CN116023483A - 抗SARS-CoV-2抗体及其应用 - Google Patents

抗SARS-CoV-2抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2抗体及其应用。本发明的抗SARS‑CoV‑2抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1‑3所示的重链可变区CDR以及SEQ ID NO:4‑6所示的轻链可变区CDR。本发明的抗体或抗原结合片段对SARS‑CoV‑2突变新毒株灵敏度高,特异性强,且不与其他β属冠状病毒发生交叉反应。

Description

抗SARS-CoV-2抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子病毒学领域,本发明涉及抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体或其抗原结合片段,以及包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物,此外,还涉及所述抗体或其抗原结合片段的用途,包括用于检测新冠病毒。
背景技术
新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,Covid-19),是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的一种严重的急性呼吸系统传染病,该病传染性强,近三年来在全球范围内大流行,确诊已达数亿人。
SARS-CoV-2属于冠状病毒科的β冠状病毒属,为单股正链RNA(核糖核酸)病毒,基因组非常小,约30KB,RNA病毒复制依赖于自身携带的RNA聚合酶,RNA聚合酶不具有核酸酶校对活性,因此其基因组在复制过程中核苷酸的错配率就比较高。因此,RNA病毒突变率很高。
早期诊断对于感染病人的及早发现都至关重要。目前新型冠状感染的诊断方法主要有:1)基于病毒核酸扩增的分子检测,2)抗原快速检测,和3)抗体检测。抗原检测不需要复杂设备,具有速度快、成本低的优点,而且便于居家自检。核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)是新冠病毒感染过程中含量最丰富的病毒结构蛋白,在病毒感染人体细胞后会大量表达,引起强烈的免疫反应。NP蛋白的基因序列相对保守稳定,与谱系上最接近的SARS-CoV NP蛋白存在约90%的同一性,因为其良好的免疫原性和稳定性,NP蛋白常作为新冠病毒的检测靶标,进行新冠抗原检测,用于病例筛查。
一些携带关键位点突变的病毒变异株,如被世界卫生组织(WHO)列为“关注变异株”(variants of concern,VOC)的Alpha株(B.1.1.7)、Beta株(B.1.351)、Gamma株(P.1)、Delta株(B.1.617.2)和Omicron株(B.1.1.529)等,表现出更强的感染能力或更强的免疫逃逸能力,使现有的公共卫生干预措施或疫苗的有效性降低。作为新冠抗原检测的主要靶标,NP蛋白发生突变可能会影响抗原检测的灵敏度。面对全球不断出现的变异毒株,特别是奥密克戎毒株,需要进一步寻找针对新毒株灵敏度更高、特异性更强的NP抗体,确保变异株能够被检测出来,同时,由于新型冠状病毒NP蛋白与其他β属冠状病毒的NP蛋白具有极高同源性,会干扰NP抗体的特异性识别从而产生“假阳性”,因此也需要一种不与这些冠状病毒产生交叉反应的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对新毒株灵敏度更高、特异性更强且不与其他β属冠状病毒发生交叉反应的抗SARS-CoV-2抗体。
本发明第一方面提供一种抗体或其抗原结合片段,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,所述抗体或其抗原结合片段的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,所述抗体或抗原结合片段的轻链包括分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GFSLSTFGM;SEQID NO:2所示序列为WWDDD;SEQ ID NO:3所示序列为ITEDYGVYVGWYFDV;SEQ ID NO:4所示序列为RASSNVKYMY;SEQ ID NO:5所示序列为YTSNLAS;SEQ ID NO:6所示序列为QQFTSSPFT。
所述抗体或抗原结合片段是由于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏号为CGMCC No.45316(请求保藏人为:深圳重链生物科技有限公司)的杂交瘤细胞产生的。
进一步地,所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示序列,或者,其与SEQ ID NO:7所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性;和
轻链可变区,所示抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示序列,或者,其与SEQ ID NO:8所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体中的任意一种;
进一步地,所述抗体或抗原结合片段还包含恒定区;
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区;
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人;
进一步地,所述抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠;
进一步地,所述抗体或抗原结合片段以10-8M或更小的KD结合SARS-CoV-2NP蛋白。
进一步地,所述抗体或抗原结合片段以小于100nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于10nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于1nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,例如以0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合SARS-CoV-2蛋白。
本发明第二方面提供一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞D6C9产生上述单克隆抗体,所述杂交瘤细胞于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45316。
本发明第三方面提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码上述的抗体或其抗原结合片段。
本发明第四方面提供一种载体,所述载体含有编码上述抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
进一步的,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
本发明第五方面提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的核苷酸序列或包含上述的载体。
本发明第六方面提供上述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明第七方面提供一种试剂或试剂盒,包含上述的抗体或其抗原结合片段。
本发明第八方面提供一种检测新型冠状病毒的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用上述的抗体或抗原结合片段的步骤。
进一步地,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒蛋白检测的方法。
进一步地,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种。
进一步的,所示可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:
本发明提供的抗体或其抗原结合片段,均可特异性结合SARS-CoV-2的NP蛋白,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,且对其他四种常见冠状病毒HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应,说明上述的抗体或抗原结合片段应对SARS-CoV-2野生株及其突变株的检测中具有重要的研究和应用价值;同时采用重组技术获得了稳定性更好、批间差更小的重组抗体或其抗原结合片段,便于其应用,提高了检测效率,节约了试剂盒成本。使用包括抗体或其抗原结合片段和突变的抗体或其抗原结合片段的试剂盒,具有良好的广谱性和敏感性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为单克隆抗体nCoV3与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力(突变株Omicron-NP蛋白,delta-NP蛋白以及野生型WT-NP蛋白)的对比实验结果;
图2为重组抗体nCoV3-C与NP蛋白的结合能力检测结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例及附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的细胞株、试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得,它们仅作为举例,对本发明不是唯一的,可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的病毒学、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,SequencesofProteinsof Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR,命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabatetal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefrancetal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefrancetal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Chothia编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区”或“FR”残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomainantibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“全长抗体”意指,由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中,“全长重链”是指这样的多肽链,其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成;并且,当所述全长抗体为IgE同种型时,任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地,“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种,例如人;也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位,这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等,Nature 341:544546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而,即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“Fc”意指,由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能,但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单个多肽链,其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见,例如,Bird等人,Science242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等(1996),CancerRes.56:3055-3061,Kipriyanov等(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等(2001),Cancer Immunol.描述。在一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成di-scFv,其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中,scFv可形成(scFv)2,其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指,这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabillyetal.;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。在某些实施方案中,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体),其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体),而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同一性。通常而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体),全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地,人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”,提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中,供体免疫球蛋白是非人源(例如鼠)抗体,受体框架可以天然存在的人框架,或与其相比具有约85%、90%、95%、99%或更高同一性的序列。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(例如鼠)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得,并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。为制备嵌合抗体,可使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如,将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242),包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如,将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242),包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区,但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体,可以使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的CDR区移植入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539;Queen等的美国专利Nos.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370;以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume248,Humana Press,New Jersey,2004)。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定,例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖本文提供的抗体序列的各种变体。术语“变体”是指,保留其亲本抗体对于SARS-CoV-2的结合特异性,但具有由突变赋予的一个或多种期望特性。抗体变体在上述的一个或多个CDR序列中、重链可变区或轻链可变区的一个或多个非CDR序列中和/或恒定区(例如Fc区)中,包括一个或多个突变。举例来说,抗体变体可具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、降低的糖基化风险、降低的脱氨基作用、降低或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH灵敏性和/或与结合的相容性。可使用所属领域中已知的方法,例如“丙氨酸扫描诱变”(参见例如Cunningham和Wells(1989)《Science》,244:1081-1085),来筛选亲本抗体序列以鉴定进行修饰或取代的合适的或优选的残基。简单来说,可鉴定靶标残基(例如带电残基,如Arg、Asp、His、Lys和Glu),且所述靶标残基可被中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换,且产生已修饰的抗体且针对所关注特性进行筛选。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。包括质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可以含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“同一性”或“同源性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。
在本文中,核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”“核苷酸”是同义的,包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如,Immunology-ASynthesis(2ndEdition,E.S.Goluband D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
本发明实施例提供一种抗体或其抗原结合片段,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,其包括下述三个依据Chothia编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH):
(a)氨基酸序列SEQ ID NO:1,其序列组成为GFSLSTFGM,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(b)氨基酸序列SEQ ID NO:2,其序列组成为WWDDD,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和/或,
(c)氨基酸序列SEQ ID NO:3,其序列组成为ITEDYGVYVGWYFDV,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;
和/或,还包括下述三个依据Chothia编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL):
(d)氨基酸序列SEQ ID NO:4,其序列组成为RASSNVKYMY,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,
(e)氨基酸序列SEQ ID NO:5,其序列组成为YTSNLAS,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列,和/或,
(f)氨基酸序列SEQ ID NO:6,其序列组成为QQFTSSPFT,或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
具体地,所述置换为保守置换。
具体地,所述抗体或抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示序列,或者,其与SEQ ID NO:7所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性;所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含序列如SEQ ID NO:8所示序列,或者,其与SEQ ID NO:8所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。
具体地,所述抗体或其抗原结合片段可以是双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
具体地,所述抗体或其抗原结合片段包括一个或多个氨基酸突变但仍保持与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合。具体地,其中所述突变中的至少一个在一个或多个VH或VL序列中但不在任一个CDR序列中。
具体地,所述抗体或抗原结合片段是由于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏号为CGMCC No.45316的杂交瘤细胞产生的。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是人源化的,以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的,例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的CDR区移植入人源框架序列。
在一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段还包含抗体恒定区。
具体地,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区是选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区。
具体地,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源可以是大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人。在一个具体的实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠。
本发明的抗体或抗原结合片段的亲和力可以通过本领域已知的任何方法确定。例如,可以通过Elisa、RIA、BIAcore或KinExA等技术测量结合的亲和力,还可以通过BIAcore或KinExA技术测量解离速率。例如使用BIAcore(SPR)通过表面等离子体共振测量结合亲和力和解离速率。
在一些实施方案中,本发明抗体或抗原结合片段以10-8M或更小的KD结合SARS-CoV-2NP蛋白。
在一些实施方案中,本发明抗体或抗原结合片段以小于100nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于10nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,在一些实施方案中,以小于1nM的EC50结合SARS-CoV-2NP蛋白,例如以0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合SARS-CoV-2蛋白。
本发明实施例提供一种杂交瘤细胞,所述杂交瘤细胞产生上述的抗体,所述杂交瘤细胞于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.45316。
可以通过免疫合适的宿主(例如,脊椎动物,包括人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、马、爬行动物、鱼、两栖动物,及鸟、爬行动物和鱼的卵)产生抗体。可以用本领域已知的任何方法免疫动物,免疫非人动物,如小鼠、大鼠、兔等的方法是本领域公知的。
在一个实施方案中,是用SARS-CoV-2NP蛋白免疫小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,得到杂交瘤细胞,并使用ELISA方法初步筛选出阳性杂交瘤细胞而制得。
本申请的抗体可以是来自杂交瘤的单克隆抗体,还可以是重组抗体。筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞后,可以通过逆转录酶-PCR从细胞回收重链和轻链可变区cDNAs,然后可以在宿主细胞诸如COS或CHO细胞中,选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区),表达这些可变区。然后在体外进行分析筛选,分离出表达目标抗体的宿主细胞。
在上述单克隆抗体基础上,还可以在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变,筛选出突变的重组载体。
本发明实施例提供一种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码上述的抗体或其抗原结合片段。
具体地,所述核苷酸序列编码所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中,本发明的核苷酸序列还包括CDR区或非CDR区的突变,核苷酸序列还可以包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。
本发明实施例提供一种载体,所述载体含有编码本发明抗体或抗原结合片段的核苷酸序列,所述载体为克隆载体或表达载体,所述载体包括上述的核苷酸序列。
在一些具体实施方案中,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
在一个具体的实施方式中,所述克隆载体为pTOPO载体,所述表达载体为真核表达载体,在一个实施例中,所述表达载体为pCDNA3.1载体。
本发明实施例提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述的核苷酸序列或包含上述的载体。
具体地,所述宿主细胞的制备方法为,将包含上述的核苷酸序列或包含上述的重组载体导入宿主细胞内。
具体地,所述宿主细胞包括但不限于,原生动物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
在一些实施方式中,本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞,例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHODG44)。在一个具体的实施例中,本发明的宿主细胞是CHO细胞。
本发明实施例提供一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括培养上述的宿主细胞或杂交瘤细胞,回收得到所述抗体或其抗原结合片段。
本发明实施例提供一种上述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明实施例提供一种检测新型冠状病毒的方法,所述方法用于非诊断目的,包括使用上述的抗体或抗原结合片段的步骤。
在一些实施方案中,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒蛋白检测的方法。
在一些实施方案中,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种。
在一些实施方案中,所述可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
在一些实施方案中,所述催化底物显色的酶选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶和乙酰胆碱脂酶中的任意一种。
在一些实施方案中,所述荧光物质选自伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧光素,若丹明,二氯三嗪基胺荧光素,丹磺酰氯和藻红蛋白中的任意一种。
在一些实施方案中,所述化学发光试剂为氨基苯二酰肼。
在一些实施方案中,所述放射性同位素选自3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lμ、166Ho和153Sm中的任意一种。
本发明实施例提供一种试剂或试剂盒,包含上述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中,所述试剂盒基于乳胶微球的免疫层析方法或胶体金的免疫层析方法。
在一些实施方案中,所述试剂盒包括标记示踪物的标记抗体、包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体,所述标记抗体为上述的抗体或所述包被抗体为上述的抗体。
在一些实施方案中,所述示踪物为乳胶微球、胶体金或荧光微球。
在一些优选的实施方案中,包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体的浓度为0.5-2mg/mL,优选为1mg/mL,标记乳胶微球的标记抗体的量为20μg-200μg/mg,优选为50-150μg/mg,进一步优选为50-100μg/mg,再优选为100μg/mg,标记胶体金的标记抗体的量为5-20μg/mL,优选为10μg/mL。
在一个具体的实施方式中,试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备乳胶微球或胶体金标记的标记抗体;
(2)在乳胶微球或胶体金标垫上包被乳胶微球或胶体金标记的标记抗体;
(3)在硝酸纤维素膜上包被包被抗体,作为检测线(T线);
(4)在PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫或胶体金标垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸,即得。
若检测样品为阳性,其中的样本中的新型冠状病毒抗原与标记乳胶微球或胶体金的标记抗体结合形成复合物,在层析作用下复合物沿纸条向前移动,经过检测线时与包被在硝酸纤维素膜上的包被抗体反应,形成免疫复合物而呈现红色条带;若检测样本为阴性,其中样本中不含有新型冠状病毒抗原,不会形成免疫复合物,在检测线处不会出现条带,仅在质控线显色;质控线在检测阳性样本和阴性样本时均应出现条带,所显现的带色条带是判定层析过程是否是正常的标准,同时也作为试剂的内控标准。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
实施例1:杂交瘤细胞的建立及筛选
抗原偶联和免疫
将纯化出的SARS-CoV-2NP蛋白(WT野生型)作为免疫原以用于免疫小鼠。小鼠选取6-8周龄、雌性BALB/c小鼠。将小鼠共免疫4次,每次免疫间隔2周,免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经背部皮下多点注射,后三次免疫将SARS-CoV-2NP蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合,经腹腔注射。第四次免疫后7天,对小鼠断尾采血,分离血清,采用间接ELISA方法检测免疫小鼠抗血清的抗体效价水平,以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合实验,在细胞融合实验前3天用不加佐剂的SARS-CoV-2NP蛋白经腹腔注射加强免疫(100μg/只)。
杂交瘤细胞的建立
融合当天,在无菌条件下取出经免疫小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5的比例融合,充分混匀,在与PEG融合前,洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500,轻轻振荡,以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞,再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中,并且在37℃、5%CO2条件下培养细胞。培养4至7天后,改用HT培养基进行培养,当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时,取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选
取SARS-CoV-2NP蛋白,用包被缓冲液(0.05mol/L,pH9.6,PBS)稀释,最终浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔板中,于4℃包被过夜;弃包被液,用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次,拍干;用含2%BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干;将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔加入至相应孔内,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干;加入四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)底物,100μL/孔,室温避光显色10min;每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
在酶标仪的450nm波长下,检测酶标板中所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1,以测定孔(SARS-CoV-2NP)的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
实施例2:单抗的制备与纯化
阳性细胞株克隆化
将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后,稀释成100个细胞/10mL培养基,将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6-7天后,显微镜下可观察到克隆细胞的形成,标记出单个克隆生长孔,取出细胞上清,进行ELISA检测(与上述融合检测相同),选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。最后获得两株稳定分泌抗SARS-CoV-2NP抗体的细胞株,分别命名为杂交瘤细胞株D6C9和F1G11。
杂交瘤细胞D6C9于2022年9月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.45316。
杂交瘤细胞F1G11的保藏号为CGMCC No.45315。
细胞上清单抗的制备与纯化
将上述的杂交瘤细胞株用含15%血清的RPMI-1640培养基于10cm培养皿中培养,当扩培至约4×107个/皿时,以800rpm离心5min,弃上清并将细胞转移到2L转瓶中,加入无血清培养基,使细胞密度约为3×105个/ml,转瓶培养。继续培养1~2周后,当细胞死亡率达到80%-90%时(此时细胞密度大概为1×106-2×106个/ml),收取细胞悬液,以6000rpm高速离心20min,取上清,对该上清液采用Protein A免疫层析法进行纯化。
将由D6C9杂交瘤细胞制备的单克隆抗体记作nCoV3。
经微量分光光度计鉴定,nCoV3单克隆抗体的浓度约为2-4mg/mL。将纯化后的单抗浓度测定,并分装(100μL/管,浓度为1mg/ml),保存在4℃-8℃。
纯度检测
用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析该单克隆抗体,在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下,利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比,纯度均达到大于98%。
实施例3:抗体与SARS-CoV-2NP蛋白结合能力(突变株Omicron-NP蛋白,delta-NP蛋白以及野生型WT-NP蛋白)测试
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释三种SARS-CoV-2NP蛋白,使其浓度为1μg/ml,以100μL/孔加入至96孔酶标板,于4℃包被过夜,在自动洗板机上用PBST洗涤3次,拍干。HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白,以相同浓度、方式包板处理,作为对照。用含2% BSA的PBST封闭,150μL/孔,于37℃孵育2h,用PBST洗涤3次,拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗SARS-CoV-2NP蛋白nCoV3单克隆抗体进行梯度稀释,抗体起始浓度为5μg/ml,依次按三倍用PBS进行梯度稀释,得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板,于37℃孵育1h,洗涤3次,拍干。加入1:20000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自sigma),100μL/孔,于37℃孵育1h,用PBST洗涤3次,拍干。TMB底物以100μL/孔加入,于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪在450nm(OD)下测定光密度(OD450nm)。
通过Elisa实验分析单克隆抗体nCoV3对SARS-CoV-2NP的结合活性。结果如图1所示,尽管强度不同,该单克隆抗体均可特异性结合SARS-CoV-2的NP,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,其中,nCoV3单克隆抗体与野生毒株WTSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.213nM,与奥密克戎OmicronSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.278nM,与德尔塔DeltaSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.25nM,并且,该单克隆抗体对其他四种常见冠状病毒:HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应(图片仅显示了HCoV-HKU1作为对照的结果)。
实施例4:抗SARS-CoV-2NP蛋白单克隆抗体可变区序列的克隆和测序
从上述杂交瘤细胞株分离总RNA,通过反向转录制备cDNA,以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列,并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(北京聚合美)说明书,对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录,参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit说明书(北京聚合美)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录,制得cDNA,冻存于-20℃备用。以上一步骤所得cDNA为模板,采用通用引物扩增重链及轻链cDNA,回收PCR扩增产物,PCR反应全程使用热稳定性PfuDNA聚合酶。按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(北京聚合美)说明书,将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,进行测序。对测序得到的杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析,经分析,重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表1所示。
表1:抗体nCoV3的重链可变区、轻链可变区、重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列(依据Chothia编号系统)
备注:划线部分为CDR区域
实施例5:重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体,通过真核表达制备稳定表达抗SARS-CoV-2NP抗体的细胞株,并对其进行大规模培养纯化。
采用PCR方法,以反转录得到的cDNA为模板,扩增鼠单克隆抗体重轻链可变区基因(VH和VL),并经测序确定序列。
对抗体的VL和VH基因,用分子克隆的方法构建重组抗体真核表达载体。将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞,电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20天后取上清进行ELISA检测(用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG为二抗进行筛选,方法同上),筛选出稳定表达的重组抗体细胞株,得到的重组抗体记为nCoV3-C。
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养,进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/ml接种于滚瓶中,1L滚瓶含300ml培养基(Vega CHO),根据生产需求决定接种瓶数量,将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时,温度为37℃,二氧化碳为5%。培养7-9天后取样显微镜下观察,当细胞活率小于50%,离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体即为重组单克隆抗体。
同实施例3所述方法,检测重组抗体nCoV3-C与NP蛋白的结合能力,结果如图2所示。重组抗体nCoV3-C可特异性结合SARS-CoV-2的NP,对奥密克戎、德尔塔和野生毒株都显示出很好的亲和力,其中,nCoV3-C重组抗体与野生毒株WTSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.282nM,与奥密克戎OmicronSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.243nM,与德尔塔DeltaSARS-CoV-2NP蛋白结合的EC50为0.235nM,并且,该重组抗体对其他四种常见冠状病毒:HCoV-HKU1,HCoV-NL63、HCoV-229E和MERS-CoV的NP蛋白都没有交叉反应。
亲和力分析
进一步通过表面等离子共振技术(SPR)对nCoV3、nCoV3-C重组抗体与SARS-CoV-2NP蛋白进行亲和力鉴定。
将SARS-CoV-2NP蛋白和重组抗体换至pH7.4的SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl、150mM NaCl、0.05%Tween-20)。将nCoV3、nCoV3-C抗体稀释至1μg/mL,捕获到Protein A芯片上,之后将梯度稀释的SARS-CoV-2NP蛋白依次流过Protein A芯片各通道,数据用BIAevaluation软件进行分析,结合动力学参数,并计算亲和力常数(KD),结果如表2所示。
从表2可看出,nCoV3和nCoV3-C抗体与WTSARS-CoV-2的亲和力分别为1.72×10-9M和2.13×10-9M,说明该抗体可以以高亲和力结合WTSARS-CoV-2NP蛋白,结果见下表2:
表2:nCoV3和nCoV3-C抗体与不同株别的SARS-CoV-2NP蛋白的亲和力测定结果
nCoV3 nCoV3-C
WT <![CDATA[1.72×10<sup>-9</sup>M]]> <![CDATA[2.13×10<sup>-9</sup>M]]>
Omicron <![CDATA[2.16×10<sup>-9</sup>M]]> <![CDATA[1.81×10<sup>-9</sup>M]]>
Delta <![CDATA[1.87×10<sup>-9</sup>M]]> <![CDATA[1.78×10<sup>-9</sup>M]]>
实施例6:基于乳胶微球的免疫层析测试检测SARS-CoV-2NP
抗体标记微球,其包括如下步骤:
1.清洗微球:1mg微球加入一定量0.1M的4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液pH 6.0,混匀后20000rpm离心20min,去上清;
2.活化:加入一定体积的MES缓冲液pH 6.0,超声混匀,加入12μg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与12μg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),37℃反应15min,每5min混匀一次,离心20000rpm,20min弃上清;
3.偶联:加入一定体积的50mM pH=8.0的硼酸缓冲液,超声混匀,加入100μg标记抗体,37℃混匀反应过夜;
4.封闭:加入1ml BSA(5%)封闭1h,20000rpm离心20min,弃上清。
5.清洗:用0.1M pH8.5 Tris-HCl清洗2次,20000rpm离心20min,弃上清;
6.保存:加入25mM MES(pH=7.4)0.5ml保存,用25mM MES(pH=7.4),1%BSA,0.1%Tween20稀释50倍后冻干密封备用。
包被硝酸纤维素膜(NC膜):包被抗体,用10mM pH 7.4PBS,2%蔗糖溶液稀释至终浓度1mg/mL,作为T线划线液;10mM pH 7.4PBS,2%蔗糖溶液稀释鼠抗人IgG至1.5-2mg/mL作为C线划线液。采用划膜仪,将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维膜(赛多利斯140)上,划线液体量:1μL/cm;划膜速度:50mm/s。将划好的NC膜置于37℃环境烘干6-12小时,密封备用。
准备样品垫:使用10mM pH7.4 PBS处理样品垫,冻干备用;
免疫层析体系的组装:将上述已标记抗体的乳胶微球、包被有抗体的NC膜、样品垫、吸水纸、聚酯板按常规方式组装成免疫层析快速测试卡。
灵敏度测试
分别检测含有不同浓度(2ng/mL至0.001ng/mL)的重组抗原的样本。具体地,将80μL待测样本滴加至快速测试卡,室温放置15分钟后,肉眼观察并判定结果。根据显色条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性,结果如表3-4所示,以HCoV-HKU1 NP蛋白作为对照。将显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性。色卡分为C1-C9九档,其中,C1为强阳性,表示单位活性最高,中间梯度递减,C9为最弱阳性,表示单位活性最低。另外,表中的B表示空白。
本实施例T线(包被)抗体为HA811-41MB(Heavybio,产品代码2C10MB),浓度1mg/mL,标记抗体为nCoV3,每1mg乳胶微球偶联100μg抗体,结果见下表3:
表3:基于乳胶微球的免疫层析反应结果
稀释梯度(ng/mL) 2 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001
WT-NP C1 C1 C3 C5+ C6+ C6 C7+ C7
Delta-NP C1 C2 C4+ C5+ C6+ C7+ C7 C8
Omicron-NP C1 C2 C4+ C5+ C6+ C7+ C7 C8
HCoV-HKU1 NP B B B B B B B B
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为1pg/ml,对delta型NP的最低检测限为5pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为5pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV3,浓度2mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1mg乳胶微球偶联200μg抗体,结果见下表4:
表4:基于乳胶微球的免疫层析反应结果
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为5pg/ml,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV3-C,浓度1mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1mg乳胶微球偶联50μg抗体,对野生型NP的最低检测限为1pg/mL,对delta型NP的最低检测限为5pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为5pg/mL。
实施例7:胶体金免疫层析测试
胶体金制备:在三角烧瓶中加入100ml超纯水,加热至沸腾,加入2ml 2%氯金酸(Sigma-Aldrich公司,货号:16961-25-4)溶液,沸腾后立刻加1ml 2%柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司,货号:6132-04-3)水溶液,继续搅拌沸腾10分钟,自然冷却备用。
标记胶体金偶合物:取10ml上述胶体金放入烧杯中,搅拌中加入120μl的0.2MK2CO3调节pH至7.0,继续搅拌10秒;加入100μg标记抗体,继续搅拌5分钟;加入0.1ml 10%BSA,继续搅拌5分钟;12000g离心10分钟,弃掉上清,将沉淀用胶体金稀释液(10mM PB,150mMNaCl,0.2%BSA,0.1%TritonX-100,3%Sucrose,0.01%Proclin300)定容至1ml,作为抗SARS-CoV-2NP单克隆抗体胶体金复合物。
制备胶体金垫:将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(上海金标公司),冻干,即制成金标垫。
硝酸纤维素膜(NC膜)包被:稀释包被抗体至1mg/ml,制成检测线工作液,用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司,货号:HF135002)的相应位置上,50℃干燥1小时,备用。
胶体金免疫层析测试试剂条的组装:将上述金标垫、包被有抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成胶体金免疫检测试剂条。
灵敏度检测
分别检测不同浓度的重组抗原的样本。具体地,将80μl待测样本滴加至样品垫处,室温放置15-30分钟,判定结果。根据显示条带颜色的深浅,可以指示出样本中抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性,结果如表5-6所示,以HCoV-HKU1 NP蛋白作为对照。
本实施例T线抗体为HA811-41MB,浓度1mg/mL,标记抗体为nCoV3,每1mL胶体金偶联10μg抗体,结果见下表5:
表5:基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/ml)
稀释梯度(ng/mL) 10 5 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005
WT-NP C1 C1 C3 C4 C5+ C6 C7+ C7
Delta-NP C1 C2 C4+ C5+ C6+ C7+ C7 C8
Omicron-NP C1 C2 C4 C5 C6+ C7+ C7 C8
HCoV-HKU1 NP B B B B B B B B
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为5pg/mL,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV3,浓度2mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1ml胶体金偶联20μg抗体,结果见下表6:
表6:基于胶体金的免疫层析反应结果(重组抗原单位为ng/ml)
稀释梯度(ng/mL) 10 5 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005
WT-NP C1 C1 C4+ C4 C5 C6+ C7 C8
Delta-NP C1 C2 C4 C5 C6 C7 C8 C9
Omicron-NP C1 C2 C4 C5 C6 C7 C8 C9
HCoV-HKU1 NP B B B B B B B B
若以C7为阳性标准,对野生型NP的最低检测限为10pg/mL,对delta型NP的最低检测限为50pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为50pg/mL。
在另一个实施例中,T线抗体为nCoV3-C,浓度1mg/mL,标记抗体为HA811-41MB,每1ml胶体金偶联10μg抗体,对野生型NP的最低检测限为5pg/mL,对delta型NP的最低检测限为10pg/mL,对omicron型NP的最低检测限为10pg/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其与SARS-CoV-2NP蛋白特异性结合,所述抗体或其抗原结合片段的重链包括分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链可变区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,所述抗体或抗原结合片段的轻链包括分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链可变区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3,其中,SEQ ID NO:1所示序列为GFSLSTFGM,SEQ ID NO:2所示序列为WWDDD,SEQ ID NO:3所示序列为ITEDYGVYVGWYFDV,SEQ IDNO:4所示序列为RASSNVKYMY,SEQ ID NO:5所示序列为YTSNLAS,SEQ ID NO:6所示序列为QQFTSSPFT。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于:所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示序列,或者,其与SEQ IDNO:7所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性;
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示序列,或者,其与SEQ ID NO:8所示序列有80%、85%、90%以上的序列同源性,优选有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同源性。
3.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段选自双功能抗体、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、Fv、(dsFv)2、dsFv、dsFv-dsFv'、二硫键稳定的双功能抗体、scFv、scFv二聚体、多特异性抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体中的任意一种。
4.权利要求2所述的抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段还包含恒定区;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE中的任意一种的恒定区;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区的种属来源为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人;
优选的,所述抗体或抗原结合片段的恒定区来源于小鼠。
5.一种杂交瘤细胞,其特征在于,所述杂交瘤细胞保藏号为CGMCC No.45316。
6.一种载体,其特征在于,所述载体含有编码权利要求1-3任一项所述的抗体或抗原结合片段,优选的,所述载体选自pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任意一种。
7.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含如权利要求6所述的载体。
8.权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测新型冠状病毒蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
9.一种试剂或试剂盒,其特征在于,其含有权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合片段。
10.一种检测新型冠状病毒的方法,其特征在于,所述方法用于非诊断目的,包括使用权利要求1-4任一项所述的抗体或抗原结合片段的步骤;
优选的,所述方法是通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法;
优选地,所述通过标记可显示信号指示剂实现新型冠状病毒NP蛋白检测的方法选自胶体金法、免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法中的任意一种或几种;
优选地,所示可显示信号指示剂选自胶体金、荧光物质、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。
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