CN106885901A - 特发性膜性肾病双联检测试剂盒 - Google Patents

特发性膜性肾病双联检测试剂盒 Download PDF

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张笑人
王伦善
沈晓宝
陈云
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Abstract

本发明涉及特发性膜性肾病检测试剂盒，a.anti‑PLA2R Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti‑lgG4 Ab)的anti‑lgG4金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，b.anti‑THSD7A Ab试纸条，包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti‑lgG4 Ab)的anti‑lgG4金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜，本发明的双联检测试剂盒通过检测全血/血清/血浆中的anti‑PLA2R Ab和anti‑THSD7A Ab来筛查特发性膜性肾病，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

特发性膜性肾病双联检测试剂盒
[技术领域]
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种特发性膜性肾病检测试剂盒。
[背景技术]
全世界有超过5亿人患有不同程度的慢性肾脏病，慢性肾脏病已成为继肿瘤、心脑血管病、糖尿病之后，又一威胁人类健康的重要疾病，成为全球性的重要公共卫生问题。在我国，慢性肾脏病的发病率为10％～13％。中国人口众多，慢性肾脏病患者的总数庞大，这无疑已成为我国沉重的社会和经济负担。膜性肾病按发病原因可分为特发性和继发性膜性肾病，其诊断上要依靠临床表现，肾脏穿刺术的组织学检查或肾组织电镜检查。肾脏穿刺术是一种侵入式的诊断方法，对病人有一定的伤害；肾组织电镜检测对设备要求很高，难以普及使用；而血清标志物检测可以为特发性膜性肾病的初筛和病情监测提供辅助作用。因此，开发非创伤、低风险、安全、廉价、精确的快速检测试剂盒有重要意义。
检测抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体的方法有双抗原夹心法和间接法
双抗原夹心免疫层析法：检测时，当样本中含有抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体时，将与玻璃纤维上包被的重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A蛋白)的金标记物结合形成复合物，在层析作用下反应复合物沿着硝酸纤维素膜移动至检测区(T)，被硝酸纤维素膜上检测区(T)内包被的重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A蛋白)所捕获，在检测区(T)内出现一条紫红色条带。相反，当样本中不含抗PLA2R(或抗THSD7A)抗体时，则检测区(T)内无紫红色条带出现。
间接免疫层析法：在玻璃纤维膜上预包被金标鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)，在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被重组人PLA2R蛋白(或重组人THSD7A)和羊抗鼠二抗。检测阳性样本时，血清样本中PLA2R-Ab(或THSD7A-Ab)与胶体金标记鼠抗人lgG4抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗原结合形成“Au-anti-lgG4Ab-PLA2R Ab-PLA2R Ag”(或Au-anti-lgG4Ab-THSD7A Ab-THSD7AAg)夹心物而凝聚显色，游离的鼠抗人lgG4抗体金标记物则在对照线处与羊抗鼠二抗结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色，15分钟内观察结果即可。
免疫层析法：一份样品在检测装置的毛细管作用的带动下与标记好检测抗体的可见颗粒(胶体金、乳胶、量子点、荧光微球或酶促反应)流经由捕获抗体时发生免疫反应而形成的可见检测线或者检测斑点。该方法具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
中国发明专利CN201610201970.7公开了一种特发性膜性肾病ELISA检测试剂盒及其检测方法，该专利利用直接ELISA法，定量检测人血清中的anti-PLA2R和anti-THSD7A自身抗体来筛查特发性膜性肾病，该方法耗时长(2-3小时)；需要在专业场所，专业人员和设备进行检测；检测费用高，不利于基层大规模筛查特发性模型肾病。
[发明内容]
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种免疫层析法快速检测血清中anti-PLA2R和anti-THSD7A自身抗体来筛查特发性膜性肾病，该方法检测时间短(10-15min)；无需专业场所，专业人员和设备进行检测；检测费用低，适合基层大规模筛查特发性模型肾病。
为了实现上述目的，发明一种特发性膜性肾病双联检测试剂盒(间接免疫层析法)，包括：
a.anti-PLA2R Ab试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)的anti-lgG4金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜。
b.anti-THSD7A Ab试纸条
包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体(anti-lgG4Ab)的anti-lgG4金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
该检测试剂盒还具有如下优化方案：
所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体。
anti-PLA2R Ab试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。更进一步的，anti-PLA2R Ab试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
anti-THSD7A Ab试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。更进一步的，anti-THSD7A Ab试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有双联卡槽。
本发明的双联检测试剂盒通过检测全血/血清/血浆中的anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab来筛查特发性膜性肾病，具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
[附图说明]
图1、图2和图3均为特发性膜性肾病阳性时试纸条的显色示意图；
图4为特发性膜性肾病阴性时试纸条的显色示意图；
图5为需重新测试时试纸条的显色示意图；
图6为试纸条的结构示意图。
[具体实施方式]
以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步的说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。
制备anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab联合检测筛查特发性膜性肾病的检测卡的工艺如下：
1主要材料
1.1PLA2R蛋白和THSD7A蛋白制备
1.1.1引物设计
根据NCBI和相关文献报道，分别对PLA2R(Accession:Q13018)和THSD7A(Accession NP_056019.1)基因进行引物设计，引物具体序列如下：
PLA2R Gene
F1如SEQ ID NO.1所示，
R1如SEQ ID NO.2所示。
THSD7A Gene
F1如SEQ ID NO.3所示，
R1如SEQ ID NO.4所示。
1.1.2表达载体构建
对PLA2R和THSD7A基因的全长进行扩增，回收纯化，通过快速克隆的方法将基因构建到原核表达载体PET-28a载体上。转化大肠杆菌DH5α,挑克隆、提取质粒并测序鉴定。
1.1.3蛋白表达和纯化
将构建好的Pet-28a-PLA2R和Pet-28a-THSD7A质粒转化到BL21感受态细胞中，经IPTG诱导获得所需蛋白。使用均质机对菌体进行裂解，并将上述蛋白通过ChelatingSepharose FF柱进行蛋白纯化，获得其粗蛋白。然后使用pure系统对粗蛋白进行最后阶段的纯化，得到所述的PLA2R蛋白和THSD7A蛋白。
1.2其它原料
鼠抗人lgG4抗体(名称：Mouse anti-Human IgG4Fc Secondary Antibody,货号A-10651,厂家thermofisher)；羊抗鼠IgG抗体：Sigma公司产品，用于硝酸纤维素膜质控线或者质控斑点包被；硝酸纤维素膜：MILLIPORE公司产品；样本垫、结合垫、吸水纸、PVC底板和双联卡壳：上海杰一生物技术有限公司
2方法
2.1鼠抗人lgG4抗体的标记：以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体；以不同浓度的PEG8000、BSA及其他有封闭效果的蛋白或者高分子聚合物分别对标记物进行封闭；标记结束后以10000rpm离心，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS+5％BSA+5％蔗糖)稀释至原溶液体积的1/10；然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)将处理好的标记溶液按2ul/cm分别喷涂在无纺布或者玻璃纤维或者聚酯膜上制成anti-lgG4金垫，25℃真空干燥3小时将标记物固相化。
2.2PLA2R蛋白、THSD7A蛋白包被：用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS+5％蔗糖)将PLA2R蛋白、THSD7A蛋白和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至1mg/ml，然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)把PLA2R蛋白(检测线T1)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成PLA2R膜，把THSD7A蛋白(检测线T2)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成THSD7A膜，包被完后将PLA2R膜和THSD7A膜在温度37℃，相对湿度在＜25％的干燥间干燥12小时将包被物进行固相化。
2.3anti-PLA2R Ab试纸条组装(试纸条的结构参见图6)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的PLA2R膜2放置在PVC底板1中部粘贴，在PLA2R膜T1线一侧搭接PLA2R金垫3(搭接PLA2R膜2mm)，在PLA2R金垫另一侧搭接粘贴上样本垫4(搭接PLA2R金垫1/5),在样本垫上搭接全血滤膜5(搭接样本垫4/5)；在PLA2R膜C线一侧搭接吸水纸6(搭接PLA2R膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入双联卡的PLA2R卡槽内。
2.4anti-THSD7A Ab试纸条组装(与anti-PLA2R Ab试纸条的结构相同，参见图6)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的THSD7A膜2放置在PVC底板1中部粘贴，在THSD7A膜T1线一侧搭接THSD7A金垫3(搭接THSD7A膜2mm)，在THSD7A金垫另一侧搭接粘贴上样本垫4(搭接THSD7A金垫1/5),在样本垫上搭接全血滤膜5(搭接样本垫4/5)；在THSD7A膜C线一侧搭接吸水纸6(搭接THSD7A膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入双联卡的THSD7A卡槽内。
3检测步骤1将试剂盒和待测样本取出，平衡至室温；步骤2打开密封的铝箔袋，将检测卡取出平放在实验台上；步骤3用滴管或者移液器取2-3滴或者60-90ul样本滴加在加样孔7；步骤4 10-15分钟后判读。
4结果
当样本中含有anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab时，检测线T1和T2均显色(图1)，则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中含有anti-PLA2R Ab而不含anti-THSD7A Ab时，检测线T1显色而T2不显色(图2)则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中含有anti-THSD7A Ab而不含anti-PLA2R Ab时，检测线T2显色而T1不显色(图2)则为特发性膜性肾病阳性；
当样本中均不含有anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab时，检测线T1和T2均不显色(图4)则为特发性膜性肾病阴性；
当质控区C未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏,在任何情况下，应重新测试(图5)。
利用anti-PLA2R Ab和anti-THSD7A Ab联合检测卡检测血清，与特发性膜性肾病的符合率如下表：
〈110〉上海埃文生物科技有限公司
〈120〉特发性膜性肾病双联检测试剂盒
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉42
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉1
atgggtcgcg gatccgaatt catgctgctg tcgccgtcgc tg 42
〈210〉2
〈211〉44
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉2
gtggtggtgg tggtgctcga gttggtcact cttctcaaga tcag 44
〈210〉3
〈211〉41
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉3
atgggtcgcg gatccgaatt catggggctg caagccaggc g 41
〈210〉4
〈211〉43
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉4
gtggtggtgg tggtgctcga gcatgtcggc atctccatca tag 43

Claims (7)

1.一种特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于包括：
a.anti-PLA2R Ab试纸条，
包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有PLA2R蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜；
b.anti-THSD7A Ab试纸条，
包括含有显色标记的鼠抗人lgG4抗体的金垫，以及含有THSD7A蛋白的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
2.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的显色标记为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物标记鼠抗人lgG4抗体。
3.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的anti-PLA2R Ab试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。
4.如权利要求3所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于anti-PLA2R Ab试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
5.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的anti-THSD7A Ab试纸条还包括样本垫、金垫、吸水纸、底板。
6.如权利要求5所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于所述的anti-THSD7A Ab试纸条的硝酸纤维素膜、样本垫、金垫和吸水纸置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一侧搭接anti-lgG4金垫，anti-lgG4金垫另一侧搭接样本垫，硝酸纤维素膜靠近质控线一侧搭接吸水纸。
7.如权利要求1所述的特发性膜性肾病双联检测试剂盒，其特征在于还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有双联卡槽。
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