CN111596064A - 同时检测pedv和tgev的速测卡及其制备、使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时检测PEDV和TGEV的速测卡及其制备、使用方法。所述速测卡包括卡壳和设置在卡壳内的试纸条，试纸条包括PVC底板、依次相连地粘贴在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，卡壳上设置有加样孔和结果观察窗。硝酸纤维素膜上固定有抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体用于分别形成第一检测线和第二检测线，结合垫上固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体。通过该速测卡能够同时实现针对猪组织粪便样本中PEDV、TGEV的检测，加样只需1次，反应均在统一条件下进行，具有快速、准确性好、灵敏度高、操作简便等优点。

Description

同时检测PEDV和TGEV的速测卡及其制备、使用方法
技术领域
本发明涉及动物病原检测的技术领域，具体涉及一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪肠胃炎病毒(TGEV)的免疫胶体金速测卡及其制备、使用方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，以下简称PEDV)可造成感染猪体腹泻、呕吐、脱水，并最终导致死亡，各年龄段猪均可感染，但哺乳仔猪最为易感。自2010年新的猪病毒性腹泻(PED)疫情爆发以来，给全球养猪业造成了严重的经济损失。研究已证实PEDV变异株为此次疫情的元凶，且其致病力更强，可造成新生仔猪100％死亡。基于该病毒易突变和重组的特性，目前位于亚洲、美洲和欧洲的多个国家均发生不同基因型毒株的感染疫情，这也使得疫苗的使用效果并不理想，到目前为止无法彻底控制。
猪肠胃炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，以下简称TGEV) 与PEDV相同，同属于α-冠状病毒属，也同样造成仔猪以腹泻、脱水，甚至严重至死亡为特征的疾病。Doyle和Hutchings首次报道了美国由TGEV引起的疾病，随后传播至各个大陆：北美(1989年的加拿大)、欧洲(1957年的英国)和亚洲(1956年的日本、2000年的韩国和2000年的泰国)。在中国，20世纪60 年代报道了该病，自2010年以来发生了广泛的疫情。
作为猪病毒性腹泻疾病最为重要的两种病原体，两者之间也常常存在混合感染的情况。对于发生腹泻疫情的企业及养殖用户而言，能够及时有效地明确感染病原微生物，对预防和控制疫情的发展起到极其重要的作用。目前常规检测 PEDV和TGEV的方法为PCR，但该方法需要专门的实验室场地，需要借助专门的仪器设备，并且对操作人员要求较高，需要有相当的专业知识、技能和操作经验，检测过程前处理复杂，所需时间很长。
因此，开发一种能够同时快速检测并鉴别PEDV和TGEV的技术手段对猪流行性腹泻疾病的防控具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时检测PEDV和TGEV 的速测卡，用于对猪的粪便样本中的PEDV和TGEV进行快速、现场和灵敏的检测。
本发明所提供的同时检测PEDV和TGEV的速测卡包括卡壳和设置在卡壳内的试纸条，所述试纸条包括PVC底板、依次相连地粘贴在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述卡壳上设置有加样孔和结果观察窗。所述硝酸纤维素膜上固定有抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体用于分别形成第一检测线和第二检测线，所述结合垫上固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体。
优选地，所述抗PEDV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO： C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26和/或保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCCNO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33 制备得到的。
优选地，所述抗TGEV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO： C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01和/或保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCCNO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07 制备得到的。
优选地，所述硝酸纤维素膜上固定有利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011-26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用2019年 09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为 CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体。所述结合垫上固定有胶体金标记的利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07所制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体。
优选地，所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1.2μg，所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。
本发明另一方面还提供一种制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，包括以下步骤：(1)用抗PEDV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被固定形成第一检测线和第二检测线中的一个，用抗TGEV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被形成所述第一检测线和所述第二检测线中的另一个，用羊抗鼠IgG二抗在硝酸纤维素膜进行包被形成质控线，得到含有所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜；(2)制备固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体的结合垫；(3)组装试纸条：在PVC底板上依次粘贴设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜和吸收垫来得到所述试纸条，其中所述样品垫位于所述结合垫上方且所述结合垫与所述样品垫具有1mm-1.5mm的重叠区，所述硝酸纤维素膜位于所述结合垫下方且所述硝酸纤维素膜与所述结合垫具有1mm-2mm的重叠区，所述吸收垫位于所述硝酸纤维素膜的上方且所述吸收垫与所述硝酸纤维素膜具有1mm-2mm的重叠区，所述样品垫是大小为4mm×15mm的玻璃纤维膜；(4) 安装卡壳使得其覆盖住所述试纸条，其中所述卡壳上的加样孔位于所述样品垫上方，所述结果观察窗位于所述硝酸纤维素膜上方使得能露出所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线所在的位置。
优选地，所述抗PEDV单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011-26和/或2019年09月11日保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33制备得到的。所述抗TGEV单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01或2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07 制备得到的。
优选地，所述硝酸纤维素膜上固定有利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019170 的杂交瘤细胞株FL011-26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用2019年 09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为 CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所产生的抗TGEV特异性单克隆抗体。所述结合垫上固定有胶体金标记的利用2019年09月11日保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO： C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07所产生的抗TGEV特异性单克隆抗体。
优选地，所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1.2μg，所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。
本发明还提供一种应用上述速测卡同时检测PEDV和TGEV的方法，其包括以下步骤：(1)样本处理：向猪的新鲜粪便样品中加入pH 7.4、0.2mol/L的 PBS缓冲液作为提取缓冲液，静置或离心，取上清；(2)加样：取100μL步骤 (1)中的上清液加入到所述速测卡的加样孔中，孵育8-10min；(3)结果判定：从所述结果观察窗观察速测卡中第一检测线、第二检测线和质控线的颜色变化，当仅有质控线显色而第一检测线和第二检测线均不显色时，判定待检样品中 PEDV和TGEV均是阴性，当第一检测线、第二检测线和质控线均显色时，判定待检样品中PEDV和TGEV均是阳性，当质控线以及第一检测线或第二检测线中的一个同时显色时，判定待检样品中与第一检测线或第二检测线中显色的那道检测线所对应的病毒为阳性。
本发明所提供的速测卡对粪便样本具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于猪腹泻疾病的快速检测。与现有的速测卡操作相比较，本发明的速测卡尤其具有以下优势：(1)本发明的速测卡不是将分别针对两种病原的检测卡进行简单的物理性胶连，而是在同一张硝酸纤维素膜上同时固定包被抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体，仅需1次加样，在同一条件下进行检测反应，实现同时检测PEDV和TGEV；(2)样品前处理完全统一，操作简单，仅需100 μL的样品加样量即可完成检测；(3)检测时间短(5-8min)，结果判定标准统一。
本发明提供的同时检测PEDV和TGEV的免疫胶体金速测卡可为实际检测部门提供快速、现场和灵敏的检测手段，尤其适用于猪组织粪便样本的检测。
附图说明
图1是示意性示出本发明的速测卡结构的图。
图2是速测卡中试纸条组成的分解结构示意图。
图3是示出用本发明实施例的速测卡对空白样品PBS检测时结果的黑白图像。
图4是示出用本发明实施例的速测卡对含PEDV病毒粒子的溶液样本检测时结果的黑白图像。
图5是示出用本发明实施例的速测卡对含TGEV病毒粒子的溶液样本检测时结果的黑白图像。
图6是示出用本发明实施例的速测卡对同时含PEDV和TGEV病毒粒子的溶液检测时结果的黑白图像。
图7是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV和TGEV双阴性粪便样本提取液检测时结果的黑白图像。
图8是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV单阳性粪便样本提取液检测时结果的黑白图像。
图9是示出用本发明实施例的速测卡对TGEV单阳性粪便样本提取液检测时结果的黑白图像。
图10是示出用本发明实施例的速测卡对PEDV和TGEV双阳性粪便样本提取液检测时结果的黑白图像。
具体实施方式
为了帮助本领域技术人员进一步理解本申请的技术方案，将结合附图对本申请的具体实施方式进行详细的描述。
本发明提供一种能同时检测PEDV和TGEV的免疫胶体金速测卡，图1示意性地示出了速测卡的大体结构，该速测卡主要包括卡壳1和设置在卡壳1内的试纸条2。卡壳1上设置有加样孔3和结果观察窗4，加样孔3的尺寸优选为 3mm×7mm，结果观察窗4的尺寸优选为4mm×18mm。
如图2所示，试纸条2由PVC底板以及依次相连地粘贴在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(下文简称为NC膜)和吸收垫组成。其中样品垫位于结合垫上方且结合垫与样品垫具有1mm-1.5mm的重叠区，NC膜位于结合垫下方且NC膜与结合垫具有1mm-2mm的重叠区，吸收垫位于NC膜的上方且吸收垫与NC膜具有1mm-2mm的重叠区。样品垫优选是尺寸为4mm×15mm 的玻璃纤维膜。结合垫可以是由本领域技术人员已知的任何合适的材料制成的，尺寸优选为3mm×4mm。NC膜的尺寸优选为4mm×28mm。吸收垫可以是由本领域技术人员已知的任何合适的材料制成的，尺寸优选为4mm×19mm。
NC膜上固定有抗PEDV特异性单克隆抗体、抗TGEV特异性单克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗，它们分别用于形成针对两种病毒的两道检测线和质控线C。 NC膜上每种单克隆抗体的量优选为0.4μg-1.2μg。为了方便描述，下文将利用抗PEDV特异性单克隆抗体所形成的检测线称为第一检测线T1，利用抗TGEV 特异性单克隆抗体而形成的检测线称为第二检测线T2。然而，本领域技术人员将会理解，第一检测线T1和第二检测线T2的限定方式并不仅限于此，也可以将利用抗TGEV特异性单克隆抗体而形成的检测线称为第一检测线，将利用抗PEDV特异性单克隆抗体所形成的检测线称为第二检测线。
结合垫上固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体，每种单克隆抗体的量优选为5ng-50ng。
抗PEDV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26和/或2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33制备得到的。抗TGEV特异性单克隆抗体是利用2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO： C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01和/或2019年09月11日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07制备得到的。
用上述速测卡检测猪组织粪便样品中的PEDV和/或TGEV时，首先向加样孔3中加入100uL预处理过的样品溶液并水平静置，样品溶液会沿着样品垫向结合垫的方向渗透，静置8-10min后，从结果观察窗4观察质控线C、第一检测线T1和第二检测线T2的颜色变化。当质控线C、第一检测线T1和第二检测线 T2均显色时，判定被检样品中PEDV和TGEV都为阳性。当质控线C显色，第一检测线T1显色，而第二检测线T2不显色时，判定被检样品中PEDV阳性，TGEV阴性。当质控线C显色，第二检测线T2显色，而第一检测线T1不显色时，判定被检样品中PEDV阴性，TGEV阳性。当质控线C显色，而第一检测线T1和第二检测线T2均不显色时，判定被检样品中PEDV和TGEV都为阴性。
实施例1：抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体的制备
取分泌抗PEDV特异性单克隆抗体的保藏编号为CCTCC NO:C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26(为了便于描述，下文中将获得的对应抗体称为PEDV抗体1)和CCTCC NO:C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33(为了便于描述，下文中将获得的对应抗体称为PEDV抗体2)以及分泌抗TGEV特异性单克隆抗体的保藏编号为CCTCC NO:C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01(为了便于描述，下文中将获得的对应抗体称为TGEV抗体1)和CCTCC NO:C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07(为了便于描述，下文中将获得的对应抗体称为TGEV抗体2)，分别在细胞培养瓶中进行扩大培养。
取6-8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2mL液体石蜡。10天后，将上述培养获得的四种杂交瘤细胞分别腹腔接种小鼠来制备相应的单克隆抗体。待小鼠腹部明显膨大时，用弯头滴管采集腹水，通过间接ELISA测定腹水抗体的效价。
将小鼠腹水在室温、2000rpm下离心15min，挑去上层油脂，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，4℃、13000rpm下离心30min，弃上清；将沉淀溶于适量0.01M的PBS(pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，4℃、13000rpm下离心30min，弃上清，将沉淀溶于适量0.01M的PBS(pH7.4)，4℃下透析过夜，然后测定蛋白质含量。
采用Protein G小柱对上述得到的抗体粗蛋白质进行进一步纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续用 10mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；用5mL洗脱液(0.1M甘氨酸- 盐酸缓冲液，pH 7.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 2.7) 用于中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性条件。
实施例2：速测卡的制造
1、制备含有第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C的NC膜
首先，配制进行包被所需的抗体溶液。将实施例1得到的PEDV抗体1用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.0mg/mL得到PEDV抗体1 溶液，用作形成第一检测线T1的包被抗体。将实施例1制备得到的TGEV抗体 1用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.0mg/mL得到TGEV抗体1溶液，用作形成第二检测线T2的包被抗体。将羊抗鼠IgG二抗(购自杭州隆基生物技术有限公司)用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到 1mg/mL，用作质控线C的包被抗体。
接下来，在NC膜上包被抗体以形成第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C。
用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的PEDV抗体1溶液、浓度为1.0mg/mL 的TGEV抗体1溶液和浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液分别以1.0μL/cm 在NC膜(Pall vivid 170硝酸纤维素膜)上分别划线，作为第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C。
将划线之后的NC膜在37℃烘干24小时，得到含有第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C的NC膜。
2、制备固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的结合垫
(1)胶体金制备
I)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)中浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用。
II)烧金溶液A的配制：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末(购自sigma)于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存。
III)烧金溶液B的配制：称取1g柠檬酸三钠(购自sigma)溶解于99ml 超纯水中，混匀。
IV)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml，倒入棕色瓶，4℃避光保存，得到胶体金溶液(其中胶体金的粒径为 40nm，浓度为0.01％)。
(2)抗体标记
I)抗体的标记：取1.5mL上述1)制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，分别加入20ug PEDV抗体2和20ug TGEV抗体2并混合均匀，室温反应40min后加入10％的BSA终止反应，静置30min。
II)标记抗体纯化：将上述静置产物先低速(1500r/min)离心并弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再将上清液高速(8500r/min)离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％(质量百分含量)BSA的0.1M PBS(PH7.4) 复溶沉淀，得到胶体金标记的PEDV抗体2溶液(浓度为0.4mg/ml)和胶体金标记的TGEV抗体2溶液(浓度为0.4mg/ml)，4℃保存。
(3)喷金与划膜
将上述制备的0.4mg/ml的胶体金标记的PEDV抗体2抗体溶液和0.4mg/ml 的胶体金标记的TGEV抗体2溶液按1:1混匀，得到混合溶液，再将混合溶液以 2.0μL/cm喷于预处理过的结合垫，烘干，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的结合垫。
3、组装形成速测卡
在PVC底板上依次相连地粘贴样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，形成试纸条。其中，样品垫的一端覆盖在结合垫上，使得样品垫与结合垫具有1mm-1.5mm 的重叠区，NC膜位于结合垫下方且NC膜与结合垫具有1mm-2mm的重叠区，吸收垫位于NC膜的上方且吸收垫与NC膜具有1mm-2mm的重叠区。
将卡壳覆盖安装在试纸条上，使得加样孔位于样品垫上方以便露出样品垫的一部分，结果观察窗位于NC膜上方以便露出第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C所在的位置。至此完成速测卡的组装。
实施例3：用实施例2的速测卡检测溶液中的PEDV和TGEV病毒粒子
用按实施例2制备的速测卡对用PBS缓冲液配制的以下三种含有PEDV和/ 或TGEV病毒粒子的溶液进行检测以评价该速测卡的效果：含1μg/ml PEDV病毒粒子的溶液，含1μg/ml TGEV病毒粒子的溶液，以及同时含有1μg/ml PEDV 病毒粒子和1μg/ml TGEV病毒粒子的溶液。同时用0.2mol/L PBS缓冲液(pH 7.4) (具体配方为：8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g 氯化钾，双蒸水溶解定容至1L)作为空白对照。
向各速测卡的加样孔中分别加入100uL待测溶液，在室温条件下反应8分钟后，从结果观察窗观察显色结果并以拍照的方式记录检测结果。
对于空白对照，结果如图3所示，从结果观察窗可观察到质控线C处呈现明显显色，第一检测线T1和第二检测线T2处不显色。
对于含1μg/ml PEDV病毒粒子的溶液，结果如图4所示，从结果观察窗可观察到质控线C和第一检测线T1处呈现明显显色，第二检测线T2处不显色。
对于含1μg/ml TGEV病毒粒子的溶液，结果如图5所示，从结果观察窗可观察到质控线C和第二检测线T2处呈现明显显色，第二检测线T1处不无色。
对于同时含有1μg/ml PEDV病毒粒子和1μg/ml TGEV病毒粒子的溶液，结果如图6所示，从结果观察窗可观察到质控线C、第一检测线T1和第二检测线 T2处均呈现明显显色。
上述结果表明，按实施例2所制备的速测卡能够准确地检测并鉴别出样品中的PEDV病毒粒子和TGEV病毒粒子。
实施例4：用实施例2的速测卡检测粪便样本中的PEDV和TGEV
用按实施例2制备的速测卡对以下粪便样本中的PEDV和TGEV存在情况进行检测：PEDV和TGEV均为阴性的粪便，PEDV阳性的粪便，TGEV阳性的粪便，PEDV和TGEV均为阳性的粪便。
首先，按照以下步骤制备各粪便样本的提取液。
(1)用大吸管吸取1mL 0.2mol/L PBS(pH 7.4)作为提取缓冲液加入离心管，PBS的具体配制方法为8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L；
(2)棉签直接蘸取新鲜粪便后立即插入到装有提取缓冲液的离心管，将棉签在管壁上反复用力旋转至少10次，并与管中的溶液混匀，然后在液面上方的管壁上挤压棉签，使液体尽可能被挤出，丢弃棉签；
(3)静置1-2分钟，优选4000rpm下离心5分钟；
(4)取上清作为提取液用于后续的检测。
接下来，将上述制备的提取液各取100uL分别加入到速测卡的加样孔中，在室温条件下反应8分钟后，从结果观察窗观察显色结果并以拍照的方式记录检测结果。
对于PEDV和TGEV均为阴性的粪便样本，结果如图7所示，从结果观察窗中可观察到质控线C处呈现明显显色，第一检测线T1和第二检测线T2处不显色。
对于PEDV阳性的粪便样本，结果如图8所示，从结果观察窗可观察到质控线C和第一检测线T1处呈现明显显色，第二检测线T2处不显色。
对于TGEV阳性的粪便样本，结果如图9所示，从结果观察窗可观察到质控线C和第二检测线T2处呈现明显显色，第二检测线T1处不显色。
对于PEDV和TGEV均为阳性的粪便样本，结果如图10所示，从结果观察窗可观察到质控线C、第一检测线T1和第二检测线T2处均呈现明显显色。
上述结果表明，按实施例2所制备的速测卡能够准确地检测并鉴别出粪便样品中的PEDV和TGEV，该速测卡可用于针对猪组织粪便样本中PEDV、TGEV 的快速、现场和灵敏的检测。
申请人声明，本发明专利通过上述实施例来说明本发明专利的技术方案，所属技术领域的技术人员应该明了，上述的说明不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的，对本发明专利申请进行的这些修改和替代，均落在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种同时检测PEDV和TGEV的速测卡，其包括卡壳和设置在卡壳内的试纸条，所述试纸条包括PVC底板、依次相连地粘贴在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述卡壳上设置有加样孔和结果观察窗，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜上固定有抗PEDV特异性单克隆抗体和抗TGEV特异性单克隆抗体用于分别形成第一检测线和第二检测线，所述结合垫上固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的速测卡，其特征在于：
所述抗PEDV特异性单克隆抗体是利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26和/或保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33制备得到的。
3.根据权利要求1所述的速测卡，其特征在于：
所述抗TGEV特异性单克隆抗体是利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01和/或保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07制备得到的。
4.根据权利要求1所述的速测卡，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜上固定有利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCCNO：C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体，
所述结合垫上固定有胶体金标记的利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07所制备得到的抗TGEV特异性单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的速测卡，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1.2μg，
所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。
6.一种制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)用抗PEDV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被固定形成第一检测线和第二检测线中的一个，用抗TGEV特异性单克隆抗体在硝酸纤维素膜上进行包被形成所述第一检测线和所述第二检测线中的另一个，用羊抗鼠IgG二抗在硝酸纤维素膜进行包被形成质控线(C)，得到含有所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜；
(2)制备固定有胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体的结合垫；
(3)组装试纸条：在PVC底板上依次粘贴设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜和吸收垫来得到所述试纸条，其中所述样品垫位于所述结合垫上方且所述结合垫与所述样品垫具有1mm-1.5mm的重叠区，所述硝酸纤维素膜位于所述结合垫下方且所述硝酸纤维素膜与所述结合垫具有1mm-2mm的重叠区，所述吸收垫位于所述硝酸纤维素膜的上方且所述吸收垫与所述硝酸纤维素膜具有1mm-2mm的重叠区，所述样品垫是大小为4mm×15mm的玻璃纤维膜；
(4)安装卡壳使得其覆盖住所述试纸条，其中所述卡壳上的加样孔位于所述样品垫上方，所述结果观察窗位于所述硝酸纤维素膜上方使得能露出所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线所在的位置。
7.根据权利要求6所述的制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，其特征在于：
所述抗PEDV单克隆抗体是利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNO：C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26和/或保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33制备得到的，
所述抗TGEV单克隆抗体是利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01或保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07制备得到的。
8.根据权利要求6所述的制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜上固定有利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCCNO：C2019170的杂交瘤细胞株FL011-26所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019195的杂交瘤细胞株FL111-01所产生的抗TGEV特异性单克隆抗体，
所述结合垫上固定有胶体金标记的利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019194的杂交瘤细胞株FL011-33所产生的抗PEDV特异性单克隆抗体和胶体金标记的利用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：C2019196的杂交瘤细胞株FL011-07所产生的抗TGEV特异性单克隆抗体。
9.根据权利要求6所述的制备同时检测PEDV和TGEV的速测卡的方法，其特征在于：
所述硝酸纤维素膜上固定的所述抗PEDV特异性单克隆抗体和所述抗TGEV特异性单克隆抗体的量分别为0.4μg-1.2μg，
所述结合垫上固定的所述胶体金标记的抗PEDV特异性单克隆抗体和所述胶体金标记的抗TGEV特异性单克隆抗体分别为5ng-50ng。
10.一种应用权利要求1-5中任一项所述的速测卡同时检测PEDV和TGEV的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本处理：向猪的新鲜粪便样品中加入pH 7.4、0.2mol/L的PBS缓冲液作为提取缓冲液，静置或离心，取上清；
(2)加样：取100μL步骤(1)中的上清液加入到所述速测卡的加样孔中，孵育8-10min；
(3)结果判定：通过所述结果结果观察窗观察速测卡中第一检测线、第二检测线和质控线的颜色变化，当仅有质控线显色而第一检测线和第二检测线均不显色时，判定待检样品中PEDV和TGEV均是阴性，当第一检测线、第二检测线和质控线均显色时，判定待检样品中PEDV和TGEV均是阳性，当质控线以及第一检测线或第二检测线中的一个同时显色时，判定待检样品中与第一检测线或第二检测线中显色的那道检测线所对应的病毒为阳性。
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