CN102692502B - 一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，利用捕获法反应原理，并结合胶体金免疫层析技术。试剂盒包括抗人IgM、胶体金偶联的抗原抗体复合物以及支持性材料与质控反应系统。技术方案为采用抗人IgM包被在检测线(T)上。病毒抗原抗体复合物与胶体金偶联并干燥后置于金标垫上。其中检测线的鼠抗人IgM是固化的，金标垫的抗原抗体复合物是可流动的。试剂盒还包括一个质控系统，由一对可以特异性反应的抗原抗体组成，其中一项与胶体金偶联后置于金标垫上，为流动相。另一项固化于质控线(C)，为固定相。本发明的试剂盒，能在2-15分钟内得到检测结果，并且能够方便地应用于单份标本的检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地，本发明涉及一种用胶体金层析捕获法检测人血清、体液或其它样本中的甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲型病毒性肝炎(简称甲肝，HA)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一种肠道传染病，以肝实质细胞炎性损伤为主，传染性强，发病率高，容易发生食物型和饮水型的爆发与流行，迄今仍是全世界普遍的公共卫生问题，全球年发病人数约140万，实际病例则是报告数的3至10倍。目前我国甲肝的发病率和感染率仍居其它各型病毒性肝炎首位，全国90年代初开展的病毒性肝炎血清流行病学调查结果显示，我国抗-HAV IgG总流行率为80.9％，表明预防控制甲肝爆发与流行仍将是艰巨长期的工作，也是重要的研究课题。
我国甲型肝炎(甲肝)主要呈散发分布，但时有暴发或流行；约有9.7亿人已感染过HAV。我国甲型肝炎流行特点有：1、农村高于城市。5-15岁儿童感染率城市明显低于农村，但30岁以上感染曲线城市与农村呈平行状态。2、长江以北高于长江以南，西部地区高于中、东部地区。3、根据各省市流行率的分布状况显示，甲型肝炎发病或爆发流行仍以儿童为主。4、流行率明显与卫生习惯有关。
1988年，上海甲肝大流行，持续近1年，波及人数达31万。此事件因其发病人数多、影响深、经济损失重而震惊世界。
由于甲型肝炎临床表现复杂多样，有的甚至无症状，故给诊断带来一定困难，不但要参考接触史，所在地区甲型肝炎流行史、患者的症状和体征，而且还要作肝功能检查和血清学测定，后者尤其是确诊甲型肝炎的依据。
抗-HAV IgM是诊断甲型病毒性肝炎的一个重要指标。甲型肝炎病毒特异性抗体主要有两种，即IgM和IgG型的抗-HAV。抗-HAV IgM抗体在急性甲肝感染时出现较早(患者于发病后1～4周血清中即可检出HAV-IgM抗体)，上升较快，高峰滴度较高、滴度随时间推移而下降，但用敏感的免疫测定法，IgM可持续存在6～12个月，甚至达到18个月。所有患者发病早期体内均能查到抗-HAVIgM，而抗-HAV IgG是疾病恢复期才出现的一个指标，是甲型病毒性肝炎的保护性抗体。因此，检测病人血清中抗-HAV IgM是目前诊断甲型肝炎最可靠最灵敏的方法，可以明确诊断该病。
目前可用于抗-HAV IgM检测的方法有放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、化学发光(CLIA)等。这些方法无一例外均为实验室方法，需要一定的标本量与检测时间，一般用于大量标本的同时检测，需要收集一定量的标本后，统一进行检测，在临床应用上一般需要1-5天发出检验报告。这就不利于急诊病例与流行病的控制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒。本发明所提供的检测试剂盒利用捕获法反应原理，并结合胶体金免疫层析技术。试剂盒包括抗人IgM、胶体金偶联的抗原抗体复合物以及支持性材料与质控反应系统。
其中，所述抗人IgM可以为羊抗人IgM，也可以为鼠抗人IgM。
所述胶体金偶联的抗原抗体复合物结构为[胶体金]-[抗体]-[抗原]，其中抗体为抗甲型肝炎病毒的单克隆或多克隆抗体。
本发明的技术方案为采用抗人IgM包被在检测线(T)上。病毒抗原抗体复合物与胶体金偶联并干燥后置于金标垫上。其中检测线的鼠抗人IgM是固化的，金标垫的抗原抗体复合物是可流动的。测试时，样本通过层析作用向上流动，样本中的抗体会与金垫上的抗原-胶体金偶联物结合，并被检测带上的抗人IgM捕获，形成的[鼠抗人IgM]-[血清抗体]-[抗原-抗体-胶体金]复合物，从而在检测线(T)显现出一条红色条带。如是阴性样本，则将无红色条带显现。
所述支持性材料包括吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维、无纺布、聚酯纤维、底卡。吸水纸是加强层析作用，硝酸纤维素膜是用于制备固定相，玻璃纤维、无纺布与聚酯纤维是用于制备流动相与吸收样品，底卡则是支持性背衬。
为了方便进行产品质控控制，试剂盒还包括一个质控系统，由一对可以特异性反应的抗原抗体组成，其中一项与胶体金偶联后置于金标垫上，为流动相。另一项固化于质控线(C)，为固定相。在检测时，流动相溶解后向上层析，并被结合在质控线上。
所述质控系统的抗原抗体对可以选用鼠IgG-羊抗鼠，其中鼠IgG偶联胶体金后用于流动相，羊抗鼠用于固定相。
本发明的另一个目的是提供一种如上述的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.固相膜制备：用缓冲液将检测线划膜液(鼠抗人IgM)稀释至1-2mg/ml，
将质控线划膜液(羊抗鼠)稀释至2-4mg/ml，按1μl/cm的浓度在硝酸纤维素膜的中部划出两条水线。硝酸纤维素膜室温或37℃干燥备用。
2.胶体金偶联：按5-10μg蛋白∶1ml胶体金的投料比将HAV抗体偶联在胶体金上。离心去除多余的抗体。再按1∶10-1∶40的比例投入HAV抗原，室温反应后，离心去除多余的抗原，即得【胶体金-抗体-抗原】偶联复合物。将偶联复合物铺于金标垫上，37℃干燥备用，为检测垫。
3.质控流动相制备：按10-20μg蛋白∶1ml胶体金的投料比将质控流动相蛋白(鼠IgG)偶联在胶体金上，离心去除多余的蛋白，37℃干燥备用，为质控垫。
4.粘贴制备大板：将上吸水纸、固相膜、检测垫、质控垫、样品垫依次粘贴在底板上。底板上还可以粘贴保护性或指标性的不干胶条。
5.分切小条：按2.5-4mm的宽度将大板切为小条，为试纸条。
6.视需要装配塑料卡座：将小条放在上下两片的塑料卡座中，塑料卡座在固相膜与样品垫处有两个窗口，为观测窗与加样窗。加上塑料卡座后一般称为检测卡。
7.单人份内包装：将试纸条或检测卡封装于铝箔袋中，袋中还需要加上一片干燥剂，视需要加入一次性滴管。
在免疫检测抗体的方法上，一种是包被抗原，用酶或其它指示物标记抗人二抗的模式，称为间接法。一种是包被抗人二抗，用酶或其它指示物标记抗原的模式，称为捕获法。本发明的模式为捕获法。
本发明的试剂盒，能在2-15分钟内得到检测结果，并且能够方便地应用于单份标本的检测。其应用价值在于(1)急诊应用，可以迅速判定病因。(2)可以最快的速度判定甲肝病毒的流行，并使之得到有效控制。(3)很多报告病例量较少的基层医疗机构，原来需要将标本送往上一级单位，因而延误诊断时间。
新技术可以使基层医疗机构获得检测能力，从而能更早地诊断甲型肝炎病毒的感染。
附图说明
图1检测卡的分层结构图
图2试纸条的侧视图
其中，(1)加样孔(2)样品垫(3)质控垫(4)检测垫(5)固相膜(6)观察窗口(7)质控线(C)(8)底卡(9)上吸水纸(10)塑料卡上片(11)塑料卡下片(12)检测线(T)
图3试纸盒结果判定方法
具体实施方式
实施例一：试剂盒制备工艺
试剂盒制备过程包括以下步骤：
1.固相膜制备；
2.胶体金偶联；
3.质控流动相制备；
4.粘贴制备大板；
5.分切小条；
6.视需要装配塑料卡座；
(一)固相膜制备
1.检测线划膜液：用0.02M(PH＝7.4)PB将鼠抗人IgM稀释为1-2mg/ml，混匀，用40μm滤膜过滤后备用。
2.质控线划膜液：用0.02M(PH＝7.4)PB将羊抗鼠IgG稀释为2-4mg/ml，混匀，用40μm滤膜过滤后备用。
3.用划膜仪在硝酸纤维素膜中部划线。划膜参数为：划线头高度4.8cm，划线笔间距0.5-1cm，划线浓度0.8-1μl/cm，划线速度：100-150mm/s。
4.在低于35％湿度下，37℃干燥3小时以上。
(二)胶体金偶联，生产出检测垫
1.使用材料
1.1 40-60nm直径胶体金溶液
1.2 0.1M硼酸缓冲液(BB)(PH8.5-9.0)
1.3 10％BSA
1.4 洗脱液：0.01M硼酸缓冲液(PH8.5-9.0)，0.5％BSA
1.5 金标稀释液：0.01M硼酸缓冲液(PH8.5-9.0)，0.5％BSA，1％Tween-20，2％蔗糖
2.使用干净专用玻璃量筒取胶体金溶液100ml，观察外观红色透明、无沉淀及变色等现象，将其全部倒入圆底烧瓶内。在圆底烧瓶中加入磁性转子，置磁力搅拌器上，开启搅拌并调节至合适转速。使用移液器取0.1MBB 10ml，观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入烧瓶内。
3.使用移液器取用Anti-HAV 0.5-1mg。观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，将其全部加入胶体金中。注意不要加到烧瓶内壁或溅出。持续搅拌5分钟。
4.使用移液器取10％BSA 5ml，观察外观黄色透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其全部加入烧瓶内。持续搅拌5分钟。关闭搅拌，将金标溶液均分至离心管中，10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。
5.合并各离心管，使用移液器取HAVAg，取样量根据原料使用浓度确定。观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入上述玻璃瓶内。吸头在溶液中吸打两次，以清除残液。
6.加入金标洗脱液恢复至100ml，室温搅拌反应2小时。10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。
7.各离心管按原体积加入金标洗脱液使沉淀复溶，再10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。取金标稀释液加入离心管中，使沉淀复溶为20-30％原体积。
8.将偶联物铺于玻璃纤维或聚酯膜上，置于烘箱内烘干过夜。要求在环境空气湿度低于35％的条件下干燥时间达到16小时以上。
9.将干燥的检测垫切成4-5mm宽度的细条。
(三)质控流动相制备，生产出质控垫
1.使用材料
1.1 40-60nm直径胶体金溶液
1.2 0.1M硼酸缓冲液(BB)(PH8.5-9.0)
1.3 10％BSA
1.4 洗脱液：0.01M硼酸缓冲液(PH8.5-9.0)，0.5％BSA
1.5 金标稀释液：0.01M硼酸缓冲液(PH8.5-9.0)，0.5％BSA，
1％Tween-20，2％蔗糖
2.使用干净专用玻璃量筒取胶体金溶液100ml，观察外观红色透明、无沉淀及变色等现象，将其全部倒入圆底烧瓶内。在圆底烧瓶中加入磁性转子，置磁力搅拌器上，开启搅拌并调节至合适转速。使用移液器取0.1MBB 10ml，观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其加入烧瓶内。
3.使用移液器取用鼠IgG 1-2mg。观察外观透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，将其全部加入胶体金中。注意不要加到烧瓶内壁或溅出。持续搅拌5分钟。
4.使用移液器取10％BSA 5ml，观察外观黄色透明、无浑浊、沉淀及变色等现象，然后将其全部加入烧瓶内。持续搅拌5分钟。关闭搅拌，将金标溶液均分至离心管中，10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。
5.各离心管按原体积加入金标洗脱液使沉淀复溶，再10000-12000rpm离心30分钟，吸弃上清。取金标稀释液加入离心管中，使沉淀复溶为20-30％原体积。
6.将偶联物铺于玻璃纤维或聚酯膜上，置于烘箱内烘干过夜。要求在环境空气湿度低于35％的条件下干燥时间达到16小时以上。
7.将干燥的质控垫切成4-5mm宽度的细条。
(四)粘贴制备大板；
1.操作现场：干燥间工作台，配制前应确认工作现场已清场，除湿机已开启且环境湿度低于35％。
2.将吸水纸切成3cm的宽度。
3.在背衬板上贴吸水纸：要求：吸水纸下边沿覆盖硝酸膜上边沿1mm。
4.在背衬板上贴检测垫：要求：金纸的上沿应覆盖膜下沿1.5-2.0mm。
5.在背衬板上贴质控垫：要求：金纸的上沿应达到检测垫的1/2处并压着下沿。
6.在背衬板上贴样品垫：要求：样品垫的上沿必须在质控垫的1/2处并压着下沿。
7.视需要粘贴保护性或指示性不干胶
(五)分切小条；
1.对切条机进行调试，设置切条宽度为3-4mm。
2.将大卡平整放于卡槽处，进行切条。
3.将破损、污渍、标注不合格的小条挑出。
4.装铝箔袋。要求：每袋一条试纸、一个干燥剂。
5.封口打批号。
(六)视需要装配塑料卡座；
1.将小条置塑料卡底座中部，盖上上盖，压紧。
2.装铝箔袋。要求：每袋一条试纸、一个干燥剂。
3.封口打批号。
实施例二：试纸条检测操作过程：
1.将样本作1∶100稀释。(取一次性试管，先加入10μl样本，再加入1000μl生理盐水，混匀即可)。
2.打开铝箔袋，取出试纸条/卡备用。
3.试纸条：加样区为MAX线以下。将试纸条MAX箭头所指方向浸入己1∶100稀释样本中直到标记线为止，确保浸泡时间不少于15秒，然后将试纸条平置在记录纸(可用A4纸代替)上，同时开始计时。
4.检测卡：吸取100μl己1∶100稀释的样品，加入试纸卡的加样孔中。
5.可以观察到红色液体向上端流动，并在观测区沉积成红线。
6.测试结果应在15分钟内判定。15分钟后判定无效。
实施例三：结果判定
1.阳性(+)：两条红色条带出现。一条位于检测线(T)，另一条位于质控线(C)。
2.阴性(-)：仅质控线(C)出现一条红色条带，在检测线(T)内无红色条带出现。
3.无效：质控线(C)未出现红色条带，表明此次试验无效。
实施例四：试剂盒性能评价
1.最低检出量参考品的测定
经国家参考品标定的内部质控盘，其中包括阳性参考品10份，编号P1-P10。阴性参考品10份，编号N1-N10。最低检出量参考品4份，编号L1-L4。其中L1相当于国家参考品1∶4，L2相当于国家参考品1∶8，L3相当于国家参考品1∶16，L4为阴性血清。另有精密度参考品1份。内部质控盘说明书要求阳性参考品与阴性参考品检出率为100％，最低检出量要求L1、L2应检出阳性，L3可阴可阳，L4检出阴性，精密度参考品检出阳性并显色一致。
我们使用三个批次的胶体金试纸条测定质控盘，结果如表1所示。
表1：最低检出量参考品的测定结果
| L1 | L2 | L3 | L4 | |
| 20090610 | + | + | ± | - |
| 20090620 | + | + | ± | - |
| 20090630 | + | + | ± | - |
测定结果表明我们的试纸条的最低检出量达到L3，相当于国家参考品中最低出量1∶16。国家参考品的最低检出量依次分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，要求最低检出量达到1∶8，因此，本试剂盒能达到相应国家Panel的要求。
2.分析特异性评估
使用三个批次的胶体金试纸条测定内部质控盘中的的阴阳性参考品，结果如表2所示。
表2：检定所质控盘阴阳性参考品的的测定结果
实验表明，胶体金法的特异性能满足内部质控盘的要求。
3.交叉反应评估
收集其它各类肝炎阳性标本，使用三个批次的胶体金法试纸条测定这些血清样本，结果如表3-5所示。
表3：20090610批多种病毒阳性血清测定结果
| 标本类别 | 总份数 | 阴性份数 | 非特异反应率 |
| 丙肝抗体阳性 | 32 | 32 | 0％ |
| 乙肝表面抗体阳性 | 64 | 64 | 0％ |
| 戊肝IgM抗体阳性 | 31 | 31 | 0％ |
| 乙肝核心抗体IgM阳性 | 10 | 10 | 0％ |
表4：20090620批多种病毒阳性血清测定结果
| 标本类别 | 总份数 | 阴性份数 | 非特异反应率 |
| 丙肝抗体阳性 | 32 | 32 | 0％ |
| 乙肝表面抗体阳性 | 64 | 64 | 0％ |
| 戊肝IgM抗体阳性 | 31 | 31 | 0％ |
| 乙肝核心抗体IgM阳性 | 10 | 10 | 0％ |
表5：20090630批多种病毒阳性血清测定结果
| 标本类别 | 总份数 | 阴性份数 | 非特异反应率 |
| 丙肝抗体阳性 | 32 | 32 | 0％ |
| 乙肝表面抗体阳性 | 64 | 64 | 0％ |
| 戊肝IgM抗体阳性 | 31 | 31 | 0％ |
| 乙肝核心抗体IgM阳性 | 10 | 10 | 0％ |
由以上各表可见，胶体金试纸条对各项交叉反应原的检测结果均为阴性，表明其特异性良好，临床诊断上不会与其它多种病毒发生误诊。
4.血红蛋白的影响
用批号20090610、20090620、20090630批的试纸条测定不同添加血红蛋白样本，加入血红蛋白浓度为0mg/ml的样本作参照，其余各样本显色情况与之比较，若出现假阴性、阳性样本显色强度明显降低或背景洗脱不完全导致检测线无法辨认，则认为该浓度血红蛋白对检测结果有干扰。三批试纸条结果一致。
表6：三批试剂检测不同血红蛋白添加浓度标本的影响
| 添加浓度(mg/ml) | 0 | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 |
| 10份阴性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| 10份阳性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| L1 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| L2 | + | + | + | + | + | + | ± | - |
| L3 | ± | ± | ± | ± | ± | ± | - | - |
| L4 | - | - | - | - | - | - | - | - |
当血红蛋白添加至8mg/ml后，检测区洗脱不完全，背景明显变深，且灵敏度质控显色变浅至难以辨认。
临床重度溶血血红蛋白浓度＞5mg/ml。鉴于8mg/ml及以上浓度的血红蛋白对本方法测定抗-HAV IgM会造成假阴性，故重度溶血样本不能使用。
5.胆红素的影响
用批号20090610、20090620、20090630批的试纸条测定不同添加胆红素样本，加入胆红素浓度为0mg/l的样本作参照，其余各样本显色情况与之比较，若出现假阴性、阳性样本显色强度明显降低或背景洗脱不完全导致检测线无法辨认，则认为该浓度胆红素对检测结果有干扰。不同批次的试纸测定结果是一致的，见表7。
表7：三批试纸测定不同胆红素添加浓度标本的影响
| 添加浓度(mg/l) | 0 | 30 | 75 | 150 | 300 |
| 10份阴性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| 10份阳性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| L1 | + | + | + | + | + |
| L2 | + | + | + | + | + |
| L3 | ± | ± | ± | ± | ± |
| L4 | - | - | - | - | - |
正常人血清中总胆红素(T.Bil)范围为2.98～10.0mg/l，重度黄疸病人范围为200～300mg/l。实验证实，血清中的胆红素浓度高达300mg/l时，对抗-HAV IgM的测定仍然没有显著干扰，此含量已远高出一般黄疸病人的含量，因此，黄疸血清样本对本试剂盒测定基本没有影响。
6.胆固醇的影响
用批号20090610、20090620、20090630批的试纸条测定不同添加胆固醇样本，加入胆固醇浓度为0mg/l的样本作参照，其余各样本显色情况与之比较，若出现假阴性、阳性样本显色强度明显降低或背景洗脱不完全导致检测线无法辨认，则认为该浓度胆固醇对检测结果有干扰。不同批次的试纸测定结果是一致的，见表8。
表8：三批试纸测定不同胆固醇添加浓度标本的影响
| 添加浓度(mg/ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 10份阴性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| 10份阳性 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| L1 | + | + | + | + | + | + |
| L2 | + | + | + | + | + | + |
| L3 | ± | ± | ± | ± | ± | ± |
| L4 | - | - | - | - | - | - |
正常人胆固醇范围1.2-2.3mg/ml(3.1-5.95mmol/l)，实验结果表明，血清中胆固醇含量达到10g/L，显色没有明显的趋势性变化，此含量已远高出一般高血脂病人的含量，因此，血清中胆固醇对本试剂盒没有干扰。
7.甘油三脂的影响
用非肝炎高血脂病人血清与正常人血清按不同比例混合，得到不同浓度甘油三脂系列血清，详见表9。再用于配制不同的弱阳性与阴性样本。
表9不同浓度甘油三脂血清配制
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 高血脂病人血清加入量ml | 0 | 0.4 | 1.5 | 2 | 3 | 3.5 | 4 |
| 正常人血清加入量ml | 4 | 4 | 3 | 2 | 1.5 | 1 | 0 |
| 混合后甘油三酯浓度mmol/l | 0.72 | 1.34 | 3.01 | 4.16 | 5.31 | 6.07 | 7.6 |
用批号20090610、20090620、20090630批的试纸条测定不同甘油三脂含量样本，以1号样本组(即甘油三酯浓度0.72mmol/l)作参照，其余各样本组显色情况与之比较，若出现假阴性、阳性样本显色强度明显降低或背景洗脱不完全导致检测线无法辨认，则认为该浓度胆固醇对检测结果有干扰。结果三批试纸表现相同。
表10：不同批试剂检测不同甘油三脂添加浓度标本的影响
| 甘油三酯浓度(mmol/l) | 0.72 | 1.34 | 3.01 | 4.16 | 5.31 | 6.07 | 7.6 |
| 正常人样本 | - | - | - | - | - | - | - |
| 强阳性样本 | + | + | + | + | + | + | + |
| 弱阳性样本 | ± | ± | ± | ± | ± | ± | ± |
临床上血清中甘油三脂正常高限为1.7mmol/L，本实验结果表明，血清中甘油三脂含量到7.6mmol/l时显色没有明显的趋势性变化，此含量已远高出一般高血脂病人的含量，因此，血清中甘油三酯对本试剂盒没有干扰。
8.不精密度评估
使用20090610、20090620、20090630批次的胶体金法试纸条，每个批次重复测定了质控样品10条，结果均为阳性且各批次内与批次间显色强度一致，表明试剂的批内不精密度与批间不精密度较好。
Claims (3)
1.一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固相膜制备：用缓冲液将检测线划膜液鼠抗人IgM稀释至1-2mg/ml，将质控线划膜液稀释至2-4mg/ml，按1μl/cm的浓度在硝酸纤维素膜的中部划出两条水线，所述缓冲液为pH值7.4的PB，所述检测线划膜液为鼠抗人IgM溶液，所述质控线划膜液为羊抗鼠溶液；
(2)胶体金偶联：按5-10μg蛋白∶1ml胶体金的投料比将HAV抗体偶联在胶体金上，离心去除多余的抗体，再按1∶10-1∶40的比例投入HAV抗原，室温反应后，离心去除多余的抗原，即得胶体金-抗体-抗原偶联复合物，将偶联复合物铺于金标垫上，37℃干燥备用，为检测垫；
(3)质控流动相制备：按10-20μg蛋白∶1ml胶体金的投料比将质控流动相蛋白偶联在胶体金上，离心去除多余的蛋白，37℃干燥备用，为质控垫，所述质控流动相为鼠IgG；
(4)粘贴制备大板：将上吸水纸、固相膜、检测垫、质控垫、样品垫依次粘贴在底板上；
(5)分切小条：按2.5-4mm的宽度将大板切为小条，为试纸条；
(6)将小条放在上下两片的塑料卡座中，塑料卡座在固相膜与样品垫处有两个窗口，为观测窗与加样窗；
(7)单人份内包装：将试纸条或检测卡封装于铝箔袋中，袋中还需要加上一片干燥剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的底板上粘贴保护性或指标性的不干胶条。
3.一种快速检测甲型肝炎病毒IgM抗体的试剂盒，其特征在于，其由权利要求1或2所述的方法制备而成。
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Granted publication date: 20150204 |