CN106053824A - 胰腺癌双联检测试剂盒 - Google Patents

胰腺癌双联检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及胰腺癌双联检测试剂盒，包括a.CA19‑9试纸条：包括含有显色标记的鼠抗人CA19‑9抗体的CA19‑9金垫，以及含有鼠抗人CA19‑9抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜；b.间皮素试纸条：包括含有显色标记的鼠抗人间皮素抗体的间皮素金垫，以及含有鼠抗人间皮素抗体检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。本发明的双联检测试剂盒具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

胰腺癌双联检测试剂盒
[技术领域]
本发明涉及一种肿瘤标志物的检测试剂盒，具体涉及胰腺癌双联检测试剂盒。
[背景技术]
近年来，随着我国经济迅猛发展，胰腺癌发病率也快速上升，目前男性发病率达6/10万，女性发病率达4/10万。5年生存率约5％，甚至用药治疗维持生命也仅5～6个月，其病死率居于第4位。经临床研究证实，早期胰腺癌手术治疗切除率大于90％，5年生存率提高至37％。然而胰腺癌早期筛查困难，目前主要依靠血清肿瘤标志物检查和影像学检查。由于早期胰腺肿瘤直径≤2cm(厘米)，影像学检查敏感性和特异性不高，难以发现早期肿瘤。而血清肿瘤标志物在肿瘤较小时就能检测到，具有检测简便、创伤小、客观，在胰腺癌的早期筛查、临床诊断、疗效评估、病情监测及预后判断等方面有较好的临床应用价值。
目前检测胰腺癌肿瘤标志物的主要方法是酶联免疫吸附法和化学发光法。
酶联免疫吸附法：使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
化学发光法：其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
与酶联免疫法和化学发光法相比，胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，只需10min即可筛查胰腺癌，因而特别适合广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等,具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，特别适合我国国情。
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种CA19-9和间皮素联合检测快速筛查胰腺癌的方法，免疫层析法：一份样品在检测装置的毛细管作用的带动下与标记好检测抗体的可见颗粒(胶体金、乳胶、量子点、荧光微球或酶促反应)流经由捕获抗体时发生免疫反应而形成的可见检测线或者检测斑点。该方法具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
[发明内容]
本发明的目的在于提供一种CA19-9和间皮素联合检测快速筛查胰腺癌的方法，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
为了实现上述目的，发明一种胰腺癌双联检测试剂盒，包括：
a.CA19-9试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人CA19-9抗体的CA19-9金垫，以及含有鼠抗人CA19-9抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，
b.间皮素试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人间皮素抗体的间皮素金垫，以及含有鼠抗人间皮素抗体检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
该检测试剂盒还具有如下优化方案：
所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记鼠抗人CA19-9抗体和鼠抗人间皮素抗体。
CA19-9试纸条还包括样本垫、底板、吸水纸、滤血膜。更进一步的，CA19-9试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、吸水纸和滤血膜设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接CA19-9金垫，CA19-9金垫另一侧搭接样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
间皮素试纸条还包括样本垫、底板、吸水纸、滤血膜。更进一步的，间皮素试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、吸水纸和滤血膜设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接间皮素金垫，间皮素金垫另一侧搭接样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有双联卡槽。
CA19-9试纸条的检测线中鼠抗人CA19-9抗体的浓度由健康人群血液中CA19-9的浓度分布阈值确定。
间皮素试纸条的检测线中鼠抗人间皮素抗体的浓度由健康人群血液中间皮素的浓度分布阈值确定。
本发明的双联检测试剂盒通过检测全血/血清/血浆中的CA19-9和间皮素蛋白是否超过阈值来筛查胰腺癌，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
[附图说明]
图1为胰腺癌阳性时试剂盒的显色示意图；
图2为胰腺癌疑似时试剂盒的显色示意图；
图3为另一胰腺癌疑似时试剂盒的显色示意图；
图4为胰腺癌阴性时试剂盒的显色示意图；
图5为需重新测试时试剂盒的显色示意图；
图6为胰腺癌双联检测试剂盒的结构示意图。
[具体实施方式]
以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步的说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。
阈值确定
健康人群总体CA19-9参考值为37u/ml，间皮素参考值为9ng/ml；根据上述阈值，该阈值参考：
[1]王洛伟，李兆申，余志良，周国中.血清CA19-9水平对胰腺癌的诊断价值.解放军医学杂志.Volume 27:4,2002(4)；
[2]RaffitHassan,Alan T.Remaley,Maureen L.Sampson.Detection andQuantitation of Serum Mesothelin,a Tumor Marker for Patients withMesothelioma and Ovarian Cancer.Clin Cancer Res.2006；12:447–53
制备CA19-9和间皮素联合检测筛查胰腺癌的检测卡的工艺如下：
1主要材料
1.1鼠抗人CA19-9抗体A1、A2和鼠抗人间皮素抗体B1、B2(A1:名称CA19-9Monoclonal Antibody,货号A46300489P,厂家Biospacific；A2:名称CA19-9MonoclonalAntibody,货号A46400489P,厂家Biospacific；B1:名称Anti-Mesothelin antibody,货号ab53285,厂家abcam；B2:名称Anti-Mesothelin antibody,货号ab99474,厂家abcam)，经过转染小鼠表达纯化获得，分别用于标记和检测；羊抗鼠IgG抗体：Sigma公司产品，用于硝酸纤维素膜质控线或者质控斑点包被；硝酸纤维素膜：MILLIPORE公司产品；JY-Q01全血滤膜(用3mg/ml兔抗体人RBC处理)、样本垫、结合垫、吸水纸、PVC底板和双联卡壳：上海杰一生物技术有限公司
2方法
2.1CA19-9抗体A1、间皮素抗体B1的标记以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记鼠抗人CA19-9抗体A1和鼠抗人间皮素抗体B1；以不同浓度的PEG、BSA及其他有封闭效果的蛋白或者高分子聚合物分别对标记物进行封闭；标记结束后以10000rpm离心，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS+5％BSA+5％蔗糖)稀释至原溶液体积的1/10；然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)将处理好的标记溶液按2ul/cm分别喷涂在无纺布或者 玻璃纤维或者聚酯膜上制成CA19-9金垫和间皮素金垫，25℃真空干燥3小时将标记物固相化。
2.2CA19-9抗体A2、间皮素抗体B2的包被用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS+5％蔗糖)将鼠抗人CA19-9抗体A2、鼠抗人间皮素抗体B2和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至1mg/ml，然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)把鼠抗人CA19-9抗体A2(检测线T1)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成CA19-9膜，把鼠抗人间皮素抗体B2(检测线T2)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成间皮素膜，包被完后将CA19-9膜和间皮素膜在温度37℃，相对湿度在＜25％的干燥间干燥12小时将包被物进行固相化。
2.3CA19-9试纸条组装(图6)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的CA19-9膜2放置在PVC底板1中部粘贴，在CA19-9膜T1线一侧搭接CA19-9金垫3(搭接CA19-9膜2mm)，在CA19-9金垫另一侧搭接粘贴上样本垫4(搭接CA19-9金垫1/5),在样本垫上搭接全血滤膜5(搭接样本垫4/5)；在CA19-9膜C线一侧搭接吸水纸6(搭接CA19-9膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入双联卡的CA19-9卡槽内。
2.4间皮素试纸条组装(图6)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的间皮素膜2放置在PVC底板1中部粘贴，在间皮素膜T1线一侧搭接间皮素金垫(3)(搭接间皮素膜2mm)，在间皮素金垫另一侧搭接粘贴上样本垫4(搭接间皮素金垫1/5),在样本垫上搭接全血滤膜5(搭接样本垫4/5)；在间皮素膜C线一侧搭接吸水纸6(搭接间皮素膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入双联卡的间皮素卡槽内。
3检测步骤1将试剂盒和待测样本取出，平衡至室温；步骤2打开密封 的铝箔袋，将检测卡取出平放在实验台上；步骤3用滴管或者移液器取2-3滴或者60-90ul样本滴加在加样孔7；步骤4 10-15分钟后判读。
4结果
当样本中的CA19-9和间皮素蛋白浓度超过阈值时，检测线T1和T2均显色(图1)，则为胰腺癌阳性；
当样本中的CA19-9蛋白浓度超过阈值而间皮素蛋白浓度没超过阈值时，检测线T1显色而T2不显色(图2)则为疑是胰腺癌患者，需进一步确诊；
当样本中的CA19-9蛋白浓度没超过阈值而间皮素蛋白浓度超过阈值时，检测线T1不显色而T2显色(图3)则为疑是胰腺癌患者，需进一步确诊；
当样本中的CA19-9和间皮素蛋白浓度均没超过阈值时，检测线T1和T2均不显色(图4)则为胰腺癌阴性；
当质控区C未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏,在任何情况下，应重新测试(图5)。

Claims (9)

1.一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于包括：
a.CA19-9试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人CA19-9抗体的CA19-9金垫，以及含有鼠抗人CA19-9抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，
b.间皮素试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人间皮素抗体的间皮素金垫，以及含有鼠抗人间皮素抗体检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
2.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记鼠抗人CA19-9抗体和鼠抗人间皮素抗体。
3.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于CA19-9试纸条还包括样本垫、底板、吸水纸、滤血膜。
4.如权利要求3所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于CA19-9试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、吸水纸和滤血膜设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接CA19-9金垫，CA19-9金垫另一侧搭接样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
5.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于间皮素试纸条还包括样本垫、底板、吸水纸、滤血膜。
6.如权利要求5所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于间皮素试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、吸水纸和滤血膜设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接间皮素金垫，间皮素金垫另一侧搭接样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
7.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有双联卡槽。
8.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于在CA19-9试纸条中，其检测线中鼠抗人CA19-9抗体的浓度由健康人群血液中CA19-9的浓度分布阈值确定。
9.如权利要求1所述的一种胰腺癌双联检测试剂盒，其特征在于间皮素试纸条中，其检测线中鼠抗人间皮素抗体的浓度由健康人群血液中间皮素的浓度分布阈值确定。
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