CN109946464A - 检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板、试剂盒以及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板、试剂盒以及制备方法，涉及甲型肝炎病毒检测技术领域。本发明提供了的酶标板的制备方法包括：包被步骤、封闭步骤和干燥步骤，并通过对试剂浓度和各步骤参数的优化，使得采用上该方法制备的酶标板可以用于甲型肝炎病毒IgM抗体的检测，具有较好的特异性和灵敏度，灵敏度达95.4％，特异性达98.9％。

Description

检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板、试剂盒以及制备方法

技术领域

本发明涉及甲型肝炎病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板、试剂盒以及制备方法。

背景技术

甲型病毒性肝炎：简称甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，以肝脏炎症病变为主的传染病，主要通过粪-口途径传播，临床上以疲乏，食欲减退，肝肿大，肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎，无症状感染者常见。任何年龄均可患本病，但主要为儿童和青少年。成人甲肝的临床症状一般较儿童为重。冬春季节常是甲肝发病的高峰期。本病病程呈自限性，无慢性化，引起急性重型肝炎者极为少见，随着灭活疫苗在全世界的使用，甲型肝炎的流行已得到有效的控制。

甲型肝炎病毒：HAV是小核糖核酸病毒科的一员，为嗜肝RNA病毒属。HAV经口进入体内后，经肠道进入血流，引起病毒血症，约过一周后到达肝脏，随后通过胆汁排入肠道并出现粪便中。粪便排毒能维持1-2周。病毒侵犯的主要器官是肝脏，咽部和扁桃体可能是HAV肝外繁殖的部位。HAV引起肝细胞损伤的机制尚未明确，一般认为HAV不直接引起肝细胞病变，肝脏损害是HAV感染肝细胞的免疫病理反应所引起的。

甲型肝炎传染源：甲型肝炎患者和无症状感染者为传染源，甲型肝炎患者仅从粪便中排出病原体，血液中HAV主要出现在黄疸发生前14～21天，在此期患者的血液有传染性，有报道通过输血传播，但黄疸发生后患者血液通常无传染性。患者在起病前2周和起病后1周从粪便中排出HAV的数量最多，此时传染性最强。但至起病后30天仍有少部分患者从粪便中排出HAV。

甲型肝炎传播途径：甲型肝炎以粪口途径为主要传播途径，粪口传播的方式是多样的，一般情况下，日常生活接触传播是散发性发病的主要传播方式，因此在集体单位如托幼机构，学校和部队中甲型肝炎发病率高。水和食物的传播，特别是水生贝类如毛蚶等是甲型肝炎爆发流行的主要传播方式。

甲型肝炎易感性与免疫力：人群未注射甲肝疫苗者对HAV普遍易感，患过甲型肝炎或感染过甲型肝炎病毒的人可以获得持久的免疫力。

甲型肝炎实验室诊断方法：实验室检测方法主要有病毒分离、免疫学检测、核酸检测等。病毒分离培养方法操作复杂，免疫学检测常用ELISA、胶体金、化学发光法，核酸检测常用荧光定量PCR法。

ELISA实验技术：ELSIA在临床诊断、食品安全、科学研究等领域都有着广泛的应用。它可以简单快捷低成本地进行抗原抗体的定性或定量检测，高等生物的IgG、IgM、IgA、IgE等抗体都可以采用该方法检测，各种天然和人工制备的抗原可以采用该方法准确测定。抗原抗体的特异性结合反应保证了该方法实验结果的准确性和可靠性。许多商业化的公司早已将其制备成数以万计的各种商品化试剂盒。ELISA试剂盒的组成部分通常包括：酶标板、样品稀释液、酶标试剂、显色剂、终止液。根据试剂盒的设计原理不同，其组成部分略有差异。

ELSIA试剂盒的质量控制：为保证用于体外诊断的ELSIA试剂盒能够做到质量均一，减小不同批次产品制造过程的批间差，试剂盒制造厂家通常设置企业参考品进行监控，使得不同时间段分不同批次制备的同品种试剂盒反应性能指标能够实现标准化，保证实验结果的前后一致性。同时在实验操作过程中，由于人员、设备和场地等因素的影响，同一批次的试剂盒在不同的实验室进行操作可能存在差异，在错误操作的条件下甚至产生完全不同的实验结果，为更好的监控试剂盒使用过程中的随机差错导致的不合格实验，试剂盒一般会配置阴性对照和阳性对照，并且对阴性对照和阳性对照的实验结果数据进行规定，用以减少不同实验条件下的实验误差。阴/阳性对照的质量在试剂盒中的作用也非常关键。

IgM抗体：IgM占血清免疫球蛋白总量的5％～10％，血清浓度约1mg/ml。IgM抗体是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在胚胎发育晚期的胎儿即能产生IgM抗体，故脐带血IgM升高提示胎儿有宫内感染。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的早期标志物，血清中检出IgM阳性提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。

HAV-IgM捕获法检测技术原理：用抗人IgM(抗μ链)预包被酶标板，加入待测样品温育后，样品中的IgM抗体被捕获，通过清洗去除不与抗μ链特异结合的物质，形成“抗μ链-IgM抗体”复合物；再加入HAV抗原和抗HAV-HRP酶标抗体后，形成“抗μ链-IgM抗体-HAV抗原-抗HAV-HRP”复合物；再次洗板清除未结合物质后，加入TMB显色剂，复合物上的HRP酶催化显色剂反应生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色。若待测样品不含HAV-IgM抗体时，则不显色。

而目前检测甲型肝炎病毒的试剂盒的灵敏度和特异性较差。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板的方法，采用该方法制成的酶标板用于检测甲型肝炎病毒IgM抗体时，具有较好的特异性和灵敏度。

本发明的另一目的在于提供一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板，采用该酶标板用于检测甲型肝炎病毒IgM抗体时，具有较好的特异性和灵敏度。

本发明的另一目的在于提供一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，采用该试剂盒用于检测甲型肝炎病毒IgM抗体时，具有较好的特异性和灵敏度。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种制备检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板的方法，其包括如下步骤：

包被步骤：用包被液稀释兔抗人IgM抗体，混匀后，加入酶标板微孔中，于2-8℃条件下，包被12-24小时；

封闭步骤：弃去酶标板微孔中的包被液，加入封闭液，于2-8℃条件下，封闭12-24小时；

干燥步骤：取经封闭步骤后的酶标板，弃去封闭液，置于37-45℃的条件下干燥6-24小时；

其中，包被液为48-52mM的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，该包被液的pH8-10；

封闭液为含1-2％BSA的磷酸盐缓冲液，所述封闭液的pH7.0-8.0。

通过对试剂浓度和各步骤参数的优化，使得采用上述步骤制备的酶标板可以用于甲型肝炎病毒IgM抗体的检测，且其具有较好的特异性和灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，兔抗人IgM抗体的浓度为4-4.2g/L，兔抗人IgM抗体与包被液的体积比为1:(900-1100)。

另一方面，本发明提供了一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板，其根据如上所述的方法制备得到。

另一方面，本发明提供了一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，其含有如上所述的酶标板以及如下组分中的一种或多种的组合：

抗原试剂、酶标抗体试剂、洗涤剂、显色剂、终止液、阳性对照和阴性对照。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗原试剂为甲肝病毒培养物灭活裂解液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，抗原试剂通过如下方法制备：取Tris0.12g、BSA 1.00g、蔗糖2.00g、甘油5.00mL，加入纯化水100mL制备成抗原稀释液，将浓度为4mg/mL的甲肝抗原用上述稀释液稀释成0.4mg/mL的抗原溶液，再加入0.01％(V/V)的防腐剂Proclin-300。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述酶标抗体试剂为HRP酶标记的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，酶标抗体试剂通过如下方法制备：采用改良高碘酸钠将HRP酶与鼠单克隆抗体偶联制备成酶标抗体，再用酶标稀释液1:2500～1:5000倍稀释偶联抗体制备酶标抗体试剂。每1000mL酶标稀释液含以下物料：Na₂HPO₄ 0.53g、NaH₂PO₄ 1.66g、BSA 10g、吐温-20 0.50mL、庆大霉素8000U、小牛血清100mL。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述洗涤剂为含0.05％-1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述显色剂为0.5-50mM过氧化氢脲和0.5-50mM四甲基联苯胺的混合溶液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，显色剂通过如下方法制得：取100mL棕色玻璃试剂瓶，加入过氧化氢脲0.24g，四甲基联苯胺0.21g，Tris 0.15g，EDTA 0.05g用量筒量取DMF 20mL加入其中，密封加热至60℃，震荡使固体溶解后补加纯水80mL，再使用浓盐酸调节pH值至5.0。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述终止液为0.4-0.6M的硫酸。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒的检测样本为人血清、血浆或全血样本。

利用本发明提供的试剂盒可以在90分钟内完成人体血液样本检测IgM抗体的操作。

其检测操作步骤如下：将试剂盒置于室温平衡30分钟。

第一步加样：酶标板孔中每孔加入血清/血浆/全血样本50uL，设置阴/阳性对照各两孔，加入阴性对照/阳性对照各100uL/孔，置于37℃温箱中温育20分钟；

第二步洗板：将20倍浓缩洗液50mL加入950mL纯化水中制备成洗液，用洗液清洗上述酶标板5次，每次酶标板孔中应注满洗液；

第三步加酶和抗原：在清洗后的酶标板孔中各加入甲型肝炎病毒抗原试剂和HRP酶标记抗体试剂各50uL，混匀后，置于37℃温箱中温育30分钟；

第四步洗板：操作同第二步；

第五步加底物：在酶标板中加入显色剂100uL/孔，置于37℃温箱中温育15分钟后，取出加入终止液50uL，用酶标仪在单波长450nm条件下或双波长450/630nm条件下测定吸光度值。阴性对照OD450nm值应小于0.100，阳性对照OD450nm值应大于1.000。待测样本OD值大于0.105时，为甲肝IgM抗体阳性，预示患者可能感染了甲型肝炎病毒。

试剂盒中的阴性对照和阳性对照作为试剂盒内自带的质量控制手段，可以起到监控实验过程是否恰当的作用。阴/阳性对照在实验过程中作为信息已知的模拟样本，参与实验。通常阴/阳性对照采用与实际样本具有相同基质条件的物料配制，测定人血液样本时，通常采用人体来源的血清/血浆样本配制阴/阳性对照。

在现实条件下，由于甲型肝炎病毒流行病学相对稳定，没有普遍流行趋势，只在局部地区偶有爆发流行，阳性样本稀缺。同时人体在感染甲型肝炎病毒后IgM抗体从产生到消失存在时间较短，难以及时取得标本，再加上人体样本的获取受伦理因素的限制，难以大量采集合格的样本作为制造试剂盒阳性对照的原材料。本发明提供了一种替代解决方案，将羊抗兔多克隆抗体与甲型肝炎病毒抗原偶联后形成的“复合物”作为阳性对照，代替实际的阳性样本参与试剂盒反应。加入该阳性对照后，复合物一端的羊抗兔多克隆抗体与酶标板包被的兔抗人IgM抗体结合，另一端的甲肝抗原与HRP酶标记的鼠抗甲肝抗原单克隆抗体结合，最终形成夹心复合物，加入显色剂后呈阳性反应。

且本发明的试剂盒使用偶联的甲肝抗原和羊抗兔抗体替代HAV-IgM阳性样本用于制备试剂盒的阳性对照，解决了规模生产中阳性对照样本难以获取的问题。

采用上述试剂盒用于检测甲型肝炎病毒IgM抗体时，具有较好的特异性和灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例中的ROC曲线；

图2为本发明实验例中的不同稀释倍数的HAV-IgM强阳性血清检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板的制备方法，具体步骤如下：

1.配液：

取1L试剂瓶，加入碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，双蒸水1000mL，溶解混匀，制备成包被缓冲液。

取500mL试剂瓶，加入十二水合磷酸氢二钠25.6g，二水合磷酸二氢钠4.4g，BSA5g，溶解混匀制备成封闭液。

2.包被：取浓度为4.1g/L的兔抗人IgMμ链多克隆抗体，按1:1000倍稀释度用包被液稀释抗体，混匀后，按100uL/孔加液量，加入酶标板微孔中，置于4℃环境中，包被12小时。

3.封闭：取出包被好的酶标板，弃去孔中包被液，加入封闭液200uL/孔。置于4℃环境中，封闭12小时。

4.干燥：取出封闭好的酶标板，弃去封闭液，放置到37℃的干燥箱中干燥6小时。

5.密封：将干燥好的酶标板与干燥剂一起密封到铝箔袋中。

实施例2

本实施例提供了一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，其包括实施例1提供的酶标板以及如下组分中：

抗原试剂、酶标抗体试剂、洗涤剂、显色剂、终止液、阳性对照和阴性对照。

其中，抗原试剂通过如下方法制备：取Tris 0.12g、BSA 1.00g、蔗糖2.00g、甘油5.00mL，加入纯化水100mL制备成抗原稀释液，将浓度为4mg/mL的甲肝抗原用上述稀释液稀释成0.4mg/mL的抗原溶液，再加入0.01％(V/V)的防腐剂Proclin-300。

酶标抗体试剂通过如下方法制备：采用改良高碘酸钠将HRP酶与鼠单克隆抗体偶联制备成酶标抗体，再用酶标稀释液1:2500～1:5000倍稀释偶联抗体制备酶标抗体试剂。每1000mL酶标稀释液含以下物料：Na₂HPO₄ 0.53g、NaH₂PO₄ 1.66g、BSA 10g、吐温-200.50mL、庆大霉素8000U、小牛血清100mL。

显色剂通过如下方法制备：取100mL棕色玻璃试剂瓶，加入过氧化氢脲0.24g，四甲基联苯胺0.21g，Tris 0.15g，EDTA 0.05g用量筒量取DMF 20mL加入其中，密封加热至60℃，震荡使固体溶解后补加纯水80mL，再使用浓盐酸调节pH值至5.0。

终止液通过如下方法制备：取500mL玻璃试剂瓶，加入纯水450mL，再缓慢加入40mL浓硫酸，边搅拌边加入，待溶液放凉后，加入甘油10mL，混匀。

阳性对照通过如下方法制备：取50mL试剂瓶，加入Tris 0.05g，加入纯化水8mL溶解混匀，用浓盐酸调节pH至7.2，将预先准备好的羊抗兔多克隆抗体2.5mg加入其中，再将预先准备好的甲肝抗原5mg加入其中，补加水至10mL，充分混匀。加入戊二醛10uL，迅速混匀，并在漩涡搅拌器上反应搅拌反应30分钟以上，之后加入乙醇胺10uL，充分混匀，继续搅拌10分钟制备成抗原-抗体偶联物。用10mM pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释上述偶联物，并添加10％小牛血清制备成阳性对照试剂。

阴性对照为ddH₂0。

采用本发明提供的试剂盒的检测甲型肝炎病毒IgM抗体的步骤如下：

第一步加样：酶标板孔中每孔加入血清/血浆/全血样本50uL，设置阴/阳性对照各两孔，加入阴性对照/阳性对照各100uL/孔，置于37℃温箱中温育20分钟；

第二步洗板：将20倍浓缩洗液50mL加入950mL纯化水中制备成洗液，用洗液清洗上述酶标板5次，每次酶标板孔中应注满洗液；

第三步加酶和抗原：在清洗后的酶标板孔中各加入甲型肝炎病毒抗原试剂和HRP酶标记抗体试剂各50uL，混匀后，置于37℃温箱中温育30分钟；

第四步洗板：操作同第二步；

第五步加底物：在酶标板中加入显色剂100uL/孔，置于37℃温箱中温育15分钟后，取出加入终止液50uL，用酶标仪在单波长450nm条件下或双波长450/630nm条件下测定吸光度值。阴性对照OD450nm值应小于0.100，阳性对照OD450nm值应大于1.000。待测样本OD值大于0.105时，为甲肝IgM抗体阳性，预示患者可能感染了甲型肝炎病毒。

实验例1

一致性评价

实施例2的试剂盒经1093例临床样本验证，结果见表1，与对照试剂(已获得CFDA批准文号)相比，阳性一致率为96.3％，阴性一致率为98.2％，整体一致率为97.8％。

表1

经Kappa统计检验，Kappa值为0.931，大于0.8，试剂盒与对照试剂盒临床试验评价结果显示，两个试剂盒检测性能等效。

实验例2

重复性检测

实施例2的试剂盒按操作要求重复检测10次阴/阳性对照的结果如下表2：

表2

可见，实施例2的试剂盒具有较低的变异系数，重复性较好。

实验例3

实施例2的试剂盒按操作要求检测非甲型肝炎病毒IgM阳性样本，检测结果如下表3：

表3

注：编号1-8代表重复次数

从表3可以看出，各种非甲型肝炎病毒IgM阳性样本的OD值菌比较较低，呈阴性，说明实施例2的试剂盒具有较好的特异性。

实验例4

实施例2的试剂盒按操作要求检测梯度稀释的强阳性甲型肝炎病毒IgM阳性样本，样本按原倍、1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000的梯度稀释检测，结果如下表4和图2：

表4

稀释倍数	原倍	1:10倍	1:50倍	1:100倍	1:500倍	1:1000倍
							OD值	2.237	1.939	1.113	0.635	0.315	0.133

从表4结果可以看出，可以看出，各梯度样本的检出结果均呈阳性，显示实施例2的试剂盒具有较高的灵敏度。且结合图2可以看出，强阳性样本稀释度与检测结果OD值之间呈非线性相关关系。

实验例5

使用实施例2的试剂盒检测648份临床血清样本，采用ROC曲线统计试剂盒Cut-Off值结果。其中109份样本为阳性，其余539份样本为阴性。经ROC曲线统计，结果如图1所示显示，取Cut-Off值为0.105时，试剂盒灵敏度为95.4％，特异性为98.9％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

包被步骤：用包被液稀释兔抗人IgM抗体，混匀后，加入酶标板微孔中，于2-8℃条件下，包被12-24小时；

封闭步骤：弃去酶标板微孔中的包被液，加入封闭液，于2-8℃条件下，封闭12-24小时；

干燥步骤：取经封闭步骤后的酶标板，弃去封闭液，置于37-45℃的条件下干燥6-24小时；

其中，包被液为48-52mM的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，所述包被液的pH值为8-10；

封闭液为含1-2％BSA的磷酸盐缓冲液，所述封闭液的pH值为7.0-8.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，兔抗人IgM抗体的浓度为4-5g/L，兔抗人IgM抗体与包被液的体积比为1:(900-1100)。

3.一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的酶标板，其特征在于，其根据权利要求1所述的方法制备得到。

4.一种检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求3所述的酶标板以及如下组分中的一种或多种的组合：

抗原试剂、酶标抗体试剂、洗涤剂、显色剂、终止液、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原试剂为甲肝病毒培养物灭活裂解液。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体试剂为HRP酶标记的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂为含0.05％-1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂为0.5-50mM过氧化氢脲和0.5-50mM四甲基联苯胺的混合溶液。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为0.4-0.6M的硫酸。

10.根据权利要求4-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为人血清、血浆或全血样本。