CN110261597A - 一种ia-2自身抗体检测试条 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种IA‑2自身抗体检测试条,包括底板,所述底板上依次设置有样品垫,结合垫,反应膜,吸水垫和设置在所述反应膜上的第一检测带、第二检测带;所述结合垫上包被有被荧光标记且能与IA‑2自身抗体结合的第一物质,以及被荧光标记的第二物质;所述第一检测带上包被有能与所述IA‑2自身抗体结合的第三物质;所述第二检测带上包被有能与所述第二物质发生结合的第四物质。该试条操作方便,检测成本低,能够对血液中酪氨酸磷酸酶IA‑2自身抗体浓度进行快速、定量的检测,大大提高了筛查速度,具有灵敏度高、特异性好和结构简单的优点。
Description
技术领域
本发明涉及糖尿病检测技术领域,特别涉及一种IA-2自身抗体检测试 条。
背景技术
Ⅰ型糖尿病被称为胰岛素依赖型糖尿病,其是由机体产生异常的自身免 疫应答而引起的胰腺β细胞损伤、胰岛素分泌减少的一种疾病,多数患者都 在儿童或青少年时期发病。成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)属于Ⅰ型 糖尿病的一种亚型,其早期临床表现与Ⅱ型糖尿病相似,但发病机制属于Ⅰ 型,都是以β细胞遭受自身免疫损害为特征。近年来对于血糖管理及并发症 的研究都已经深入,但是疾病的病理过程还尚不清楚。随着我国糖尿病病人 数量的逐年增加,对于Ⅰ型糖尿病的研究也越来越重要。
IA-2自身抗体属于与Ⅰ型糖尿病相关的胰岛细胞自身抗原的酪氨酸磷酸 酶类分子家族,其为跨膜蛋白,由胞外区、胞内区及跨膜区组成。有研究发 现酪氨酸磷酸酶在胰岛素受体信号途径、胰岛素分泌和胰腺β细胞受自身免 疫细胞攻击等生理或病理过程中起重要作用,而IA-2自身抗体的胞内磷酸酶 结构域被认为是大量Ⅰ型糖尿病患者的自身免疫原,所以IA-2自身抗体的检 测对于发展早期诊断并预防Ⅰ型糖尿病有非常重要的意义。
目前国内对于Ⅰ型糖尿病自身抗体检测的手段相对缺乏,而快速诊断自 身抗体指标的产品十分稀少,已有的方法或产品大部分基于放射配体法或酶 联免疫法,其操作繁琐,测试时间长,而且需要特殊的仪器和专业操作技 术,且仪器投放价格较昂贵,不适合临床快速经济的检测。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种快速测定IA-2自身抗体的检测试 条,该试条操作方便,检测成本低,能够对血液中酪氨酸磷酸酶IA-2自身抗 体浓度进行快速、定量的检测,大大提高了筛查速度,具有灵敏度高、特异 性好和结构简单的优点。
本发明所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,包括底板,所述底 板上依次设置有样品垫,结合垫,反应膜,吸水垫和设置在所述反应膜上的 第一检测带、第二检测带;所述结合垫上包被有被荧光标记且能与IA-2自身 抗体结合的第一物质,以及被荧光标记的第二物质;所述第一检测带上包被有 能与所述IA-2自身抗体结合的第三物质;所述第二检测带上包被有能与所述 第二物质发生结合的第四物质。
优选的,所述第一物质为被荧光标记的抗人IgG抗体,所述第三物质 IA-2抗原一或者IA-2抗原二。
优选的,所述第一物质为被荧光标记的IA-2抗原一,所述第三物质为抗 人IgG抗体,或者IA-2抗原二;
或者,所述第一物质为被荧光标记的IA-2抗原二,所述第三物质为抗人 IgG抗体,或者IA-2抗原一。
优选的,所述第二物质与所述第四物质的结合组合为以下六种中的任一 种:
被荧光标记的抗卵清蛋白单抗一与其抗原的结合物,和,抗卵清蛋白单 抗二的组合;或者,被荧光标记的抗卵清蛋白单抗二与其抗原的结合物, 和,抗卵清蛋白单抗一的组合;或者,被荧光标记的鸡-IGY,和,羊抗鸡 IGY的组合;或者,被荧光标记的羊抗鸡IGY,和,鸡IGY的组合;或者, 被荧光标记的鼠-IGY,和,羊抗鼠-IGY的组合;或者,鼠-IGY,和,被荧光标记的羊抗鼠-IGY的组合。
优选的,所述IA-2抗原一,和/或,所述IA-2抗原二为天然或重组的IA-2 完整抗原、抗原片段、或抗原片段组合中的一种。
优选的,所述用于标记的荧光物质为荧光乳胶颗粒、量子点、荧光素、 或用于时间分辨的荧光信号物质中的一种。
优选的,所述荧光素为罗丹明、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄 素叶绿素蛋白或碘化丙啶中的一种。
优选的,所述样品垫与所述结合垫、所述结合垫与所述反应膜、所述反 应膜与所述吸水垫之间均重叠1.0-2.0mm。
优选的,所述底板为半硬质塑料、硬质塑料或硬纸片中的一种。
优选的,所述反应膜的材质为硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、或尼龙 膜中的一种。
本发明提供的IA-2自身抗体检测试条,使用时,将样品滴加到样品垫上, 在吸水垫的作用下,样品由样品垫流动至结合垫,此时,包被在结合垫中的 第一物质可与样品中的IA-2自身抗体产生特异性结合形成复合物,复合物再 通过毛细血管作用流到反应膜上的T线位置,此时带有IA-2自身抗体的复合 物会和固化有第三物质的T线发生特异性结合,即,带有IA-2自身抗体的复 合物被T线捕获。样品中待测物IA-2自身抗体越多,T线捕获的复合物就越 多,荧光信号强度就越高,通过免疫分析仪对荧光信号进行处理就能定量计算出样品中的IA-2抗体的含量。而无论样品中是否含有IA-2自身抗体,被荧 光标记的第二物质都会与固化有第四物质的C线发生特异性结合,即,第二 物质会被C线捕获并产生一定强度的荧光信号,作为质控信号,以此判断试 条是否有效,防止因检测试条变质而造成检测失误,提高测试的可靠性,保 证检测的正常进行。本发明中吸水垫的作用在于提高测试样本的流动速度, 提高测试的速率和可靠性,同时吸水垫也可以防止测试完成后遗留样本溶液 的泄漏污染。本发明提供的检测试条,操作方便,检测成本低,能够对血液 中酪氨酸磷酸酶IA-2自身抗体浓度进行快速、定量的检测,大大提高了筛查 速度,具有灵敏度高、特异性好和结构简单的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面 描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员 来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述IA-2自身抗体检测试条的示意图;
图2为实施例5中IA-2自身抗体检测试条的性能分析图;
其中,1-底板,2-样品垫,3-结合垫,4-反应膜,41-第一检测带,42-第 二检测带,5-吸水垫。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合 具体实施例对本申请进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是 本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领 域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都 应当属于本申请保护的范围。
如图1所示,本发明提供的IA-2自身抗体检测试条,包括底板1,底板1 上依次设置有样品垫2,结合垫3,反应膜4,吸水垫5和设置在反应膜4上 的第一检测带41、第二检测带42;结合垫3上包被有被荧光标记且能与IA-2 自身抗体结合的第一物质,以及被荧光标记的第二物质;第一检测带41上包 被有能与IA-2自身抗体结合的第三物质;第二检测带42上包被有能与第二物 质发生结合的第四物质。
本发明提供的IA-2自身抗体检测试条,使用时,将样品滴加到样品垫2 上,在吸水垫5的作用下,样品由样品垫2流动至结合垫3,此时,包被在结 合垫3中的第一物质可与样品中的IA-2自身抗体产生特异性结合形成复合 物,复合物再通过毛细血管作用流到反应膜4上的T线位置,此时带有IA-2 自身抗体的复合物会和固化有第三物质的T线发生特异性结合,即,带有 IA-2自身抗体的复合物被T线捕获。样品中待测物IA-2自身抗体越多,T线捕获的复合物就越多,荧光信号强度就越高,通过免疫分析仪对荧光信号进 行处理就能定量计算出样品中的IA-2抗体的含量。而无论样品中是否含有 IA-2自身抗体,被荧光标记的第二物质都会与固化有第四物质的C线发生特 异性结合,即,第二物质会被C线捕获并产生一定强度的荧光信号,作为质 控信号,以此判断试条是否有效,防止因检测试条变质而造成检测失误,提 高测试的可靠性,保证检测的正常进行。本发明中吸水垫5的作用在于提高测试样本的流动速度,提高测试的速率和测试的可靠性,同时吸水垫5也可 以防止测试完成后遗留样本溶液的泄漏污染。本发明提供的检测试条,操作 方便,检测成本低,能够对血液中酪氨酸磷酸酶IA-2自身抗体浓度进行快 速、定量的检测,大大提高了筛查速度,具有灵敏度高、特异性好和结构简 单的优点。
需要说明的是,本发明中的第一物质能与IA-2自身抗体发生特异性结 合,但是不与第二、第三、以及第四物质发生结合;本发明中的第二物质能 与第四物质发生特异性结合,但是不与第一、第三物质发生特异性结合;本 发明中的第三物质能与IA-2自身抗体发生特异性结合,但是不与第一、第 二、以及第四物质发生特异性结合;本发明中的第四物质能与第二物质发生 特异性结合,但是不与第一、第三物质发生结合。
作为优选,在本发明的具体实施例中,当第一物质为被荧光标记的抗人 IgG抗体时,第三物质为IA-2抗原一或者IA-2抗原二;当第一物质为被荧光 标记的IA-2抗原一时,第三物质可以是抗人IgG抗体,或者IA-2抗原二。当 第一物质为被荧光标记的IA-2抗原二时,第三物质可以是抗人IgG抗体,或 者IA-2抗原一。其中,抗人IgG抗体属于抗IA-2抗体的二抗。
本发明的检测原理为膜层析技术、双抗原夹心法、以及抗原和二抗夹心 法。本发明利用IA-2自身抗体与IA-2抗原一、IA-2抗原二或者抗人IgG抗 体的夹心结合实现IA-2自身抗体的检测。
在本发明的具体实施例中,第二物质与第四物质的结合组合可以为以下 六种组合中的任一种:
被荧光标记的抗卵清蛋白单抗一与其抗原的结合物,和,抗卵清蛋白单 抗二的组合;或者,被荧光标记的抗卵清蛋白单抗二与其抗原的结合物, 和,抗卵清蛋白单抗一的组合;或者,被荧光标记的鸡-IGY,和,羊抗鸡 IGY的组合;或者,被荧光标记的羊抗鸡IGY,和,鸡IGY的组合;或者, 被荧光标记的鼠-IGY,和,羊抗鼠-IGY的组合;或者,鼠-IGY,和,被荧光标记的羊抗鼠-IGY的组合。
作为优选,IA-2抗原一,和/或,IA-2抗原二可以为天然或重组的IA-2 完整抗原、抗原片段、或抗原片段组合中的一种。
用于标记的荧光物质可以为荧光乳胶颗粒、量子点、荧光素、或用于时 间分辨的荧光信号物质中的一种。
进一步的,荧光素可以为罗丹明、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻 黄素叶绿素蛋白或碘化丙啶中的一种。
本发明的具体实施方式中,为保证检测样品在样品垫2、结合垫3、反应 膜4以及吸水垫5之间能够可靠、快速流动,可以使样品垫2与结合垫3、结 合垫3与反应膜4、反应膜4与吸水垫5之间均重叠1.0-2.0mm。当然,即使 设置其他重叠度也可实现相应的检测功能,只是可能影响测试效率或浪费样 本。
为了保证底板1的支撑作用,本发明实施例中底板1可以为半硬质塑 料、硬质塑料或硬纸片中的一种,优选使用PVC底板1。
反应膜4的材质可以是硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、或尼龙膜中的 一种。
实施例1:IA-2自身抗体检测试条的制备
1)荧光乳胶颗粒标记蛋白及结合垫的制备
取2管洗涤好的2%固含乳胶颗粒溶液20ml,超声波处理30秒-1分钟, 分别先后加入0.2M NHS和0.2M EDC溶液各30ul,并混合均匀,置于8℃摇 床中,100转/分钟处理1小时,然后将溶液取出,置于离心管内,称重,再离 心弃上清,加入超纯水至原重再将颗粒重悬的洗涤方式,洗涤3-5遍,取 2mg IA-2抗原一加入其中一个离心管内,另一个离心管内加入2mg抗卵清蛋 白单克隆抗体一,混合均匀后,在8℃,100转/分钟的摇床内孵育24小时。 孵育完成后,在两个离心管内分别加入颗粒悬浮液(PH值7.4的0.01MPB+5% 海藻糖+1%PEG6000+1%酪蛋白)80ml。如此,便能制备出被荧光标记的IA-2 抗原一以及被荧光标记的抗卵清蛋白单抗一。将两种颗粒和抗卵清蛋白单抗 一的抗原按一定比例混合均匀,涂覆到结合垫上,250ul颗粒涂覆到300mm 长结合垫上,冻干后干燥保存。
2)反应膜的制备:
分别将IA-2抗原二和抗卵清蛋白单克隆抗体二,各用(0.01MPB+3%海藻 糖)包被缓冲液稀释成1.0-2.0mg/ml,使用量为36ul/30cm,用喷膜机喷膜包 被,使其固定在硝酸纤维素膜(赛多利斯95膜)上,37℃烘箱烘干16h,装 袋,备用。
3)样品垫制备
配制样品垫液(PH值7.4的0.02MPB+0.1%TW20),铺至18cm*30cm 玻璃纤维上,每张玻璃纤维铺置的量为40ml,充分浸润,沥干,37℃烘干 16h,烘干后将玻璃纤维用斩切机将其裁成29mm*300mm大小,加干燥剂装 铝箔袋封口保存。
4)检测试条的组装
将样品垫,包被好的反应膜,结合垫,以及吸水垫依次贴到PVC底板 上,按测试要求均匀切成适当宽度的膜条,装壳后可用于临床样品检测。
实施例2:
实施例2中检测试条的制备流程与实施例1相同。但是实施例2将结合 垫制备过程中加入的IA-2抗原一换成抗人IgG抗体。
实施例3:
实施例3中检测试条的制备流程与实施例1相同。但是实施例3将结合 垫制备过程中加入的抗卵清蛋白单抗一换成鸡IgY,省略加入抗卵清蛋白单抗 一的抗原的步骤;将反应膜制备过程中加入的抗卵清蛋白单克隆抗体二换成羊 抗鸡IgY。
实施例4:
实施例4中检测试条的制备流程与实施例1相同。但是实施例4将反应 膜制备过程中加入的IA-2抗原二换成抗人IgG抗体。
实施例5:IA-2自身抗体检测试条的性能检测
取医院放射配体法测试的样本,测试值分别是0.105、0.236、0.521、 0.762、1.063、1.585、1.962,取实施例4制备的试条,每个浓度测试7次, 将样本用PBS(PH值7.4,0.02M)稀释10倍(20ul样本加入到180ul PBS 缓冲液中,充分混匀),取100ul混匀后的样本滴加到检测试条上,反应5分 钟后读取结果。检测结果如表1所示:
表1.IA-2自身抗体检测试条的性能检测:
以医院放射配体法得到的测试值(xi)为自变量,以本发明提供 的检测试条检测得到的结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。 计算线性回归的相关系数(R2),其结果如图2所示。
以上结果表明,采用本发明提供的检测试条对IA-2自身抗体样品进行检 测,测试线性R2>0.99,变异系数CV﹤10%。表明,本发明提供的检测试条 在检测浓度为0.1~2ug/L之间呈现良好的线性关系,且检测的精密度良好。
实施例6:临床样本准确度检测
取酪氨酸磷酸酶IA-2自身抗体临床检测血样10份,使用实施例4制作的 检测试条,进行临床血液标本测试。检测结果如表2所示:
表2.临床样本检测结果:
由表2结果可知,采用本发明提供的检测试条对IA-2自身抗体样品进行 检测时,测试偏差﹤15%,具有较高的准确度。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况 下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实 施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,包括底板,所述底板上依次设置有样品垫,结合垫,反应膜,吸水垫和设置在所述反应膜上的第一检测带、第二检测带;
所述结合垫上包被有被荧光标记且能与IA-2自身抗体结合的第一物质,以及被荧光标记的第二物质;
所述第一检测带上包被有能与所述IA-2自身抗体结合的第三物质;
所述第二检测带上包被有能与所述第二物质发生结合的第四物质。
2.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述第一物质为被荧光标记的抗人IgG抗体,所述第三物质为IA-2抗原一或者IA-2抗原二。
3.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,
所述第一物质为被荧光标记的IA-2抗原一,所述第三物质为抗人IgG抗体,或者IA-2抗原二;
或者,所述第一物质为被荧光标记的IA-2抗原二,所述第三物质为抗人IgG抗体,或者IA-2抗原一。
4.根据权利要求2或3所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述IA-2抗原一,和/或,所述IA-2抗原二为天然或重组的IA-2完整抗原、抗原片段、或抗原片段组合中的一种。
5.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述第二物质与所述第四物质的结合组合为以下六种组合中的任一种:
被荧光标记的抗卵清蛋白单抗一与其抗原的结合物,和,抗卵清蛋白单抗二的组合;
或,被荧光标记的抗卵清蛋白单抗二与其抗原的结合物,和,抗卵清蛋白单抗一的组合;
或,被荧光标记的鸡-IGY,和,羊抗鸡IGY的组合;
或,被荧光标记的羊抗鸡IGY,和,鸡IGY的组合;
或,被荧光标记的鼠-IGY,和,羊抗鼠-IGY的组合;
或,被荧光标记的羊抗鼠-IGY,和,鼠-IGY的组合。
6.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述用于标记的荧光物质为荧光乳胶颗粒、量子点、荧光素、或用于时间分辨的荧光信号物质中的一种。
7.根据权利要求6所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述荧光素为罗丹明、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白或碘化丙啶中的一种。
8.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述样品垫与所述结合垫、所述结合垫与所述反应膜、所述反应膜与所述吸水垫之间均重叠1.0-2.0mm。
9.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述底板为半硬质塑料、硬质塑料或硬纸片中的一种。
10.根据权利要求1所述的IA-2自身抗体检测试条,其特征在于,所述反应膜的材质为硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜、或尼龙膜中的一种。
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