CN111748033A

CN111748033A - 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒

Info

Publication number: CN111748033A
Application number: CN202010463553.6A
Authority: CN
Inventors: 张黎; 朱凤才; 高行素; 郑滨洋
Original assignee: Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Current assignee: Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111748033B

Abstract

本发明公开了一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒。本发明还涉及包含本发明抗体的衍生物。本发明进一步涉及包含编码所述抗体的分离的核酸、载体和宿主细胞和所述抗体作为检测或诊断产品的用途。

Description

一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒

技术领域

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒。

背景技术

国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。

SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。

由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。

发明内容

定义

贯穿本发明，术语“和/或”是语法上的结合进而应理解为其连接的涵盖一种或多种情况可发生。例如，词语″这种天然序列蛋白可使用标准重组和/或合成方法制备″这一表述表明天然的序列蛋白可使用标准重组和合成方法制备或天然序列蛋白可使用标准重组方法或天然序列蛋白可使用合成方法制备。

此外，贯穿本发明，术语“包含”应理解为涵盖全部具体提及的特征以及任选的、额外的、未描述的一些。如本文使用，术语“包含”的使用还公开给出其中除具体提及的特征而无其他特征的实施方案(即“由...组成”)。此外，不定冠词″一个″或″一种″不排除复数。某些措施记载在相互不同的从属权利要求中这一事实并不表明不能有利地使用这些措施的组合。

术语″基因″意为编码或对应包含一个或多个蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列，且可包含或不包含调节性DNA序列如启动子序列(其例如确定在何种条件下基因表达)。一些并非为结构基因的基因，可从DNA转录成RNA，但不翻译成氨基酸序列。其他基因可作为结构基因的调节子或作为DNA转录的调节子发挥功能。具体地，术语基因可以表示编码蛋白的基因组序列，即包含调节子、启动子、内含子和外显子序列的序列。

“与参照序列至少85％相同”的序列是在其全长上与参照序列的全长具有 85％或更多，具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

在本发明的上下文中，“同一性的百分数”使用全域双序列比对(即将两序列在其全长上比较)计算。用于比对两或多序列同一性的方法为本领域熟知。当考虑其全长时，例如可使用应用Needleman-Wunsch全域比对算法的《needle》程序(Needleman and Wunsch，1970J.Mol.Biol.48：443-453)已发现两序列的最佳排列(包括缺口)。Needle程序例如可在ebi.ac.uk全球网站上获得。依据本发明两多肽间同一性的百分数使用具有“缺口开放”参数等于10.0、“缺口延伸(Gap Extend)”参数等于0.5和Blosum62矩阵的EMBOSS：needle(global)程序计算。

由与参照序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”的氨基酸序列组成的蛋白与参照序列相比可包含突变如缺失、插入和/或取代。在取代的情况中，由与参照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白可对应源自不同于参照序列的物种的同源序列。

“氨基酸取代”可以是保守或非保守的。优选地，取代为保守取代，其中一个氨基酸__由具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。所述取代优选对应如下表所示的保守取代。

“抗体”也称为“免疫球蛋白“其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。存在两种类型的轻链，、λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性： IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。

重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR 指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、 CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个 CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。

在本发明的上下文中，抗体或免疫球蛋白是IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、 FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。

获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、 FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

如本实验的术语“抗体”指代常规抗体及其片段以及单结构域抗体及其片段。

如本文使用的抗体或免疫球蛋白还包括近来更多描述且其互补决定区是单结构域多肽部分的“单结构域抗体”。单结构域抗体的实例包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规四链抗体的单结构域抗体、工程化单结构域抗体。单结构域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、羊、兔、牛。单结构域抗体可以是天然存在的已知为缺乏轻链的重链抗体的单结构域抗体。

这些缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链在本领域中已知为“VHH”或“纳米抗体”。与常规VH结构域相似的是VHH包含四个FR和三个CDR。纳米抗体比常规抗体具有优势：其比IgG分子小约十倍，且作为结果恰当折叠的功能性纳米抗体可通过体外表达产生并获得高产量。此外，纳米抗体非常稳定，且能抵抗蛋白酶的作用。Harmsen和De Haard HJ(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007 Nov； 77(1)：13-22)已对纳米抗体的性质和产生进行了综述。

如本文使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指针对特定抗原的具有单一氨基酸组成的抗体分子，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体可由B细胞或杂交瘤的单一克隆产生，但还可为重组的，即通过蛋白工程产生。

(常规)抗体的“片段”包含完整抗体的一部分，具体而言完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、 dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体、双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段还可为单一结构域抗体，例如重链抗体或VHH。

术语“Fab”表示具有约50,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，H链的N末端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

术语“F(ab’)2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在通过用一种蛋白酶即胃蛋白酶处理IgG所获得的片段中，其稍大于经由铰链区域的二硫键结合的Fab。

术语“Fab′”指具有约50,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过剪切F(ab′)2铰链区的二硫键获得。

单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其通常由包括通过肽编码接头连接的编码VH和VL的基因的基因融合表达。本发明的人scFv 片段包括具体而言通过使用基因重组技术来保持适当构象的CDR。二价和多价抗体片段可自发地通过单价scFv缔合来形成，或可通过肽接头偶联单价scFv来生成，例如二价sc(Fv)2。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异源二聚体。“(dsFv)2”指两个通过肽接头偶联的dsFv。

术语“双特异性抗体”或“BsAb”一般指将两个抗体的抗原结合位点结合于单一分子内的抗体。因此，BsAb能够同时结合两种不同抗原。已经使用基因工程以越来越高的频率设计、修饰并产生具有一组预期的结合性质和效应功能的抗体或抗体衍生物，例如如EP2050 764A1中所述。

术语“多特异性抗体”指将两种或更多种抗体的抗原结合位点结合于单一分子内的抗体。

当指代多肽(即本发明的抗体)或核苷酸序列时，“纯化”和“分离”意为指示的分子在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。具体而言，如本文使用的术语“纯化”意为存在至少75％、85％、95％或98％重量的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“分离”核酸分子指实质上不含其他不编码主题多肽的核酸分子的核酸分子；然而，该分子可包含一些不会不利地影响组合物基本特性的其他碱基或部分。

“结构域”可以是蛋白的任何区，一般基于序列同源性限定且通常涉及特定结构或功能实体。

″重组″分子是通过重组方式制备、表达、生成或分离的那些分子。

如本文使用的“受试者”指代哺乳动物，如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。具体地，根据本发明的受试者是人。

本发明提供了一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体，其包含：

1)重链可变结构域，其含有由SEQ ID NO.1-3所示的序列组成的CDR-H；

2)轻链可变结构域，其含有由SEQ ID NO.5-7所示的序列组成的CDR-L。

优选地，

1)重链可变结构域，其含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或与其至少85％相同序列；

2)轻链可变结构域，其含有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列或与其至少85％相同序列。

本发明的抗体是常规抗体，特别是常规单克隆抗体或抗体片段。

例如，重链或轻链可变结构域的序列酌情可与参照序列SEQ ID NO.4或8 区别在于一个或多个氨基酸取代，特别是一个或多个保守氨基酸取代和/或用典型残基的取代。具体地，重链或轻链可变结构域的序列与参照序列SEQ ID NO.4 或8区别仅在于保守氨基酸取代。

本发明还提供了一种分离的核酸，其包含编码前面所述的抗体的序列。

通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可包括与任何合适的载体中，如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，其已由前面所述的核酸转化。

术语＂载体＂、意为通过其DNA或RNA序列(例如外源基因)可转入宿主细胞进而转化宿主并促进导入的基因表达(例如转录和翻译)的媒介物。

因此，本发明的另一目的涉及包含本发明核酸的载体。

这种载体可包含调节组成，如启动子、增强子、终止子等，以在施用至受试者时引起或指导所述多肽的表达。在表达载体中使用的用于动物细胞的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子和增强子(Mizukami T.等人1987)、LTR启动子莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney mouse leukemia virus)(Kuwana Y等人1987) 的增强子、启动子(Mason JO等人1985)和免疫球蛋白H链增强子(Gillies SD等人1983)等。

可使用任何用于动物细胞的表达载体，只要编码人抗体C区的基因可以插入和表达。合适的载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、 pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O＇Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的质粒，或整合质粒，如pUC、pcDNA、pBR等。

病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这种重组病毒可通过本领域已知的技术产生，如通过转染包装细胞或通过使用复制质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷性重组病毒的详细方案可例如在WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、 US 5,278,056和WO 94/19478中发现。

本发明的另一目的涉及已通过根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。

术语＂转化＂意为将＂外源＂(即外来的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞，进而宿主细胞将表达导入的基因或序列以产生预期物质，通常是由导入的基因或序列编码的蛋白或酶。接收和表达导入的DNA或RNA的宿主细胞已＂转化＂。

本发明的核酸可用于在合适的表达系统产生本发明的重组抗体。术语＂表达系统＂意为在合适的条件下的宿主细胞和相容载体，例如由外源DNA编码的蛋白通过载体携载并导入宿主细胞表达。

通用的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，和哺乳动物宿主细胞和载体。其他宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的实例包括大肠杆菌(E.coli)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)或酿酒酵母 (Saccharomyces yeasts)、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、 COS细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养(例如从淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠 SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCCCRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(此后称为＂D H F R基因＂)缺陷的C H O细胞、大鼠Y B2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，此后称为＂YB2/0细胞＂) 等。

本发明的抗体可通过任何本领域已知的技术产生，如但不限于单独的任何化学、生物、基因或酶技术或其组合。

获知预期序列的氨基酸序列，本领域的技术人员可以很容易地通过标准用于产生多肽的技术产生所述抗体或免疫球蛋白链。例如，其可使用已知的固相方法合成、具体地使用市场有售的肽合成设备(如由Applied Biosystems，Foster City， California制造的)并依照生产商的说明书合成。可替换地，本发明的抗体可通过本领域熟知的重组DNA技术合成。例如，这些片段作为DNA表达产物如下获得：将编码预期(多)肽的DNA序列并入表达载体并将这种载体导入合适的将表达预期多肽的真核或原核宿主后，随后使用已知技术从其分离所述片段。

本发明还提供了一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包括用可检测的分子或物质标记的前面所述的抗体。

可检测的分子或物质如荧光分子或任何已知提供(直接或间接)信号的其他标记物。

本文使用的术语″标记″意在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质直接标记抗体，如将放射剂或荧光基团(如异硫氰酸萤光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))偶联至多肽，以及通过用可检测物质间接标记多肽。

例如放射性分子包括但不限于用于闪烁照相研究的放射性原子如I¹²³、I¹²⁴、In¹¹¹、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Tc⁹⁹。例如，本发明的多肽可用用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记如碘-123、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧 -17、钆、锰或铁进行标记。

″生物样品″涵盖从受试者获得的多种样品类型且可在诊断或检测中使用。生物样品包括但不限于血液和其他生物来源的液体样品、固体组织样品如活检样品或组织培养或源自它们的细胞，和其子代。因此，生物样品涵盖临床样品、培养基中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。

本发明还提供了一种试剂盒，其包含前面所述的抗体。

本发明的试剂盒可用于检测新型冠状病毒中。本发明的试剂盒可包含多肽或抗体、与固体支持物偶联的至少一种抗体，例如组织培养平板或珠(例如琼脂糖珠)。包含在体外检测和量化新型冠状病毒的抗体的试剂盒可在例如ELISA或蛋白免疫印迹中提供。在一个实施方案中，所述抗体对于检测有效且提供标记物如荧光或放射标记。

在一个实施方案中，本发明涵盖用于产生单剂量施用单位的试剂盒。每个试剂盒可包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。还包括在本发明保护范围之内的是包含单或多室预填充注射器的试剂盒(例如液体注射器和 lyosyringes)。

本发明还提供了一种利用免疫测定法特异性检测生物样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用前面所述的抗体。

本发明还提供了前面所述的抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。

本发明还提供了前面所述的抗体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。

本发明还提供了前面所述的抗体衍生物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。

附图说明

图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；

图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；

图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；

图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；

图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；

图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；

图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；

图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；

图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；

图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；

图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；

图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；

图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；

图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；

图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；

图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；

图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；

图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；

图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；

图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；

图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；

图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1抗体筛选

一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达

1.1主要试剂

SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物系统(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自 New England Biolabs(NEB)公司；EX Taq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc 抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存，全部为江苏病例。

1.2原核表达质粒构建

设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带Not Ⅰ酶切位点。引物序列为： Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R: ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃80s，共30 个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。

1.3NP表达及纯化

将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导 6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上 100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280 rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。

SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×10³。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×10³左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150 mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。

二、噬菌体文库构建

1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)

本项目于2020年2月14日，经过知情同意，采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离 20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。

2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成

使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche， Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。

3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)

(1)扩增VK&VL体系如表1所示。

表1扩增VK&VL体系

溶液或组分	体积(μL)
		cDNA	1
EX Buffer(10x)	5
		dNTPs(10mM each)	4
P1(10μM)	2
		P2(10μM)	2
EX Taq 1U/μl	0.3
		dH<sub>2</sub>O	35.7

(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。

表2扩增重链Fd段体系

溶液或组分	体积(μL)
		cDNA	2
EX Buffer(10x)	10
		dNTPs(10mM each)	8
P1(10μM)	2
		P2(10μM)	2
EX Taq 1U/μl	0.6
		dH<sub>2</sub>O	75.4

(3)反应程序如表3所示。

表3反应程序

PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。

4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)

VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H 载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。

电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。

5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)

将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。

6、抗体库的包装

(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT 培养基中，37℃200rpm摇1小时；

(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；

(3)加10¹²pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；

(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；

(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％ NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；

(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用 1ml PBS重悬即为包装文库。

三、噬菌体文库筛选

1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3 管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。

2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。

3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。

4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。

5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜 XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。

6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶， 230rpm摇1h。

7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。

8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。

9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml) 中，37℃，230rpm摇2h。

10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。

11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。

12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA 检测。

四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性

1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。

2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。

3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST 洗涤后，TMB显色。

经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。

实施例2全抗体的表达及相关功能验证

从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。

其中，JS08抗体序列如下所示：

重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQ ID NO.17 所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核酸序列如SEQ ID NO.18 所示。

1、全抗体表达

将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。

2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性

将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到 1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB 显色，终止后读取OD450吸光度值。

采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为 0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为

由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。

3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果

将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000) 孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。

WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。

4、抗体亲和活性检测

抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM 醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min 流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、 420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH2.0的甘氨酸-盐酸再生 CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。

实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。

表4抗体亲和力参数

5、抗体配对实验

5.1抗体包被浓度的确定

(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST 洗3次。

(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/ 孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。

(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色后读取OD450nm吸光度值。

由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。

5.2双抗夹心法检测NP

(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。

(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。

(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB 显色，读取OD450nm吸光度值。

由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他 13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。

6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度

将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。

采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T 线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）

<120> 一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe

1 5 10 15

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Asn Ser

1

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val

1 5 10

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcagc tggtgcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggagtg gattgggaat atctattaca gtgggagcac cgactacaac 180

ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

cggctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgcg agagcagttc 300

tccggcggtg actacgaagg ctttgacttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagagcgtgc tcactcagga gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttgg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

Claims

1.一种与新型冠状病毒NP蛋白结合的分离抗体，其包含：

2.根据权利要求1所述的抗体，其包含：

1)重链可变结构域，其含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

2)轻链可变结构域，其含有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1或2所述的抗体的序列。

4.一种宿主细胞，其已由权利要求3所述的核酸转化。

5.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的抗体。

6.一种抗体衍生物，所述抗体衍生物包括用可检测的分子或物质标记的权利要求1所述的抗体。

7.一种利用免疫测定法特异性检测生物样品中新型冠状病毒的方法，所述方法包括使用权利要求1或2所述的抗体。

8.权利要求1或2所述的抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。

9.权利要求1或2所述的抗体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。

10.权利要求1或2所述的抗体衍生物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。