CN111398603A - 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用。本发明制备的胶体金免疫层析试纸条，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性，且储存方便、保存期长、操作简单，检测速度快，适用于SARS‑CoV‑2病毒感染的快速诊断，并可用于基层组织的现地检测。

Description

一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体的胶体金试 纸条、制备方法及其应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)，属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭 圆形，常为多形性，直径60-140nm。新型冠状病毒感染者可合并ARDS、心肌 损害、凝血功能异常、肾脏损伤、肝脏损害等多脏器损害。

目前，核酸检测是新型冠状病毒感染确诊的重要手段，但PCR技术所需设 备庞大，检测耗时费力，对实验室分区和操作人员要求高，很难适应公共卫生事 件应急处置需要。并且，临床数据显示部分已被感染的患者不能检出病毒核酸， 与临床表现不符，这种“假阴性”无法完全避免，假阴性意味着漏检，不仅会导 致临床中对疑似患者不能快速确诊，而且会使漏检者成为潜在的病毒传染源。解 决这种情况一个行之有效的办法，就是补充新型冠状病毒特异抗体检测。 SARS-CoV-2感染人体后，除了对靶器官产生致病过程外，病毒基因组编码的结 构蛋白、非结构蛋白还刺激机体免疫系统，产生特异性免疫应答，分泌病原体特 异性IgM和IgG抗体至血液循环中，而IgG常发病2周后出现，是病毒感染最 可靠的指标，滴度快速上升可提示近期感染，否则为既往感染。通过检测血清中 该抗体，可对临床诊断起到辅助作用。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于 核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。血清学检测方 法中最广泛使用的酶联免疫吸附法虽然结果准确，但操作简便性欠佳，需要多次 孵育和洗涤，操作繁琐，耗时长，至少1.5小时才能检测出结果。因此，寻找一 种快速、不使用或使用简单易携带的仪器在现场进行检测方法来补充和丰富病原 体核酸检测进行确诊的诊断策略已经成为一种迫切需要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型冠状病毒抗体的免疫检测产品。

本发明的目的之一在于提供新型冠状病毒蛋白的用途。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种新型冠状病毒抗体的免疫检测产 品，所述免疫检测产品包括新型冠状病毒NP蛋白，所述NP蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其序列衍生物。

本发明的所述氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、 非保守性或保守性取代或它们的组合而不同于天然氨基酸序列的序列，是具有天 然氨基酸序列同样的生物学活性或提高了结构稳定性(如抗热、抗pH等)的衍生 物。

本发明的所述氨基酸序列衍生物与天然氨基酸序列的序列同一性至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％。

本发明的新冠状病毒NP蛋白是根据Genbank中公布的SARS-CoV-2的基 因组序列，设计引物，以核酸阳性病例样本为模板，RT-PCR扩增NP基因，并 插入表达载体，导入蛋白表达系统中进行可溶性表达，利用亲和层析方法进行纯 化。

本发明的亲和层析方法可以选自：Nickel亲和层析法，NP抗体亲和层析法， 离子交换层析等，在本发明的具体实施方案中，所述亲和层析方法为Nickel亲 和层析法。

术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗 传构建体。可能的表达载体包括但不限于转座子，粘粒，质粒或修饰的病毒(例 如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒和慢病毒)，只要该载体与所 用的宿主细胞相容即可。表达载体“适合转化宿主细胞”，这意味着表达载体含 有本发明的NP蛋白基因和基于宿主细胞选择以用于表达的调节序列，其与NP 蛋白基因序列可操作地连接。“可操作地连接”意指核酸以允许核酸表达的方式 与调节序列连接。

合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆 虫基因。合适的调节序列的选择取决于如下所讨论选择的宿主细胞，并且可以由 本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强 子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决 于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列，例如复制起点，额外的 DNA限制性位点，增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。

本发明的表达载体还可含有选择标志物基因，其有助于选择用本发明的重组 分子转化或转染的宿主细胞。选择标志物基因的实例是编码赋予对某些药物的抗 性的蛋白质的基因，例如新霉素和潮霉素，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶， 萤火虫萤光素酶或免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。 通过选择标志物蛋白质如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的 浓度变化来监测选择标志物基因的转录。

可以将表达载体引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“转化”，“转 导”和“转染”旨在包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体) 引入细胞中。如本文所用的，术语“转化的宿主细胞”或“转导的宿主细胞”还 意图包括已经用本发明的表达载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿 孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可以通过常规技术，例如磷 酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射 将核酸引入哺乳动物细胞的方法可以在现有技术中找到。

本发明的表达载体可以转导或转染到任何细胞类型中，例如，载体可以转导 入真核宿主细胞和原核细胞，例如，真核细胞或酵母细胞或哺乳动物细胞或大肠 杆菌。哺乳动物细胞可以包括：COS，BHK，CHO，HeLa，293，NS-1细胞， NSO。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的表达载体通常包括启动子(例如， 源自病毒材料，例如多瘤，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40或源自任何病 毒LTR)，以及其他转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8， pMT2PC和pMP71。

进一步，所述免疫检测产品包括ELISA试剂盒、免疫层析试纸条、含有所 述免疫层析试纸条的检测卡、含有所述免疫层析试纸条或所述检测卡的试剂盒。

在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫检测产品是免疫层析试纸条。

本发明的免疫层析试纸条包括底板，以及顺次相互搭接粘附在底板上的样品 垫、涂覆有标记物标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的结合垫、包被有检测线T和 质控线C的反应垫、吸水垫。

进一步，鼠抗人IgG单克隆抗体的标记量为12μg/mL。

进一步，所述标记物包括胶体金、胶体银、或胶体硒；优选地，所述标记物 是胶体金；更优选地，胶体金颗粒的粒径为30nm。

进一步，所述检测线T包被有前面所述的新型冠状病毒NP蛋白；优选地， 选择浓度为1.2mg/mL的新型冠状病毒NP蛋白包被检测线。

进一步，所述质控线C包被有羊抗鼠多克隆抗体；优选地，选择浓度为 2.0mg/mL的羊抗鼠多克隆抗体包被质控线。

进一步，所述反应垫包括醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜。在本发明的具体实 施例中，所述反应垫为硝酸纤维素膜。

进一步，所述结合垫可为玻璃棉或聚酯材料。在本发明的具体实施例中，所 述所述结合垫为玻璃纤维素膜。

进一步，所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料。在本发明的具 体实施例中，所述底板为PVC底板。

进一步，所述样品垫可为吸滤纸、滤油纸、玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。在本 发明的具体实施例中，所述样品垫为玻璃纤维膜。

进一步，所述吸水垫为吸水纸。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述检测卡是将所述试纸条放入塑料板 卡内，压实，放入铝箔袋中封口获得。

本发明的所述试剂盒还包括样品稀释液、样品获取工具，说明书。样品获取 工具的实例如滴管。

本发明的试剂盒中的说明书上记载有试纸条结果判断标准：

阴性结果：仅出现质控线C，检测线T不显色，说明没有检测到新型冠状病 毒抗体，结果为阴性。

阳性结果：质控线C和检测线T都出现，说明检测到新型冠状病毒IgG抗 体，结果为IgG抗体阳性。

无效结果：质控线C未出现，无论检测线是否出现，均为无效结果。

本发明的试纸条的制备方法包括如下步骤：

(1)制备涂覆有标记物标记的鼠抗人IgG的结合垫；

(2)制备包被有检测线T和质控线C的反应垫；

(3)在底板上，将所述反应垫、所述样品垫、所述结合垫、所述吸水垫等 按如下工艺组装在一起：所述反应垫的底面粘贴在所述底板上面，在所述反应垫 的两端上分别粘贴所述结合垫和所述吸水垫，在所述结合垫的另一端粘贴所述样 品垫。

步骤(1)具体操作如下：

a、调整胶体金溶液的pH值调整到7.4-7.7左右；

b、加入待标记单抗(鼠抗人IgG单克隆抗体浓度2mg/mL)，静置；

c、用终浓度为1％BSA溶液封闭，静置；

d、金标抗体复合物低速离心，取上清后高速离心，弃上清；

e、使用金标抗体复溶液重悬金标抗体；

f、结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干。

进一步，步骤(1)具体操作如下：

用0.1mol/L K₃CO₄将胶体金溶液的pH值调整到7.4-7.7左右，加完后室温 静置20min；加入Tris-HC1缓冲液配制的5％BSA溶液至终浓度为1％混匀封闭， 以防止发生非特异性聚集，室温静置15min；将金标抗体复合物低速1500r/min 低温4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一 离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min；将得到的金标抗体产物用金标 抗体复溶液以二分之一体积重悬。4℃避光保存备用。先将玻璃纤维素膜浸泡在 结合垫处理液中10-20min，置于37℃烘箱中过夜干燥，然后将金标抗体溶液均 匀喷洒在玻璃纤维上，在37℃烘箱干燥1-2h，得到胶体金垫。

进一步，金标抗体复溶液含0.5％Tween-20(v/v)、5％蔗糖(w/v)、1％BSA (w/v)的0.01mol/L PBS溶液(pH 7.4)。

进一步，结合垫处理液含0.1％Tween-20、5％蔗糖、1％BSA的0.01mol/L PBS溶液(pH 7.2)。

步骤(2)的具体操作如下：

选择pH7.4的0.01mol/L PBS溶液稀释羊抗鼠IgG和SARS-CoV-2病毒NP 蛋白，划线后室温干燥1-2h；将1％BSA的0.01mol/L PBS溶液均匀滴加在划好 线的硝酸纤维素膜上，室温封闭1h后，干燥后备用。

稀释后的羊抗鼠IgG浓度为2.0mg/mL。

稀释后的SARS-CoV-2病毒NP蛋白浓度为1.2mg/mL。

步骤(3)的具体操作如下：首先在PVC胶板的中间区域贴上划好线、封闭 处理好的硝酸纤维素膜。将吸水纸贴在硝酸纤维素膜质控线上方，压硝酸纤维素 膜约2mm左右。结合垫贴在硝酸纤维素膜检测线的下方，结合垫压硝酸纤维素 膜2mm，用衔接胶带将压膜处贴好。最后将样品垫压硝酸纤维素膜4mm贴好， 同样用衔接胶带封好。组装完成后将30cm长的试纸条切割成4mm的单个试纸 条。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒抗体的方法， 所述方法包括如下步骤：利用前面所述的免疫检测产品检测包含新型冠状病毒抗 体的样品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种评价新型冠状病毒疫苗接种效 果的方法，所述方法包括如下步骤：利用前面所述的免疫检测产品检测包含新型 冠状病毒抗体的样品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的新型冠状病毒NP蛋白 制备新型冠状病毒抗体检测产品中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的新型冠状病毒NP蛋白 制备评价新型冠状病毒疫苗接种效果的产品中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试纸条或检测卡在制备 新型冠状病毒抗体检测产品中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试纸条或检测卡在制备 评价新型冠状病毒疫苗接种效果的产品中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备的胶体金免疫层析试纸条，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性， 且储存方便、保存期长、操作简单，检测速度快，适用于SARS-CoV-2病毒感染 的快速诊断，并可用于基层组织的现地检测。

附图说明

图1显示为SARS-CoV-2病毒NP蛋白SDS-PAGE鉴定结果图；

图2显示为胶体金标记抗体最适pH的测定结果图；

图3显示为金标抗体最适标记量结果图；

图4显示为封闭液的选择结果图；

图5显示为金标抗体复溶液处理后的结果图；

图6显示为结合垫处理液处理后的结果图；

图7显示为质控线抗体浓度的确定结果图；

图8显示为检测线抗体浓度的确定结果图；

图9显示为胶体金免疫层析试纸条组装图；

图10显示为胶体金免疫层析试纸条结果判定图；

图11显示为试纸条特异性试验结果图；

图12显示为试纸条稳定性试验结果图；

图13显示为阳性样品试纸条检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限 制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发 明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保 护范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料， 如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例中所用的试剂和仪器设备的来源：羊抗鼠IgG抗体(货号：JY-QT01)、 鼠抗人IgG(货号：JY-QT07)、PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜和卡壳购自上 海杰一生物技术有限公司；硝酸纤维素膜购自美国PALL；三维平面划膜仪、切 条机购自上海金标生物科技有限公司。

实施例1SARS-CoV-2NP蛋白的表达和纯化

1、SARS-CoV-2NP蛋白的表达和纯化

取灭活的SARS-CoV-2毒株，采用QIAamp RNA mini kit(Qiagen,Germany) 制备病毒RNA模板。利用Invitrogen One step RT-PCR kit(Invitrogen,USA)扩增 SARS-CoV-2蛋白开放阅读框；采用分子生物学方法将该阅读框插入细菌表达质 粒pET-28(a)+(Qiagen,Germany)，得到细菌表达质粒pET-28(a)-NP。将该质粒常 规转化E.CoLi BL21菌株(Qiagen,Germany)，用50μg/ml卡那霉素和1mM异丙 基-β-D-硫半乳吡喃糖苷在37℃的LB肉汤中诱导蛋白表达。将含有重组蛋白的 培养颗粒重新悬浮在色谱结合缓冲液中，进行超声处理。将细胞裂解液离心，用 其上清液装载镍离子亲和柱。用结合缓冲液彻底清洗柱后，用洗脱缓冲液从柱上 洗脱重组NP蛋白，用SDS-PAGE分析纯化蛋白，用考马斯亮蓝染色法观察。用 抗组氨酸标记的单克隆蛋白印迹法证实了其特性。

具体的，根据结构预测，SARS-CoV-2NP蛋白从结构上可以分为两个结构 域(domain)，分别称为NP-NT(NP全长蛋白的N末端结构域，氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示)和NP-CT(NP全长蛋白的C末端结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，这两个结构域及NP全长蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所 示)分别表达。

三种重组表达蛋白SDS-PAGE胶染色结果结果见图1，可见三种重组蛋白表 达成功，图中M代表Marker，1泳道代表重组SARS-CoV-2病毒NP全长蛋白， 2泳道代表重组NP-CT蛋白，3泳道代表重组NP-NT蛋白。

2、重组表达蛋白功能检测

1)分别用上述3种重组表达蛋白包被ELISA板，100ng/well，4℃过夜；

2)洗涤后用5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜；

3)在每孔中加入样品稀释液100μl，然后向其中加入1μl的待检血清，混匀 后于37℃孵育30分钟；

4)洗涤5次后，加入mouse anti-human IgG-HRP(r链特异性)、mouse anti-humanIgM-HRP(u链特异性)分别检测病毒特异性IgG和IgM，于37℃孵 育30分钟；

5)洗涤5次后，加入TMB+H₂O₂底物，100μl/well，于室温5分钟，加入终 止液50μl/well于450nm测定OD值。

ELISA实验结果如表1所示，上述结果表明，重组NP-NT蛋白结果优于重 组SARS-CoV-2病毒NP和重组NP-CT蛋白。

表1ELISA实验结果

实施例2胶体金免疫层析试纸条的制备

1、试验试剂的配制

金标抗体复溶液A：含0.5％Tween-20(v/v)、5％蔗糖(w/v)、1％BSA(w/v) 的0.01mol/L PBS溶液(pH 7.4)。

金标抗体复溶液B：含0.5％Tween-20(v/v)、2％蔗糖(w/v)、0.1％BSA (w/v)的0.8％Tris溶液(pH 8.0)。

结合垫处理液A：含0.1％Tween-20(v/v)、5％蔗糖(w/v)、1％BSA(w/v) 的0.01mol/L PBS溶液(pH 7.2)。

结合垫处理液B：含0.2％Tween-20(v/v)、2％蔗糖(w/v)、1％BSA(w/v) 的0.01mol/L PBS溶液(pH 7.2)。

2、实验方法

2.1胶体金颗粒的制备

将1g氯金酸加入清洁的玻璃瓶中，再加入超纯水定容至100mL，用0.45μm 滤器过滤除菌；取1mL配制好的1％的氯金酸溶液于步骤清洁的锥形瓶中，加 超纯水至100mL，稀释后的氯金酸溶液置于圆底烧瓶中，冷凝管水回流，在油 锅中加热至120℃沸腾，用玻璃棒剧烈搅拌溶液的同时加入新鲜配制的1％柠檬 酸三钠溶液，观察溶液由黑色→紫色→深蓝色→酒红色，当溶液颜色变为清亮的 酒红色时，继续煮沸10min，即得所需金胶，从油浴中取出烧瓶，室温冷却，加 入超纯水定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存备用。

2.3金标抗体的制备及优化

2.3.1最适pH值优化实验

确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值这一步尤为重要，过量的蛋白与不同pH 值的胶体金结合后，根据胶体金标记的原理，只有某一特定pH值能够形成结合 最稳定的免疫金胶。在高浓度的电解质(入NaCl)作用下不会发生聚沉。过高 过低都不利于两者的结合，因此标记时选择精密酸碱度测定试纸条，进行梯度试 验找到最佳的标记pH，不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同，一般选择最 小适宜pH值为最佳pH值。分别将200μL胶体金溶液分装到8只洁净的玻璃瓶 中，用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液2-9号的pH值分别为6.8、7.1、7.4、7.7、 8.0、8.3、8.6、8.9。使用精密pH试纸测试。同时设立对照组一瓶。每瓶中加入 5μg鼠抗人IgG单克隆抗体与胶体金溶液混匀。室温静置10min后，除对照组 外，其余各管再加入45μL 10％NaCl溶液，上下颠倒混匀静置2h后观察各管颜 色变化结果(图2)。同时设立对照组抗体稀释液+200μL的胶体金溶液(如表2)。 本实验采用目测法观察实验结果，pH值大于等于7.4，胶体金的颜色保持清亮的 红色不变，随着pH值继续增大到8.0以上，又发生聚沉。所以选择玻璃瓶颜色 仍然保持红色且pH值最低的为胶体金标记抗体最适pH值。此条件下，胶体金 表面的抗体吸附量最大，同时为了减少加入的K₂CO₃的量，实验过程中选择得 到最适pH为7.4～7.7。

图2中玻璃瓶从1到9依次为：

1：每200μl胶体金中加入的0μl IgG单抗；0μl Nacl；(空白对照)

2：每200μl胶体金中加入的0μl IgG单抗；45μl Nacl；

3:每200μl胶体金中加入的0.25μl IgG单抗；45μl Nacl；

4:每200μl胶体金中加入的0.5μl IgG单抗；45μl Nacl；

5:每200μl胶体金中加入的1.0μl IgG单抗；45μl Nacl；

6:每200μl胶体金中加入的1.5μl IgG单抗；45μl Nacl；

7:每200μl胶体金中加入的2.0μl IgG单抗；45μl Nacl；

8:每200μl胶体金中加入的2.5μl IgG单抗；45μl Nacl；

9:每200μl胶体金中加入的3.0μl IgG单抗；45μl Nacl；

表2最佳pH值的优化实验

2.3.2抗体最适标记量优化实验

在确定最佳pH值后，要确定能够形成稳定探针的最小蛋白量，金胶与被标 记蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。过多蛋白质标记， 造成浪费的同时更容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为免疫金胶复合 物溶液中游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭作用“，而胶体金探针 标记不上。过少蛋白质标记，导致胶体金标记不完全，降低了试纸的灵敏度及假 阳性现象的出现。需要在试验中进行梯度试验。取8只洁净的玻璃瓶中，各加入 200μL胶体金溶液。用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至6.8-7.7之间。 分别加入0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3μL的IgG单克隆抗体(2.0mg/mL)。同时设立对照组一瓶。混匀静置10min。除对照组外，其余各瓶分别加入45μL 10％ NaCl溶液，混匀后静置2h。同时设立对照组抗体稀释液+200μL的胶体金溶液(如 表3)，观察各瓶颜色变化结果(图3)。当抗体的量为0-0.5μL时，溶液变为紫 色或蓝色，发生聚沉，当抗体量大于等于1μL时，胶体金颜色未发现明显颜色 变化，考虑实验过程中所需抗体量应略大于最适标记抗体量，因而实验过程中加 入抗体量选择为12μg/ml。

表3抗体最适标记量优化实验

2.3.3胶体金标记抗体

(1)用0.1mol/L K₃CO₄将胶体金溶液的pH值调整到7.4-7.7左右，加入待 标记单抗，加完后室温静置20min；

(2)加入Tris-HC1缓冲液配制的5％BSA溶液至终浓度为1％混匀封闭， 以防止发生非特异性聚集，室温静置15min；

(3)将金标抗体复合物低速1500r/min低温4℃离心20min，弃掉底部聚合 物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离 心20-30min；

(4)将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液以二分之一体积重悬。4℃避 光保存备用。

2.4试纸条反应条件的优化

2.4.1复溶液的选择

将得到的金标抗体产物分别用金标抗体复溶液A和B以等体积重悬。观察 金标抗体沉淀分散、喷膜后的均一性和跑膜后的显色性，选择最佳金标抗体复溶 液。结果如图6所示，金标抗体处理液A效果最好，吸收金标抗体最均匀，未 处理和处理液B处理过的玻璃纤维膜结合金标单抗不均匀。优选地，选择用处 理液A进行处理。

2.4.2NC膜封闭浓度的选择

分别用0.01mol/L PBS(pH 7.4)溶液配制0.5％，0.75％、1％的3种浓度BSA 封闭液。将划好膜的NC膜分别用于3种浓度的BSA封闭处理，室温作用20min 后，将干燥的NC膜贴于底板上，组装成试纸条，滴加正常人血清。观察反应在 液体的流速、反应后NC膜的背景、显色条带清晰度等指标选择最佳封闭液为 1％的BSA(图4)。图4中A：封闭液为0.5％BSA；B：封闭液为0.75％BSA； C：封闭液为1％BSA。

2.4.3结合垫处理液的选择

结合垫经两种结合垫处理液(A、B)浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干后观 察，加入100μL样品稀释液，观察未处理的及A、B处理液处理过的结合垫结合 金标单抗的效果及释放金标单抗的效果。结果如图6所示，处理液A效果最好。 图中1为结合垫用处理液A处理干燥后喷金，2为结合垫用处理液B处理干燥 后喷金，3为结合垫不做任何处理。

2.4.4质控线与检测线抗体浓度的选择

胶体金试纸条质控线上包被的是羊抗鼠IgG二抗，为了确定包被羊抗鼠IgG 的最适浓度，将羊抗鼠IgG稀释为3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、 0.5mg/mL分别包被到质控线上。将SARS-CoV-2病毒NP蛋白稀释为1.2mg/mL、 1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL分别包被到检测线上。根据试纸 条的显色情况，确定质控线羊抗鼠IgG(图7)与检测线上SARS-CoV-2病毒NP (图8)的最适划膜浓度分别为2.0mg/mL和1.2mg/mL。

图7中1：3.0mg/mL羊抗鼠IgG；2：2.0mg/mL羊抗鼠IgG；3：1.0mg/mL 羊抗鼠IgG；4：0.5mg/mL羊抗鼠IgG；5:0.25mg/mL羊抗鼠IgG。

图8中1：1.2mg/mL NP；2：1.0mg/mL NP；3：0.8mg/mL NP；4：0.6mg/mL NP；5：0.4mg/mL NP。

2.5胶体金试纸条的组装及判定标准

2.5.1胶体金试纸条的组装

胶体金试纸条组成材料有五部分：样品垫、结合垫(玻璃纤维膜)、硝酸纤维 素膜、吸水纸及PVC胶板。将各部分按照如下规格进行裁剪：NC膜，长30cm， 宽2.5cm；结合垫：长30cm，宽0.5cm；样品垫(玻璃纤维素膜(货号：Ahlstrom 8964))；长30cm，宽1.6cm；吸水纸：长30cm，宽1.5cm。首先在PVC胶板 的中间区域贴上划好线、封闭处理好的硝酸纤维素膜。将吸水纸贴在硝酸纤维素 膜质控线上方，压硝酸纤维素膜约2mm左右。结合垫贴在硝酸纤维素膜检测线 的下方，结合垫压硝酸纤维素膜2mm，用衔接胶带将压膜处贴好。最后将样品垫压硝酸纤维素膜4mm贴好，同样用衔接胶带封好。组装完成后将30cm长的 试纸条切割成4mm的单个试纸条。压壳密封保存使用。胶体金免疫层析试纸条 组装效果如图9所示。

2.5.2试纸条测试方法及结果判定标准

吸取待测血清样本10μL于检测卡上样本孔内，立即在样本孔内滴加2-3滴 (约60μL-80μL)样品稀释液(0.01M PBS(pH＝7.4))，并确保操作过程中没有 气泡产生。反应15-20min观察结果；

结果判定如图10所示：

阴性结果：仅出现质控线C，检测线T不显色，说明没有检测到新型冠状病 毒抗体，结果为阴性(图10A)。

阳性结果：质控线C和检测线T都出现，说明检测到新型冠状病毒IgG抗 体，结果为IgG抗体阳性(图10B)。

无效结果：质控线C未出现，无论检测线是否出现，均为无效结果(图10C 和D)。

2.6试纸条性能测试

2.6.1试纸条特异性试验

将制备的同一批号的试纸条平放在桌面，在样品垫上依次加入SARS-CoV-2 病毒感染病人阳性血清、样品稀释液、布尼亚病人阳性血清两例和H7N9禽流感 病人阳性血清两例，15-20min后读取结果，观察结果，每个检测浓度各重复3 次，各溶液3次检测结果均为阳性可判为次浓度结果阳性。当样品为SARS-CoV-2 病毒感染病人阳性血清时，检测线呈阳性结果(T线红色)，而当样品种含有上 述其他抗体时，检测线结果阴性(T线无色)，PBS缓冲液阴性对照，检测线也 呈阴性结果。见图11，图中1：新型冠状病毒(SARS-Cov-2)IgG抗体阳性血清； 2：正常人血清；3和4：布尼亚病毒抗体阳性血清；5和6：H7N9病毒抗体阳 性血清。表明试纸条特异性良好。

2.6.2稳定性测试

将本方法制备的试纸放置一周、两周、三周后，用于测试同一批新型冠状病 毒确诊病例临床血清、正常人血清、布尼亚病毒抗体阳性血清和H7N9病毒抗 体阳性血清。各5份。测试结果显示如图12：一周、两周、三周测试的试纸显 示结果相同，结果表明试纸具有很好的稳定性。图12A：一周后；图12B：两周 后；图12C：三周后，图中1：新型冠状病毒(SARS-Cov-2)IgG抗体阳性血清；2： 正常人血清；3和4：布尼亚病毒抗体阳性血清；5和6：H7N9病毒抗体阳性血 清。

2.6.3临床样品检测

收集江苏省新型冠状病毒阳性患者恢复期血清共5份(苏州1份、徐州3份、 无锡1份)与正常人血清30份。阳性血清56℃，30min灭活后用所述胶体金免 疫层析试纸条进行检测，正常人血清30份均为阴性。用本发明中的试纸条检测， 结果见表4和图13。图13A：江苏省确诊阳性病人血清样本检测结果；图13B： 正常人阴性对照检测结果。

表4临床样品的检测结果

序列表

<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）

<120> 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly

165 170 175

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala

20 25 30

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys

35 40 45

Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys

50 55 60

Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr

65 70 75 80

Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln

85 90 95

Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp

100 105 110

Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala

115 120 125

Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

130 135 140

Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn

145 150 155 160

Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys

165 170 175

Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp

180 185 190

Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr

195 200 205

Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln

210 215 220

Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

225 230

<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒抗体的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫检测产品包括新型冠状病毒NP蛋白，所述NP蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其序列衍生物；

优选地，所述免疫检测产品包括ELISA试剂盒、免疫层析试纸条、含有所述免疫层析试纸条的检测卡、含有所述免疫层析试纸条或所述检测卡的试剂盒。

2.根据权利要求1所述的免疫检测产品，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括底板，以及顺次相互搭接粘附在底板上的样品垫、涂覆有标记物标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的结合垫、包被有检测线T和质控线C的反应垫、吸水垫；

优选地，鼠抗人IgG单克隆抗体的标记量为12μg/mL；

优选地，所述标记物包括胶体金、胶体银、或胶体硒；更优选地，所述标记物是胶体金；最优选地，所述胶体金颗粒的粒径为30nm；

优选地，所述检测线包被有所述新型冠状病毒NP蛋白；更优选地，所述检测线包被有浓度为1.2mg/mL的所述新型冠状病毒NP蛋白；

优选地，所述质控线C包被有羊抗鼠多克隆抗体；更优选地，所述质控线C包被有浓度为2.0mg/mL的羊抗鼠多克隆抗体；

优选地，所述反应垫包括醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜；更优选地，所述反应垫是硝酸纤维素膜；

优选地，所述结合垫包括玻璃棉或聚酯材料；更优选地，所述结合垫是玻璃纤维素膜；

优选地，所述样品垫包括吸滤纸、滤油纸、玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；更优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜；

优选地，所述底板包括PVC底板或其他硬质不吸水的材料；更优选地，所述底板为PVC底板；

优选地，所述吸水垫为吸水纸。

3.根据权利要求1所述的免疫检测产品，其特征在于，所述检测卡是将所述试纸条放入塑料板卡内，压实，放入铝箔袋中封口获得。

4.根据权利要求1所述的免疫检测产品，其特征在于，所述试剂盒还包括样品获取工具，说明书；优选地，所述样品获取工具包括滴管；优选地，所述说明书记载了结果判断标准：

阴性结果：仅出现质控线，检测线不显色，说明没有检测到新型冠状病毒抗体，结果为阴性；

阳性结果：质控线和检测线都出现，说明检测到新型冠状病毒IgG抗体，结果为IgG抗体阳性；

无效结果：质控线未出现，无论检测线是否出现，均为无效结果。

5.权利要求1-4中任一项所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备涂覆有标记物标记的鼠抗人IgG的结合垫；

(2)制备包被有检测线T和质控线C的反应垫；

(3)在底板上，将所述反应垫、所述样品垫、所述结合垫、所述吸水垫等按如下工艺组装在一起：所述反应垫的底面粘贴在所述底板上面，在所述反应垫的两端上分别粘贴所述结合垫和所述吸水垫，在所述结合垫的另一端粘贴所述样品垫。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体操作如下：

a、调整胶体金溶液的pH值调整到7.4-7.7左右；

b、加入浓度为2mg/mL的待标记单抗，静置；

c、用终浓度为1％BSA溶液封闭，静置；

d、金标抗体复合物低速离心，取上清后高速离心，弃上清；

e、使用金标抗体复溶液重悬金标抗体；

f、结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干；

优选地，步骤(1)具体操作如下：

用0.1mol/L K₃CO₄将胶体金溶液的pH值调整到7.4-7.7左右，加完后室温静置20min；加入Tris-HC1缓冲液配制的5％BSA溶液至终浓度为1％混匀封闭，以防止发生非特异性聚集，室温静置15min；将金标抗体复合物低速1500r/min低温4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min；将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液以二分之一体积重悬；4℃避光保存备用；先将玻璃纤维素膜浸泡在结合垫处理液中10-20min，置于37℃烘箱中过夜干燥，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在37℃烘箱干燥1-2h，得到胶体金垫；

更优选地，金标抗体复溶液含0.5％Tween-20(v/v)、5％蔗糖(w/v)、1％BSA(w/v)的0.01mol/L pH 7.4的PBS溶液；

更优选地，结合垫处理液含0.1％Tween-20、5％蔗糖、1％BSA的0.01mol/L pH 7.2的PBS溶液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体操作如下：选择pH7.4的0.01mol/L PBS溶液稀释羊抗鼠IgG和SARS-CoV-2病毒NP蛋白，划线后室温干燥1-2h；将1％BSA的0.01mol/L PBS溶液均匀滴加在划好线的硝酸纤维素膜上，室温封闭1h后，干燥后备用；

优选地，稀释后的羊抗鼠IgG浓度为2.0mg/mL；

优选地，稀释后的SARS-CoV-2病毒NP蛋白浓度为1.2mg/mL。

8.一种检测新型冠状病毒抗体的方法，所述方法包括如下步骤：利用权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品检测包含新型冠状病毒抗体的样品。

9.一种评价新型冠状病毒疫苗接种效果的方法，所述方法包括如下步骤：利用权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品检测包含新型冠状病毒抗体的样品。

10.如下任一项所述的应用：

权利要求1所述的新型冠状病毒NP蛋白制备新型冠状病毒抗体免疫检测产品中的应用；优选地，所述免疫检测产品是权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品；

权利要求1所述的新型冠状病毒NP蛋白制备评价新型冠状病毒疫苗接种效果的产品中的应用；优选地，所述产品是权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品；

权利要求1-4所述的试纸条或检测卡在制备新型冠状病毒抗体免疫检测产品中的应用；优选地，所述免疫检测产品是权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品；

权利要求1-4所述的试纸条或检测卡在制备评价新型冠状病毒疫苗接种效果的产品中的应用；优选地，所述产品是权利要求1-4中任一项所述的免疫检测产品。

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