CN114686592B - 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法 - Google Patents

一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114686592B
CN114686592B CN202210595605.4A CN202210595605A CN114686592B CN 114686592 B CN114686592 B CN 114686592B CN 202210595605 A CN202210595605 A CN 202210595605A CN 114686592 B CN114686592 B CN 114686592B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescent
antibody
suspension
detection
molecular beacon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210595605.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114686592A (zh
Inventor
唐勇
路程
肖威
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Zhongxin Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Zhongxin Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Zhongxin Biotechnology Co ltd filed Critical Guangdong Zhongxin Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210595605.4A priority Critical patent/CN114686592B/zh
Publication of CN114686592A publication Critical patent/CN114686592A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114686592B publication Critical patent/CN114686592B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法。该试剂盒包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，荧光分子信标悬液中包含荧光miR‑21分子信标；结合垫设有miRNA检测区。该试剂盒能够实现细胞外囊泡膜蛋白和miRNA联合检测，检测速度快、准确率高。检测时，使细胞外囊泡与囊泡融合，对细胞外囊泡的尺寸进行扩大，提高检测稳定性。

Description

一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法。
背景技术
细胞外囊泡是由哺乳动物细胞主动向细胞外释放的纳米级双层囊泡小体，直径一般在30-150nm之间。细胞外囊泡的内含物中包含核酸（DNA、mRNA、microRNA、IncRNA、circRNA等）、蛋白质和脂质等成分。由于磷脂双分子层的包裹，细胞外囊泡内含物可以较稳定地存在于机体的体液中，并跟随体液循环到达身体的不同部位，实现细胞间的远距离通讯。几乎所有动物体液中都有检测到细胞外囊泡的存在，主要包括血液、尿液、脑脊液、唾液、胸腔积液、腹水和羊水。现阶段，细胞外囊泡以其取样方式安全灵活、无创便捷、可以规律反复多次取样、依从性高等特点而在液体活检领域迅速发展。
近年来，研究者们针对细胞外囊泡检测开发了多种生物传感器。其中，侧向层析（Lateral flow assays，LFA）是目前体外诊断中应用最广泛的方法，其具有成本低、操作简便、无需配合大型仪器与专业人员，在基层或偏远地区的临床诊断中也可得到充分利用，非常适合用于对疾病的大规模筛查。现已有多个研究团队针对细胞外囊泡体外诊断开发了LFA方法。Myriam Oliveira-Rodríguez等人在2016年首次通过以胶体金为信号物，CD9和CD63双抗体夹心检测原理构建了细胞外囊泡LFA试纸。经过对比优化，该试纸能够在15分钟内检测出细胞外囊泡的数量，LOD（最低检测限）为8.54×105个细胞外囊泡/mL。TingtingWu等人则通过让不同粒径的胶体金分子形成复合体，开发了细胞外囊泡胶体金信号增强试纸。上述基于胶体金信号与双抗体夹心原理的LFA试纸均为经典构建方法，但可视化信号读数的局限性在很大程度上限制了此类方法的最低检测限和有效线性检测范围。
虽然上述团队均利用双抗体夹心法实现了对细胞外囊泡的定量检测，但由于这些检测方法针对细胞外囊泡膜蛋白进行检测，仅能完成对细胞外囊泡总量测定，未充分利用细胞外囊泡所携带的多类型生物信息。Zhou等研究者于2020年首次报导了一种细胞外囊泡miRNA与膜蛋白检测的通用芯片，并通过将多路通道合并的方式进行多类型靶标联合分析。虽然这种多类型靶标联合分析方法有效将胰腺癌诊断的准确率从70%提高至100%，但其检测芯片仍然依赖于微流控系统，样品检测及信号读取步骤较为复杂，同时需要配合专业操作人员与大型设备。
可见，如何实现在LFA试纸上完成多类型靶标的联合检测，是目前制约该类产品发展的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种多类型靶标联合检测的试剂盒，该试剂盒能够实现细胞外囊泡膜蛋白和miRNA联合检测，检测速度快、准确率高。
本发明的目的在于提出一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，该制备方法步骤简单易操作；
本发明的目的在于提出一种试剂盒使用方法，使细胞外囊泡与囊泡融合，对细胞外囊泡的尺寸进行扩大，提高检测稳定性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种多类型靶标联合检测的试剂盒，包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；
所述标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，所述质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述荧光分子信标悬液中包含荧光miR-21分子信标；
所述试纸条包括依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，且两两之间均具有重叠部分；
所述结合垫设有miRNA检测区；沿由所述结合垫至所述吸水垫的方向，所述层析膜依次设有检测线和质控线；所述检测线由羊抗鼠IgG抗体形成，所述质控线由鸡IgY蛋白形成。
进一步的，所述标记抗体悬液中，所述抗EpCAM抗体的浓度为10-50μg/ml。
进一步的，所述质控抗体悬液中，所述羊抗鸡IgY抗体的浓度为10-50μg/ml。
进一步的，所述荧光分子信标悬液中还包含囊泡，所述囊泡内包裹有所述荧光miR-21分子信标。
一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，该方法用于制备上述的试剂盒，该方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述抗EpCAM抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成标记抗体悬液并冷藏；
（2）制备质控抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述羊抗鸡IgY抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成质控抗体悬液并冷藏；
（3）制备荧光分子信标悬液：根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在miR-21分子信标的5’端荧光基团和在3’端修饰淬灭基团得到荧光miR-21分子信标，将溶于缓冲液，之后加入囊泡，充分反应，得到荧光分子信标悬液并冷藏；
（4）制备试纸条：将羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白分别以喷金划膜仪以0.5-2μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，组装样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到试纸条。
进一步的，所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述荧光微球为铕荧光乳胶微球，以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对荧光微球进行表面活化；
所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与所述铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1~1:1。
进一步的，所述步骤（1）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用。
进一步的，所述步骤（2）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用。
进一步的，所述步骤（3）中，将1-10μg荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，之后加入将1-10μg囊泡，进行充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于3-5℃环境保存备用。
一种试剂盒使用方法，该方法用于上述的试剂盒，该方法包括以下步骤：
将收集的血浆与荧光分子信标悬液混合，并加入PEG融合诱导剂，孵育1-15分钟，得诱导混合液；
将标记抗体悬液、质控抗体悬液和诱导混合液混合均匀，得到待测样品；
随后将待测样品液滴加到试纸条的样品垫上；
反应10-20min后，分别以核酸检测光和蛋白检测光荧光照射试纸条， miRNA检测区、检测线和质控线之一或多个显色。
本发明提供的技术方案可以包括以下有益效果：
1、本发明的多类型靶标联合检测的试剂盒，具体以细胞外囊泡膜蛋白和miRNA联合检测。该检测方法改进以往细胞外囊泡检测试纸中对细胞外囊泡的单类型靶标检测模式，充分利用细胞外囊泡携带的多类型生物信息，在同一个侧向免疫层析检测平台中完成细胞外囊泡膜蛋白与miRNA两种类型靶标的联合检测，实现在膜蛋白与miRNA联合检测模式下对样本进行分析，提高细胞外囊泡检测试纸对癌症诊断的准确率；
2、本发明的荧光分子信标悬液中含有囊泡，囊泡内包裹荧光miR-21分子信标，在将待检测样滴于样品垫之前，以囊泡对待检测样中的细胞外囊泡尺寸进行放大。这是因为由于待检测样中的细胞外囊泡颗粒尺寸大小不一，在检测时仅有直径较小的囊泡可通过侧向层析快速流经检测线，直径较大的囊泡则容易被堵塞，导致检测稳定性较低。因此，本发明采用囊泡融合技术，在层析检测前先将细胞外囊泡与囊泡融合，对细胞外囊泡颗粒的粒径进行统一放大，使融合后细胞外囊泡颗粒直径达到1 μm以上，进而可以在侧向层析检测的过程中产生排阻，可在检测线上形成稳定的阻断信号。
附图说明
图1是本发明一个实施例的多类型靶标联合检测的试剂盒的检测原理图；
图2是铕荧光乳胶微球标记抗体后的透射电镜表征图；
图3是抗体与铕荧光乳胶微球结合量的检测结果图；
图4是实施例4中的检测结果示意图；
图5是测试例1的结果图；
图6是测试例2的外分泌体浓度图；
图7是测试例2的接受者操作特征曲线图；
图8是测试例3的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种多类型靶标联合检测的试剂盒，包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液和试纸条；标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，荧光分子信标悬液中包含荧光miR-21分子信标；试纸条包括依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，且两两之间均具有重叠部分；结合垫设有miRNA检测区；沿由结合垫至吸水垫的方向，层析膜依次设有检测线和质控线；检测线由羊抗鼠IgG抗体形成，质控线由鸡IgY蛋白形成。
本发明的多类型靶标联合检测的试剂盒，具体以细胞外囊泡膜蛋白和miRNA联合检测。该检测方法改进以往细胞外囊泡检测试纸中对细胞外囊泡的单类型靶标检测模式，充分利用细胞外囊泡携带的多类型生物信息，在同一个侧向免疫层析检测平台中完成细胞外囊泡膜蛋白与miRNA两种类型靶标的联合检测，实现在膜蛋白与miRNA联合检测模式下对样本进行分析，提高细胞外囊泡检测试纸对癌症诊断的准确率。
具体的，荧光miR-21分子信标是由茎部和环部组成的发夹装结构，荧光信号物与淬灭剂分别偶联在荧光miR-21分子信标的两端，即在miR-21分子信标的5’修饰荧光信号物，在3’修饰淬灭剂。其中，荧光信号物使用的是化学荧光素，优选为6-羧基荧光素（6FAM）；淬灭剂使用的是人工荧光淬灭剂，优选为黑洞猝灭基团（BHQ1）。在没有检测靶标的情况下，信标的茎部序列自配对形成稳定的回形结构，这种结构使荧光信号物与淬灭剂靠近，导致体系中无荧光产生。当体系中存在与荧光miR-21分子信标配对的检测靶标时，荧光miR-21分子信标与检测靶标会发生杂交，使荧光miR-21分子信标的发夹结构打开，进而使荧光信号物与淬灭剂分离，导致体系中产生荧光信号。
具体的，标记抗体悬液中，抗EpCAM抗体的浓度为10-50μg/ml；质控抗体悬液中，羊抗鸡IgY抗体的浓度为10-50μg/ml，以获得准确的检测结果。
需要说明的是，本发明中的荧光miR-21分子信标是由茎部和环部组成的发夹装结构，荧光信号物与淬灭剂分别偶联在荧光miR-21分子信标的两端。在没有检测靶标的情况下，信标的茎部序列自配对形成稳定的回形结构，这种结构使荧光信号物与淬灭剂靠近，导致体系中无荧光产生。当体系中存在与荧光miR-21分子信标配对的检测靶标时，荧光miR-21分子信标与检测靶标会发生杂交，使荧光miR-21分子信标的发夹结构打开，进而使荧光信号物与淬灭剂分离，导致体系中产生荧光信号。
更进一步说明，荧光分子信标悬液中还包含囊泡，囊泡内包裹有荧光miR-21分子信标。囊泡为天然或合成囊泡，优选为脂质体或模拟病毒中的一种或两种混合。
在将待检测样滴于样品垫之前，以囊泡对待检测样中的细胞外囊泡尺寸进行放大。这是因为由于待检测样中的细胞外囊泡颗粒尺寸大小不一，在检测时仅有直径较小的囊泡可通过侧向层析快速流经检测线，直径较大的囊泡则容易被堵塞，导致检测稳定性较低。因此，本发明采用囊泡融合技术，在层析检测前先将细胞外囊泡与囊泡融合，对细胞外囊泡颗粒的粒径进行统一放大，使融合后细胞外囊泡颗粒直径达到1 μm以上，同时囊泡内的荧光miR-21分子信标进入细胞外囊泡中，进而可以在侧向层析检测的过程中产生排阻，可在检测线上形成稳定的阻断信号。
如图1所示，本发明多类型靶标联合检测的试剂盒的检测原理为：首先使血浆中的细胞外囊泡和荧光分子信标悬液中囊泡的融合的诱导混合液，然后，将标记抗体悬液、质控抗体悬液和上述的诱导混合液混合均匀，才点样至样品垫；在吸水垫的虹吸作用下，样品沿样品垫、结合垫和层析膜移动，在结合垫的层析阻断作用下，融合囊泡停留在miRNA检测区，而羊抗鸡IgY抗体以及未与融合囊泡结合的抗EpCAM抗体继续沿层析膜移动，未与融合囊泡结合的抗EpCAM抗体则停留在检测线，羊抗鸡IgY抗体则继续移动直至停留在质控线。通过核酸检测光和蛋白检测光荧光照射试纸条即可观察miRNA检测区、检测线和质控线是否显色。若miRNA检测区显色，则证明血浆中含有miR-21，若检测线不显色，则证明血浆中含有EpCAM抗体。
相应的，本发明还提供一种试剂盒使用方法，该方法用于上述的试剂盒，该方法包括以下步骤：
将收集的血浆与荧光分子信标悬液混合，并加入PEG融合诱导剂，孵育1-15分钟，得诱导混合液；
将标记抗体悬液、质控抗体悬液和诱导混合液混合均匀，得到待测样品；
随后将待测样品液滴加到试纸条的样品垫上；
反应10-20min后，分别以核酸检测光和蛋白检测光荧光照射试纸条， miRNA检测区、检测线和质控线之一或多个显色。
在上述方法中，通过在血浆混合液与荧光分子信标悬液的混合液中加入PEG融合诱导剂并进行孵育，实现细胞外囊泡和荧光分子信标悬液中囊泡的融合，达到对细胞外囊泡尺寸放大的效果。需要说明的是，核酸检测光的波长为495nm，铕荧光微球（蛋白检测信号）的检测光波长为365nm。
相应的，本发明还提供一种多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法，该方法用于制备上述的试剂盒，该方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液：将活化后的荧光微球与抗EpCAM抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成标记抗体悬液并冷藏；
（2）制备质控抗体悬液：将活化后的荧光微球与羊抗鸡IgY抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成质控抗体悬液并冷藏；
（3）制备荧光分子信标悬液：根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在miR-21分子信标的5’端荧光基团和在3’端修饰淬灭基团得到荧光miR-21分子信标，将溶于缓冲液，之后加入囊泡，充分反应，得到荧光分子信标悬液并冷藏。
（4）制备试纸条：将羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白分别以喷金划膜仪以0.5-2μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，组装样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到试纸条。
上述的多类型靶标联合检测的试剂盒的制备方法步骤简单，各步骤易控制，能够适用于大规模生产。
进一步的，步骤（1）和步骤（2）中，荧光微球为铕荧光乳胶微球，以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对荧光微球进行表面活化；碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1~1:1。活化后铕荧光乳胶微球更容易结合于抗EpCAM抗体或羊抗鸡IgY抗体，且结合更牢固，能够提高检测的稳定性。
进一步的，步骤（1）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用。
进一步的，步骤（2）中，在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用。
其中的铕荧光乳胶微球为采购所得，铕荧光乳胶微球溶液的浓度为0.01-1mg/mL，可见，抗体与铕荧光乳胶微球的质量比为（1-100）：（0.1-10）。
参照图2，铕荧光乳胶微球与抗体结合后在透射电镜表征图上有明显的区别。参照图3，抗体与铕荧光乳胶微球的结合量与两者的质量比例有关，随着铕荧光乳胶微球的加入质量增加，抗体与铕荧光乳胶微球的结合量先上升后下降，在抗体与铕荧光乳胶微球的质量比在1：（1-3）时，抗体与铕荧光乳胶微球的结合量（即抗体标记率）较佳，抗体与铕荧光乳胶微球的质量比在1：2时有最优的抗体标记率。
进一步的，步骤（3）中，将1-10μg荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，之后加入将1-10μg囊泡，进行充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于3-5℃环境保存备用。由此，实现囊泡包裹荧光miR-21分子信标，以使荧光miR-21分子信标进入待检测样中的8细胞外囊泡中。
以下通过实施例和对比例进一步阐述本发明。
实施例1多类型靶标联合检测的试剂盒和制备方法
本实施例的制备方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为5:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用1 mL缓冲液重悬沉淀，并加入50 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用1mL标记抗体复溶液（含1%-10% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬得到封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（2）制备质控抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为5:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用1 mL缓冲液重悬沉淀，并加入50 μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液（含1%-20% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（3）制备荧光分子信标悬液
根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在其5’修饰6FAM荧光，在3’修饰BHQ1淬灭剂；
将5μg 荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，将5 μg脂质体溶于PBS缓冲液中，充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于4℃保存备用。
（4）制备试纸条
按照从结合垫到吸水垫的方向，依次把羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白用喷金划膜仪以0.5-2 μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，待其完全干燥后用铝膜袋密封保存待用；
将样品垫，结合垫，层析膜和吸水垫依次组装于PVC板上，相邻两部分重叠1-2 mm，通过条形切割器将组装好的板条切成4 mm的宽度，并将其装进塑料卡壳，得到试纸条。
实施例2多类型靶标联合检测的试剂盒和制备方法
本实施例的制备方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用0.5 mL缓冲液重悬沉淀，并加入1 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液（含1%-10% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬得到封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（2）制备质控抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用0.5mL缓冲液重悬沉淀，并加入1 μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液（含1%-20% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（3）制备荧光分子信标悬液
根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在其5’修饰6FAM荧光，在3’修饰BHQ1淬灭剂；
将1μg 荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，将1μg脂质体溶于PBS缓冲液中，充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于4℃保存备用。
（4）制备试纸条
按照从结合垫到吸水垫的方向，依次把羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白用喷金划膜仪以0.5-2 μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，待其完全干燥后用铝膜袋密封保存待用；
将样品垫，结合垫，层析膜和吸水垫依次组装于PVC板上，相邻两部分重叠1-2 mm，通过条形切割器将组装好的板条切成4 mm的宽度，并将其装进塑料卡壳，得到试纸条。
实施例3多类型靶标联合检测的试剂盒和制备方法
本实施例的制备方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为1:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入100 μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液（含1%-10% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬得到封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（2）制备质控抗体悬液
在1 mL铕荧光乳胶微球溶液中加入碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对微球进行表面活化，其中，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与铕荧光乳胶微球的质量之比为1:1；
充分反应后进行离心，弃上清，用2 mL缓冲液重悬沉淀，并加入100 μg 羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20% BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2 mL标记抗体复溶液（含1%-20% BSA；0.1%-2% Tween-20）重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于4℃保存备用。
（3）制备荧光分子信标悬液
根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在其5’修饰6FAM荧光，在3’修饰BHQ1淬灭剂；
将10 μg 荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，将10 μg脂质体溶于PBS缓冲液中，充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于4℃保存备用。
（4）制备试纸条
按照从结合垫到吸水垫的方向，依次把羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白用喷金划膜仪以0.5-2 μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，待其完全干燥后用铝膜袋密封保存待用；
将样品垫，结合垫，层析膜和吸水垫依次组装于PVC板上，相邻两部分重叠1-2 mm，通过条形切割器将组装好的板条切成4 mm的宽度，并将其装进塑料卡壳，得到试纸条。
实施例4试剂盒的使用方法
本实施例的方法包括以下步骤：
1. 测试前，将标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液及其他检测用材料等平衡至室温，其中的，标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液选自实施例1-3的任意一实施例；
2.取出试纸条，平放，该试纸条选自实施例1-3的任意一实施例；
3. 加样检测
1) 样本采集：采用肝素钠抗凝采血管收集人静脉外周血，采血后轻轻颠倒混匀采血管。待凝血后离心15-20分钟，收集上清，即可得到检测样本，检测样本要求无溶血，澄清透明；
2) 检测过程：将血浆用磷酸盐缓冲液稀释50-1000倍，并按照体积比1:1-1:10的比例加入10%-50%PEG融合诱导剂，37℃孵育1-15分钟，之后，加入标记抗体悬液、质控抗体悬液混合均匀，随后吸取混合后的悬液与荧光分子信标悬液混合，并随后将所有混合液滴加到试纸条的样品垫上；
3) 结果判读：反应15分钟后，通过读卡仪或紫外光手电观察miRNA检测区、检测线和质控线上是否形成荧光条带，进行结果判定；若30分钟后显示结果则无效；
4.结果判定
如图4所示，miRNA、EpCAM双阳性结果：miRNA检测区出现绿色荧光条带，检测线（T线）无条带，质控线（C线）出现红色荧光条带； miRNA、EpCAM双阴性结果：miRNA检测区无绿色荧光条，带检测线和质控线均出现红色荧光条带；无效结果：当质控线无条带时，无论miRNA检测区和检测线是否有出现条带，则本次测试结果无效，需要重新测试。
测试例1细胞外囊泡膜蛋白的分析灵敏度
在培养肺癌细胞系A549过程中收集其培养上清液，并通过超速离心法分离获得细胞外囊泡。将所获得的细胞外囊泡使用马尔文纳米激光粒度仪测定其颗粒浓度，将测定浓度后的细胞外囊泡样本稀释一系列浓度梯度（2.97、0.59、0.12、0.023、0.0048、0×108/mL）。每个浓度取100 μL作为样品采用实施例1的试剂盒进行测试，并做3个重复。反应15分钟后，使用荧光读卡仪读取荧光结果。如图5所示，本产品检测灵敏度达4.8×105/mL，理论最低检测限达2.34×105/mL，可有效应用于临床样本的检测。
测试例2细胞外囊泡膜蛋白的临床样本测试
采集肺癌患者及健康供体的血浆，稀释后采用实施例1的试剂盒进行检测，并根据检测结果绘制ROC曲线，结果如图6和图7所示。图7为接受者操作特征曲线（ROC曲线），曲线下面积越大表示检测方法的特异性和灵敏度越高。相较于传统生化指标，本发明的试剂盒可大幅提高肺癌诊断时的特异性和敏感性。
测试例3细胞外囊泡miR-21的临床样本测试
采集肺癌患者及健康供体的血浆，稀释后进行miR-21含量检测，结果如图8所示，可见，肺癌患者的血浆中miR-21含量是明显大幅上升的，因此，采用本发明的试剂盒通过检测有效区分肺癌患者和健康供体。
对比例1
本对比例采用CD9抗体检测试剂盒，试剂盒制备和使用步骤如下：
（1）标记抗体的制备
将10 μL的1 mM 3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯]（DTSSP）与1 mL的AuNP混合反应30分钟。然后将悬浮液以离心力3300×g离心5分钟，弃去上清液，得到沉淀；
将沉淀重悬于2 mM硼酸盐缓冲液中(pH 8.9)，然后，在AuNP中加入15 µg抗CD9抗体，振荡反应1.5小时，随后溶液以离心力800×g离心20分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于含有1% BSA的2 mM硼酸盐缓冲液中，得到AuNPs-抗CD9抗体偶联物产物，并置于4℃保存备用；
（2）NC膜的制备
按照从结合垫到吸水垫的方向，依次将1 mg/mL抗CD81抗体和1 mg/mL抗 IgG抗体用划膜仪以0.100 µL/mm的量包被到硝酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线，在37 ℃烘箱中干燥20分钟；
（3）试纸条的组装
所有部分按以下顺序组装在PVC底板上：样品垫，NC膜和吸水垫，每个部分重叠2mm，通过切割器将组装好的板条切成4 mm的宽度，并将其装进塑料卡壳；
（4）试纸条的使用
将纯化后的细胞外囊泡与AuNPs-抗体偶联物混合（终体积100 µL）。将所有混合液从试纸条加样孔加入到样品垫上，层析反应15分钟，最后用肉眼读取检测结果。
采用对比例1的试剂盒进行最低检测限分析和检测范围分析，并对实施例1和对比例1的检测项目和检测灵敏度进行对比，如下表所示。
Figure 304409DEST_PATH_IMAGE001
由此可见，本发明实施例1的试剂盒有更高的灵敏度，在检测细胞外囊泡膜蛋白的同时进行了细胞外囊泡miRNA的检测，两种类型靶标的联合检测能在很大程度上提高检测准确性。可以理解的，在本发明的范围内，实施例2和实施例3的试剂盒也具有较好的检测效果。
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种联合检测细胞外囊泡膜蛋白和miRNA的试剂盒，其特征在于，包括标记抗体悬液、质控抗体悬液、荧光分子信标悬液、试纸条和PEG融合诱导剂；
所述标记抗体悬液中包含荧光微球标记的抗EpCAM抗体，所述质控抗体悬液中包含荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述荧光分子信标悬液中包含荧光miR-21分子信标和囊泡，所述囊泡包裹所述荧光miR-21分子信标，所述荧光miR-21分子信标是由茎部和环部组成的发夹结构；根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在miR-21分子信标的5’端修饰荧光基团和在3’端修饰淬灭基团得到荧光miR-21分子信标；
所述试纸条包括依次设置的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，且所述样品垫、所述结合垫、所述层析膜和所述吸水垫的两两之间均具有重叠部分；
所述结合垫靠近所述层析膜的一端为miRNA检测区；所述层析膜上沿由所述结合垫至所述吸水垫的方向依次设有检测线和质控线；所述检测线由羊抗鼠IgG抗体形成，所述质控线由鸡IgY蛋白形成；
所述荧光微球标记的抗EpCAM抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体均由铕荧光乳胶微球标记；
该试剂盒的使用方法包括以下步骤：
将收集的血浆与荧光分子信标悬液混合，并加入PEG融合诱导剂，孵育1-15分钟，得诱导混合液；
将标记抗体悬液、质控抗体悬液和诱导混合液混合均匀，得到待测样品；
随后将待测样品液滴加到试纸条的样品垫上；
反应10-20min后，分别以核酸检测光和蛋白检测光荧光照射试纸条，所述miRNA检测区、所述检测线和所述质控线之一或多个显色。
2.根据权利要求1所述的联合检测细胞外囊泡膜蛋白和miRNA的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体悬液中，所述抗EpCAM抗体的浓度为10-50μg/ml。
3.根据权利要求1所述的联合检测细胞外囊泡膜蛋白和miRNA的试剂盒，其特征在于，所述质控抗体悬液中，所述羊抗鸡IgY抗体的浓度为10-50μg/ml。
4.一种联合检测细胞外囊泡膜蛋白和miRNA的试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求1-3任一项所述的试剂盒，该方法包括以下步骤：
（1）制备标记抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述抗EpCAM抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成标记抗体悬液并冷藏；
（2）制备质控抗体悬液：将活化后的荧光微球与所述羊抗鸡IgY抗体反应，加入标记抗体复溶液，制成质控抗体悬液并冷藏；
（3）制备荧光分子信标悬液：根据miR-21序列合成miR-21分子信标，并在miR-21分子信标的5’端荧光基团和在3’端修饰淬灭基团得到荧光miR-21分子信标，将溶于缓冲液，之后加入囊泡，充分反应，得到荧光分子信标悬液并冷藏；
（4）制备试纸条：将羊抗鼠IgG抗体和鸡IgY蛋白分别以喷金划膜仪以0.5-2μL/cm的量包被到层析膜上，分别作为检测线和质控线，组装样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，得到试纸条；
所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述荧光微球为铕荧光乳胶微球，以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对荧光微球进行表面活化；
所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的总质量与所述铕荧光乳胶微球的质量之比为10:1~1:1；
所述步骤（1）中，在1mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100μg抗EpCAM抗体，充分反应，随后加入1%-50%BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用；
所述步骤（2）中，在1mL铕荧光乳胶微球溶液中按比例分别加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行表面活化，充分反应后进行离心，弃上清，得到沉淀；
之后，用0.5-2mL缓冲液重悬沉淀，并加入1-100μg羊抗鸡IgY抗体，充分反应，随后加入1%-20%BSA封闭剂进行封闭，得到封闭后的沉淀；
用0.1-2mL标记抗体复溶液重悬封闭后的沉淀，得到标记抗体悬液，置于3-5℃环境保存备用；
所述步骤（3）中，将1-10μg荧光miR-21分子信标溶于PBS缓冲液中，之后加入将1-10μg囊泡，进行充分混合，置于室温静置反应10-60分钟，随后放置于3-5℃环境保存备用。
CN202210595605.4A 2022-05-30 2022-05-30 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法 Active CN114686592B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210595605.4A CN114686592B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210595605.4A CN114686592B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114686592A CN114686592A (zh) 2022-07-01
CN114686592B true CN114686592B (zh) 2022-09-09

Family

ID=82145841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210595605.4A Active CN114686592B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114686592B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115820812A (zh) * 2022-09-29 2023-03-21 齐鲁工业大学 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒
CN116930497B (zh) * 2023-06-27 2024-02-06 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 检测外泌体HER2膜蛋白和mRNA的试剂盒及其应用和检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178356A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Engineered cells, t cell immune modulating antibodies and methods for using the same
CN110954703A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 杭州迪相实业有限公司 一种同时检测外泌体内蛋白和rna、外泌体膜蛋白的方法
WO2020092455A2 (en) * 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
EP3870348A1 (en) * 2018-10-23 2021-09-01 Meso Scale Technologies, LLC Methods for isolating surface marker displaying agents
CN113624724A (zh) * 2020-05-07 2021-11-09 廖世奇 一种适配体分子信标对靶分子的多元检测分析方法
CN113985037A (zh) * 2021-12-23 2022-01-28 广东忠信生物科技有限公司 新型冠状病毒中和抗体的检测方法、检测试纸条及试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11175286B2 (en) * 2015-01-09 2021-11-16 Spot Biosystems Ltd. Immunolipoplex nanoparticle biochip containing molecular probes for capture and characterization of extracellular vesicles
WO2019199499A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 University Of Washington Methods and apparatus for single biological nanoparticle analysis
CN110174510A (zh) * 2019-04-26 2019-08-27 华南农业大学 一种pcv3的荧光免疫层析检测卡的制备方法
CN111366729B (zh) * 2020-03-26 2023-03-21 深圳市梓健生物科技有限公司 一种新型冠状病毒covid-19抗原荧光检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178356A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Engineered cells, t cell immune modulating antibodies and methods for using the same
EP3870348A1 (en) * 2018-10-23 2021-09-01 Meso Scale Technologies, LLC Methods for isolating surface marker displaying agents
WO2020092455A2 (en) * 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
CN110954703A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 杭州迪相实业有限公司 一种同时检测外泌体内蛋白和rna、外泌体膜蛋白的方法
CN113624724A (zh) * 2020-05-07 2021-11-09 廖世奇 一种适配体分子信标对靶分子的多元检测分析方法
CN113985037A (zh) * 2021-12-23 2022-01-28 广东忠信生物科技有限公司 新型冠状病毒中和抗体的检测方法、检测试纸条及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Accurate Cancer Diagnosis and Stage Monitoring Enabled by Comprehensive Profiling of Different Types of Exosomal Biomarkers: Surface Proteins and miRNAs";Sisi Zhou等;《ADVANCED SCIENCE NEWS》;20201230;第1页摘要-第9页结论 *
"Desarrollo de inmunoensayos de flujo lateral cuantitativos. Aplicación a ladeterminación de vesículas extracelulares";Myriam Oliveira-Rodríguez等;《 En la Universidad de Oviedo》;20161230;第1页第1段-第2页末段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114686592A (zh) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114686592B (zh) 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法
AU2020233741B2 (en) Method and device for combined detection of viral and bacterial infections
US4719182A (en) Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations
US10379121B2 (en) Method and device for combined detection of viral and bacterial infections
JP3969722B2 (ja) カンジダの検出
US8962260B2 (en) Method and device for combined detection of viral and bacterial infections
FI102921B (fi) Menetelmä biologisesti aktiivisten reagenssien valmistamiseksi sukkiin i-imidiä sisältävistä polymeereistä, analyysielementti ja menetelmiä n iiden käyttämiseksi
CN111999507B (zh) 一种检测新型冠状病毒抗体的荧光免疫层析试纸
CN111024956A (zh) 一种检测ptx3的时间分辨荧光免疫层析试剂盒
CN110940806B (zh) 腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用
FI95752B (fi) Määrityskitti ja -menetelmä kokonaisten solujen immunologiseen määritykseen
AU3168799A (en) Methods for assaying antibody and device for assaying antibody
CN111007257A (zh) 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测免疫阻断层析试剂盒及其应用
CN111435136A (zh) 用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
US20240044890A1 (en) Antibody detection test strip of integrating primary screening and diagnosis of bovine brucellosis
US20240044891A1 (en) Antibody detection test strip of integrating primary screening and diagnosis of sheep brucellosis
JP3493544B2 (ja) 抗体アッセイ装置
CN106053824A (zh) 胰腺癌双联检测试剂盒
CN109633163B (zh) 降钙素原/c反应蛋白二合一检测试剂盒
CN109212203A (zh) 一种快速检测布鲁氏菌抗体的量子点免疫层析试纸条
JPS62502285A (ja) サンプル中の生物学的物質の免疫学的測定法
CN212586389U (zh) 用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒
CN110346556B (zh) 一种液体检测试剂及其使用方法
JP2002214236A (ja) 血中抗原検出方法及び装置
CN108535484A (zh) 一种定量检测血液中fPSA的时间分辨荧光免疫层析试纸条及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant