerca de 13 mg/ml. Es- ter de maleimidohexanoil-N-hidroxissuccinimida (MHS) foi dissolvido em DMSO e adicionado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:6 (lgE:MHS). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina para uma con- centração final de 10 mM, o pH foi ajustado para pH 6,2 e o excesso de MHS foi removido por diálise contra 10 mM de tampão de fosfato de potás- sio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1.
Etapa 3: Conjugação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho com imunoglobulina E policlonal humana-MH
aa-IL-6R pAb-SATP foi desacetilado para aa-IL-6R pAb-SH por incubação com 2 % (v/v) de 1 M de hidroxilamina, pH 7,5, e incubado por 45 min. a 25°C. O anticorpo desacetilado foi misturado com imunoglobulina E policlonal humana-MH (proporção molar de aa-IL-6R pAb-SH:lgE-MH = 1:1,7) e diluído com 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI1 1 mM de EDTA, pH 6,1, para uma concentração de 2,9 mg/ml de aa-IL-6R pAb-SH e 6,3 mg/ml de imunoglobulina E policlonal humana- MH. O pH foi ajustado para 7,1 e a mistura foi incubada a 25°C. O processo de conjugação foi monitorado com uma coluna de filtração por gel analítica (por exemplo, TSK 4000). O processo de conjugação foi interrompido geral- mente depois de 90 min. adicionando cisteína para uma concentração final de 1 mM. Depois de um tempo de incubação adicional de 30 min. N- metilmaleimida (NMM) foi adicionada para uma concentração final de 5 mM e o pH foi ajustado para pH 7,5. Depois de 60 min. de incubação a 25°C o conjugado foi purificado por cromatografia por filtração por gel S300 para eliminar anticorpos não conjugados.
Preparação de um conjugado de aa-IL-6R pAb de coelho com imunoglobuli- na A policlonal humana
Etapa 1: Preparação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho O aa-IL-6R pAb foi dialisado contra 100 mM de tampão de fosfa-
to de potássio, contendo 150 mM de NaCI, pH 7,8, e a solução de proteína foi ajustada para uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml. N- succinimidil-3-acetiltiopropionato (SATP) foi dissolvido em DMSO e adicio- nado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:5 (aa-IL-6R pAb:SATP). O pH foi ajustado para pH 7,1 e a mistura foi incubada por 60 min. a 25°C. A reação foi interrompida adicionando L-Iisina em uma concen- tração final de 10 mM e o excesso de SATP foi removido por diálise contra mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1. Etapa 2: Preparação de imunoglobulina A policlonal humana-MH
O anticorpo policlonal humano é dialisado contra 30 mM de tam- pão de fosfato de potássio, pH 7,4, e a solução de proteína obtida é ajustada para uma concentração final de proteína de cerca de 13 mg/ml. Éster de ma- leimidohexanoil-N-hidroxissuccinimida (MHS) é dissolvido em DMSO e adi- cionado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:6 (lgA:MHS). O pH é ajustado para pH 7,1 e a mistura é incubada por 60 min. a 25°C. A reação é interrompida adicionando L-Iisina para uma concentração final de mM, o pH é ajustado para pH 6,2 e o excesso de MHS é removido por diálise contra 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1.
Etapa 3: Conjugação de aa-IL-6R pAb-SATP de coelho com imunoglobulina A policlonal humana-MH
aa-IL-6R pAb-SATP foi desacetilado para aa-IL-6R pAb-SH por incubação com 2 % (v/v) de 1 M de hidroxilamina, pH 7,5, e incubado por 45 min. a 25°C. O anticorpo desacetilado é misturado com imunoglobulina A policlonal humana-MH (proporção molar de aa-IL-6R pAb-SH:lgA-MH = 1:2) e diluído com 10 mM de tampão de fosfato de potássio, contendo 200 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, pH 6,1, para uma concentração de 2,9 mg/ml de aa-IL-6R pAb-SH e 6,3 mg/ml de imunoglobulina A policlonal humana-MH. O pH é ajustado para 7,1 e a mistura é incubada a 25°C. O processo de conju- gação é monitorado com uma coluna de filtração por gel analítica (por e- xemplo, TSK 4000). O processo de conjugação é interrompido geralmente depois de 90 min. adicionando cisteína para uma concentração final de 1 mM. Depois de um tempo de incubação adicional de 30 min. N- metilmaleimida (NMM) é adicionada para uma concentração final de 5 mM e o pH é ajustado para pH 7,5. Depois de 60 min. de incubação a 25°C o con- jugado é purificado por cromatografia por filtração por gel S300 para eliminar anticorpos não conjugados. Exemplo 2
Ligação de anticorpos anti-IL-6R biotinilados a um chip revestido com Es- treptavidina
O anticorpo anti-IL-6R foi dialisado contra tampão (100 mM de
tampão de fosfato de potássio, pH 8,5). Depois disso a solução foi ajustada para uma concentração de proteína de 10 mg/ml. Éster N- hidroxissuccinimida de ácido D-biotinoil-aminocapróico foi dissolvido em DMSO e adicionado à solução de anticorpos em uma proporção molar de 1:5. Depois de 60 minutos a reação foi interrompida adicionando L-lisina. O excesso do reagente de marcação foi removido por diálise contra 25 mM de tampão de fosfato de potássio suplementado com 150 mM de cloreto de só- dio, pH 7,5.
A superfície de uma célula de fluxo de um chip CM5 foi ativada com uma mistura NHS-EDC na primeira etapa. Depois de ativação da super- fície, uma solução de Neutravidin a 100 mg/ml (diluída em tampão com pH 4,5; Pierce) foi injetada para permitir a formação de ligações covalentes aos ésteres da superfície ativada. Depois disso foi obtida inativação de ésteres não ligados residuais através de injeção de 1 M de etanolamina. Anticorpo biotinilado foi injetado sobre uma única célula de fluxo com um fluxo de 20 μ l/min e uma concentração de 20 pg/ml por 5 minutos. Isto levou à !mobiliza- ção do anticorpo à célula de fluxo. Exemplo 3
Detecção de anticorpos antianticorpo anti-IL-6R da classe de IgG em soro humano
A amostra foi diluída entre 1:10 a 1:100 e injetada em volumes de 20 μΙ em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min sobre um chip conforme prepa- rado no Exemplo 2. Depois de injeção da amostra, o anticorpo mAb anti classe IgG anticorpo anti-imunoglobulina G humana foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de 20 pg/ml. Finalmente, foi reali- zada uma injeção de solução de regeneração (100 mM de H3PO4). Uma amostra padrão foi medida no início de cada medição. 20 μΙ de um conjuga- do de anticorpo antianticorpo anti-IL-6R policlonal de coelho (aa-IL-6R pAb) com IgG humana como padrão positivo foi injetado sobre um chip de imuno- genicidade, com um anticorpo completo imobilizado, fragmento F(ab')2, e/ou fragmento Fc de anticorpo anti-IL6R em uma taxa de fluxo de 20 pl/min. De- pois de injeção de padrão, opcionalmente o anticorpo mAb anti classe de Ig anticorpo anti-imunoglobulina G humana foi injetado na mesma taxa de flu- xo.
Exemplo 4
Detecção de anticorpos antianticorpo anti-IL-6R da classe de IgE em soro humano
A amostra foi diluída entre 1:10 a 1:100 e injetada em volumes de 20 μΙ em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min sobre um chip conforme prepa- rado no Exemplo 2. Depois de injeção da amostra, o anticorpo mAb anti classe de IgE anticorpo anti-imunoglobulina E humana foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de 20 pg/ml. Finalmente, foi realizada uma injeção de solução de regeneração (100 mM de H3PO4). Uma amostra padrão foi medida no início de cada medição. 20 μΙ de um conjuga- do de aa-IL-6R pAb de coelho com IgE humana como padrão positivo foi injetada sobre o chip de imunogenicidade, com um anticorpo completo imo- bilizado,fragmento F(ab')2, e/ou fragmento Fc de anticorpo anti-IL-6R em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Depois de injeção de padrão, opcionalmente o anticorpo mAb anti classe de IgE anticorpo anti-imunoglobulina E humana foi injetado na mesma taxa de fluxo. Exemplo 5
Detecção de anticorpos antianticorpo anti-IL-6R da classe de IgM em soro humano
A amostra foi diluída entre 1:10 a 1:100 e injetada em volumes
de 20 μΙ em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min sobre um chip conforme prepa- rado no Exemplo 2. Depois de injeção da amostra, o anticorpo mAb anti classe de IgM anti-imunoglobulina humana M foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de 20 μςΛηΙ. Finalmente, foi realizada uma injeção de solução de regeneração (100 mM de H3PO4). Uma amostra padrão foi medida no início de cada medição. 20 μΙ de um conjugado de aa- IL-6R pAb de coelho com IgM humana como padrão positivo foi injetado so- bre um chip de imunogenicidade, com um anticorpo completo imobilizado, fragmento F(ab')2, e/ou fragmento Fc de anticorpo anti-IL-6R em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min. Depois de injeção de padrão, opcionalmente o anti- corpo mAb anti classe de IgM anticorpo anti-imunoglobulina M humana foi injetado na mesma taxa de fluxo. Exemplo 6
Detecção de anticorpos antianticorpo anti-IL-6R da classe de IgE, IgG, e IgM em soro humano
A amostra foi diluída entre 1:10 a 1:100 e injetada em volumes de 20 μΙ em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min sobre um chip conforme prepa- rado no Exemplo 2. Depois de injeção da amostra, o anticorpo mAb anti classe de IgE anti-imunoglobulina E humana foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de 20 Mg/ml. Depois da injeção a re- ação foi registrada. Depois disso o anticorpo mAb anti classe de IgM anti- imunoglobulina M humana foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de 20 pg/ml. Depois da injeção a reação foi registrada. Depois disso o anticorpo mAb anti classe de IgG anti-imunoglobulina G hu- mana foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min e uma concentração de Mg/ml. Depois da injeção a reação foi registrada. Finalmente, foi realizada uma injeção de solução de regeneração (100 mM de H3PO4). As três amos- tras padrão descritas (conjugados) foram medidas no início de cada medi- ção. Padrão 1: 20 μΙ de um conjugado de aa-IL-6R pAb de coelho com IgM humana como padrão positivo foi injetado sobre um chip de imunogenicida- de; Padrão 2: 20 μΙ de um conjugado de aa-IL-6R pAb de coelho com IgE humana como padrão positivo foi injetado sobre um chip de imunogenicida- de; Padrão 3: 20 μΙ de um conjugado de aa-IL-6R pAb de coelho com IgG humana como padrão positivo foi injetado sobre um chip de imunogenicida- de.
Exemplo 7
Determinação por ELISA de anticorpos antiparental da classe de IgE usando um conjugado padrão
Na primeira etapa anticorpo biotinilado conta o receptor de IL-6 (anticorpo parental) foi ligado sobre a superfície nas cavidades de uma lâmi- na de microtítulo revestida com Estreptavidina (SA-MTP). Anticorpo não Ii- gado foi removido por lavagem com tampão universal. Depois disso as a- mostrsa e os padrões de referência (anticorpo de coelho contra anticorpo anti-receptor de IL-6 conjugado a IgE humana policlonal) foram adicionadas a diferentes cavidades e incubadas. Anticorpo antiparental da amostra e o padrão de referência, respectivamente, liga ao anticorpo parental imobiliza- do. Depois de uma etapa de lavagem o anticorpo antiparental ligado e o pa- drão de referência, respectivamente, foram detectados com anticorpo digo- xigenilado contra IgE humana seguida por incubação com um anticorpo anti- digoxigenina marcado com peroxidase de raiz-forte. O conjugado de anticor- po-enzima catalisa a reação de cor de substrato de ABTS®. O sinal é medi- do por leitora de ELISA em comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm). Os valores de absorvência de cada amostra sérica são determinados em triplicatas. Um sinal positivo foi obtido para o padrão e também para a amostra no caso do anticorpo antiparental ser da subclasse IgE (figuras 5 e 6).

Claims (7)

1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente a uma região de CDR de um anticorpo monoclonal, terapêutico e uma imunoglobulina de referência de uma única classe de imunoglobulina, em que a referida imunoglobulina de referência é uma imunoglobulina humana ou uma região Fc de uma imunoglobulina humana.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida imunoglobulina de referência não está ligando especificamente o referido anticorpo anti-idiotipo e não ligando especificamente o referido anticorpo terapêutico.
3. Uso de um conjugado, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser como um padrão ou controle positivo em um imunoensaio para a determinação de um anticorpo antianticorpo parental em uma amostra.
4. Uso de um conjugado acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido imunoensaio é um imunoensaio sanduíche compreendendo um anticorpo de captura e um anticorpo traçador em que o anticorpo de captura ou traçador é o referido anticorpo parental.
5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo antianticorpo parental é um anticorpo anti- idiotipo contra o referido anticorpo parental.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo de captura é selecionado dentre o grupo compreendendo a cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, um fragmento Fab, Fab', F(ab)2, ou F(ab')2 do referido anticorpo parental.
7. Método para a determinação da classe de imunoglobulinas de um anticorpo anti-idiotipo ligando especificamente uma região de CDR de um anticorpo parental em uma amostra usando um imunoensaio sanduíche compreendendo um anticorpo de captura e um anticorpo traçador e um conjugado de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) contatar a referida amostra com o anticorpo de captura sob condições adequadas para a formação de um complexo de um anticorpo de captura/anticorpo anti-idiotipo, b) contatar separadamente i) um anticorpo anti-imunoglobulina A humana, ii) um anticorpo anti-imunoglobulina E humana, iii) um anticorpo anti-imunoglobulina M humana, e iv) um anticorpo anti-imunoglobulina G humana, como anticorpos traçadores com o referido complexo de um anticorpo de captura/anticorpo anti-idiotipo, c) determinar a ligação dos referidos anticorpos traçadores ao referido complexo e deste modo determinando a classe de imunoglobulina do referido anticorpo anti-idiotipo, em que um conjugado, como definido na reivindicação 1, é usado como um controle positivo.
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