CN108169492A

CN108169492A - 一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108169492A
Application number: CN201711382428.7A
Authority: CN
Inventors: 乔薪瑗; 王丽; 李经; 李一经; 唐丽杰; 徐义刚; 崔文; 姜艳平
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN108169492B

Abstract

本发明公开了一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。所述的试纸条包括从左到右依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸，还包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有胶体金颗粒标记的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置；其中，所述的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体是由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心的，菌种保藏编号为CGMCC NO.14726的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明制备的试纸条，灵敏度好，特异性高，操作简单、快速，适用于现地检测。

Description

一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测牛轮状病毒的试纸条，特别涉及一种基于胶体金技术制备的用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

牛轮状病毒(Bovine Rotaviens,BRV)，属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起犊牛腹泻的主要病原之一。牛轮状病毒主要感染15-45日龄犊牛，发病早期表现为精神沉郁、流涎、腹泻，若不及时治疗，病牛可发生脱水、体温下降，极易继发细菌感染，并导致死亡。给我国养牛业带来严重危害和巨大的经济损失。因此，研究与开发牛轮状病毒检测的新技术，建立敏感性强、特异性高的快速检测方法对诊断和防控牛轮状病毒病，提高我国畜牧业的整体发展水平，推动畜牧业的健康发展具有重要的实践意义。

目前，我国对牛轮状病毒病的经典检测方法是电镜技术、分离培养、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸电泳法、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。电镜技术要求样品中RV达到一定数量才能检测到，并且要求具备特殊设备和专业技术人才，基层单位普及困难，应用受到限制。体外分离培养RV难度大、周期长，多数RV需要经过胰蛋白酶及胰凝乳酶等蛋白水解酶处理后才能适应细胞生长。因此，该方法局限性较大，且不利于大规模检测。免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸电泳法、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法检测病原，对仪器和设备的要求较高，只适用于实验室检测，不适于现地检测。

免疫胶体金技术的应用，最早出现在1980年，用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)，1985便实现了商品化。胶体金技术是一种新型的免疫标记物，在各研究领域都得到了广泛应用。比如食品安全方面，检测瘦肉粉，蛋白粉，食用色素，抗生素等含量。在临床上检测病毒感染、细菌感染，为临床诊断提供了更便捷的技术。随着胶体金标记技术的发展，延伸至电镜领域，形成了胶体金免疫电镜技术，目前是最敏感的免疫组化方法。胶体金颗粒的优点在于，不染色可直接观察，与其他物质区别大，分辨率高，用于定位结果准确。对组织细胞的吸附作用小，特异性好。薛拥志等用胶体金颗粒标记新城疫病毒后通过电镜观察，与直接电镜观察病毒结果比较，发现用胶体金免疫电镜技术更容易找到病毒粒子，说明免疫金标记可以显著提高病毒检出率。胶体金探针主要用于电子显微镜的标记，当以不同的方式制备时，颗粒的密度与直径有很大的选择空间，使得它们适用于不同的试验需要。在分子水平上，金颗粒直径增大到30-100nm；在宏观层面上，这将致在含有结合金颗粒的区域形成深色染色，大大增加了可见度和对比度。近年来将金标记应用于传感器研究增多，Brainina等，Tang等，Kitano等都通过实验验证了标记特异性蛋白胶体金在生物传感器上的作用，且敏感性与稳定性都有所提高。

本发明通过获得BRV多克隆抗体和单克隆抗体腹水，结合胶体金免疫层析技术制备成胶体金免疫层析试纸条。胶体金免疫层析试纸条具有简单快速、结果清晰的特点，无需复杂的操作技巧和特殊设备，且成本低、携带方便，因此，本发明的提出为BRV的快速诊断提供了一种敏感、特异的现地检测方法，对BRV的综合防控具有重要的实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速、适用于现地检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明选择牛轮状病毒VP6蛋白作为免疫原，经过细胞融合、筛选和克隆，最终获得5株抗BRV VP6蛋白的单抗，分别命名为5C9、3G10、6E11、4D10和5A3。抗体亚类鉴定结果表明：3G10、6E11和5C9为IgM亚类，4D10和5A3为IgG2a亚类。5株杂交瘤细胞3G10、6E11、5C9、4D10和5A3细胞上清效价分别为1:500、1:800、1：800、1：1000，1：800。Western blot和间接免疫荧光实验结果均表明，5株单抗与BRV具有良好的亲和性；特异性实验结果显示，5株单抗与PoRV、PEDV、BPV及TGEV均无交叉反应，说明单抗特异性良好。然后，本发明通过制备抗BRV VP6蛋白单克隆抗体腹水和兔抗BRV多抗血清，利用双抗体夹心原理建立一种检测BRV病原的胶体金免疫层析试纸条。特异性实验结果显示，制备的胶体金免疫层析试纸条与PoRV、TGEV、PEDV、BPV均无交叉反应。敏感性实验表明，制备的胶体金免疫层析试纸条对BRV的最小检出量约为10⁵个TCID₅₀。不同批次间有良好的重复性，且该胶体金免疫层析试纸条在10min内即可检测出样品是否含有BRV。通过对临床样品的检测，结果表明：胶体金免疫层析试纸条的检测结果与RT-PCR检测结果相符。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条，所述的试纸条按照包括从左到右的依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸，以及位于下方的PVC底板、其中PVC底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有胶体金颗粒标记的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置；

其中，所述的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体是由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心的，菌种保藏编号为CGMCC NO.14726的杂交瘤细胞株分泌产生。

该杂交瘤细胞株，命名为4D10，分类命名为分泌牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCCNO.14726，保藏时间为2017年10月18日。

使用所述的胶体金免疫层析试纸条用于牛轮状病毒检测时按照以下步骤进行：

(1)在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果；

(2)结果判定：

阳性结果：质控线和检测线都出现红色条带；

阴性结果：仅在质控线出现现一条红色条带；

无效结果：若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的胶体金免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤：

(一)胶体金垫的制备

(1)玻璃器皿洗干净，浓H₂SO₄中浸泡24h，冲洗10次洗净残留的浓H₂SO₄，再用洗涤剂刷洗玻璃器皿，自来水冲洗10次，去离子水反复清洗5次，超纯水冲洗3-4次，烘箱干燥后，使用含5w/v％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液硅化，然后用去离子水冲洗，干燥备用；

(2)将1g氯金酸加入硅化后的玻璃瓶中，再加入超纯水定容至100mL，用0.45μm滤器过滤除菌；取1mL配制好的1w/v％的氯金酸溶液于步骤(1)硅化处理过的锥形瓶中，加超纯水至100mL，稀释后的氯金酸溶液置于水浴锅中加热煮沸2-3min，用玻璃棒剧烈搅拌溶液的同时加入1-2ml 37℃预热的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5-8min后室温冷却，冷却后加入超纯水定容至100mL，用0.2mol/L的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液pH至7.2-7.5，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存，得到裸胶体金溶液；

(3)待标记抗体的准备

取出纯化的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体腹水，调整抗体浓度至1mg/mL，离心除去蛋白聚合物，调节待标记抗体溶液pH在8.5-9.0之间；

(4)取裸胶体金溶液离心，以除去溶液中形成的聚合物；调整裸胶体金溶液pH值在8.5-9.0之间，将待标记抗体溶液逐滴加入裸胶体金溶液中，加入时要边搅拌边加，1mg的抗体在4-6min内加完，然后室温静置；

(5)向步骤(4)得到的溶液中加入Tris-HC1缓冲液配制的10w/v％BSA溶液至其终浓度为1％作为稳定剂，以防止发生非特异性凝聚，室温下继续搅拌5min，室温静置15min；

(6)将步骤(5)得到的溶液1500r/min 4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min，得到可流动的棕红色高浓度的金标抗体；将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液稀释5-10倍，得到金标抗体溶液，4℃避光保存备用；

所述的金标抗体复溶液为含1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/L pH为7.2的PB溶液，4℃保存备用；

(7)先将玻璃纤维素膜浸泡在含0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1％w/v BSA的0.01mol/L PB溶液中10-20min，置于37℃烘箱中干燥12h，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干，得到胶体金垫；

(二)硝酸纤维素膜的制备

选择pH7.2的0.01mol/L PB溶液稀释纯化的兔抗牛轮状病毒多克隆抗体和山羊抗鼠IgG，划线后在37℃烘干箱中，烘干1-2h；将划好线的硝酸纤维素膜，浸于含有3w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液中，37℃封闭1h后，用PBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min，洗完膜后烘干；

(三)样品垫的制备

室温下，将样品垫浸泡在样品垫处理液中30min，然后放入37℃烘箱中烘干2-3h，用于组装试纸条；所述的样品垫处理液为含有0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA的0.01mol/L PB溶液；

(四)试纸条的组装

按照从左到右的依次为样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸的顺序，将制备好的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸组装到PVC底板上，即得。

其中，优选的，制备得到的裸胶体金溶液中胶体金颗粒的粒径为20nm。

其中，优选的，选择稀释后浓度为1.0mg/mL的山羊抗鼠IgG包被质控线；选择稀释后浓度为2.77mg/mL的兔抗牛轮状病毒多克隆抗体包被检测线。

其中，优选的，鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体的标记量为83.69μg/mL。

其中，优选的，调节待标记抗体溶液的pH为8.5；调节裸胶体金溶液的pH为8.5。

更进一步的，本发明还提出了所述的胶体金免疫层析试纸条在制备检测牛轮状病毒试剂中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备的胶体金免疫层析试纸条，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性，且储存方便、保存期长、操作简单，检测速度快，适用于牛轮状病毒感染的快速诊断，并可用于基层组织的现地检测。

附图说明

图1为BRV VP6蛋白表达SDS-PAGE鉴定结果；

M.低分子量蛋白Marker；1.pProHTa-BRV-VP6/Rosetta(DE3)诱导后；2.pProHTa-BRV-VP6/Rosetta(DE3)诱导前；

图2为纯化后VP6蛋白的鉴定；

M.低分子量蛋白Marker；1.纯化后的BRV VP6蛋白；

图3为4D10、5A3、6E11、3G10、5C9和SP2/0细胞染色体计数；

图4为Western-blot检测单克隆抗体；

M：蛋白Marker；1：BRV；2：MA104；

图5为5株杂交瘤细胞间接免疫荧光结果；

图6为单抗特异性鉴定结果；

图7为胶体金免疫层析试纸条组装图；

图8为胶体金免疫层析试纸条结果判定；

图9纯化后多抗的SDS-PAGE分析；

M：蛋白Marker；1：纯化后多抗；

图10为纯化后抗体的SDS-PAGE分析；

M：蛋白Marker；1：纯化后单抗腹水；2：纯化前单抗腹水；

图11为不同大小胶体金颗粒稳定性；

图12为胶体金的电镜观察结果；

图13为金标抗体最适标记量结果；

图14为胶体金标记抗体最适pH的测定；

图15为金标抗体和多抗质量鉴定结果；

1：金标抗体；2：兔抗BRV多抗；

图16为金标垫处理液的选择；

1：A处理液吸收效果；2：B处理液吸收效果；3：C处理液吸收效果；4：D处理液吸收效果；5：A处理液释放效果；6：B处理液释放效果；7：C处理液释放效果；8：D处理液释放效果；

图17为包被液选择结果；

1：0.01PB mol/L溶液；2：PBS溶液；3：20mmol/L Tris-Cl溶液；

图18为封闭液的选择结果；

1：3w/v％BSA；2：5w/v％BSA；3：3w/v％脱脂乳；4：5w/v％脱脂乳；

图19为样品垫处理液的选择结果；

1：A处理液；2：B处理液；3：C处理液；4：D处理液；

图20为质控线抗体浓度的确定1：2.0mg/mL山羊抗鼠IgG；2：1.5mg/mL山羊抗鼠IgG；3：1.0mg/mL山羊抗鼠IgG；4：0.5mg/mL山羊抗鼠IgG；

图21为检测线抗体浓度的确定；

1：11.08mg/mL多抗；2：5.54mg/mL多抗；3：2.77mg/mL多抗；4：1.38mg/mL多抗；5：0.69mg/mL多抗

图22为试纸条特异性试验结果；

1：BRV；2：PoRV；3：PEDV；4：TGEV；5：BPV；6：MA-104细胞上清；7：PB溶液；

图23为试纸条批内重复性试验结果；

图24为试纸条批间重复性试验结果；

图25为阳性样品PCR检测结果；

M：DNA Marker；1：辽宁40号；2：吉林12031号；3：吉林761565号；4：吉林310083号；5：阳性对照；6：阴性对照

图26为阳性样品试纸条检测结果。

1：辽宁40号；2：吉林12031号；3：吉林761565号；4：吉林310083号；5：阳性对照；6：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1分泌抗牛轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选及建立

1试验材料

1.1菌株、细胞与病毒

表达牛轮状病毒VP6蛋白的重组菌pProHTa-NCDV-VP6/Rosetta由本实验室构建并保存(该重组菌已记载在以下文献中：“牛轮状病毒VP6蛋白间接ELISA检测方法的建立”，张怡婷等，中国兽医科学，2010,40(10),1039-1043)；BRV NCDV细胞适应株购自中国兽医药品监察所，MA104细胞由本实验室保存。

1.2实验动物

SPF级BALB/c小鼠、体重2～3公斤的健康雌性家兔均购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.3试剂

(1)溶液I：12g尿素、1.56g NaH₂PO₄·2H₂O及0.12g Tris-Base溶于100mL三蒸水中，调pH于8.0，-4℃保存。

(2)溶液II：24g尿素、1.56g NaH₂PO₄·2H₂O及0.12g Tris-Base溶于100mL三蒸水中，调pH于8.0，-4℃保存。

(3)溶液III：36g尿素、1.56g NaH₂PO₄·2H₂O及0.12g Tris-Base溶于100mL三蒸水中调pH于8.0，-4℃保存。

2试验方法

2.1免疫原的制备

将重组菌pProHTa-NCDV-VP6/Rosetta进行活化、传代。并将其接种于氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养。加入IPTG诱导剂，37℃诱导蛋白表达。采用超声破碎法提取蛋白，将提取的蛋白样利用切胶纯化的方法进行纯化，并测定蛋白浓度。

2.2动物免疫

将上述纯化的BRV VP6重组蛋白作为免疫原，具体免疫程序借鉴参考文献：抗猪轮状病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立[D].孟柳，东北农业大学,2014。

2.3杂交瘤细胞株的筛选与建立

选择抗体效价最高的BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞按照8：1的比例进行细胞融合。以BRV VP6重组蛋白为检测抗原，同时设置对照组。检测结果当P/N>2判定为阳性。采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。亚克隆一般需要3-4次即可，至筛选结果全部为阳性，此时的细胞株是单克隆细胞株。

2.4单克隆抗体效价的测定

观察阳性杂交瘤细胞的生长，待培养液呈明显黄色而且状态良好时收集培养上清液。抗原选择的是BRV细胞培养物，用于检测单抗的效价。

2.5单克隆抗体生物学特性鉴定

2.5.1杂交瘤细胞染色体数的鉴定

从细胞培养箱取出传代的杂交瘤细胞和SP2/0细胞。向细胞瓶中加入20μg/mL秋水仙素0.05mL，使其终浓度为0.1μg/mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中继续培养2.5h，使其染色体停止在分裂中期。将细胞用Giemsa染色液染色，在显微镜下观察。分别计数杂交瘤细胞和SP/20细胞10个形态完整、染色体分散良好、无重叠、无散失的单个细胞进行观察。对染色体计数分析，求出平均染色体数目。

2.5.2单抗亚类鉴定

将保存的5株杂交瘤细胞上清，采用单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚类，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

2.5.3杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定

将筛选的杂交瘤细胞株连续传代3个月，进行间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液效价。3个月后复苏冻存的杂交瘤细胞，调整细胞生长状态，待其状态良好时，收集细胞上清液，同样进行间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清效价。最后，将二者抗体效价进行对比，分析其分泌抗体的稳定性。

2.5.4单克隆抗体Western-blot鉴定

取纯化所得的病毒样品于EP管中，加入1/4体积的5×SDS buffer。沸水煮样10min，冰浴5min。蛋白样直接用于Western blot鉴定。

2.5.5单克隆抗体的特异性鉴定

选择BRV、PoRV、TGEV、PEDV和BPV与5株单抗进行特异性检测，SP2/0上清作阴性对照，通过间接ELISA方法进行检测。判定标准为：P/N>2即为阴性，表明5株单抗与上述病毒不发生交叉反应。

2.5.6单克隆抗体针对的抗原表位分析

采用叠加ELISA方法对单克隆抗体的表位进行初步分析，方法如下：

BRV病毒细胞培养物每孔200μL，4℃包被过夜或37℃孵育2h；PBST洗3次，每次5min；叠加ELISA的一抗需要加两次，先加入一种再加入另一种单抗上清，每次37℃孵育1h；洗涤，方法同上；选择5％脱脂乳稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，稀释倍数为1：1000，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗3次，每次5min；TMB显色，酶标仪OD₄₅₀读值。最后结果计算AI＝(A1.2--A1)/A2×100％(A1、A2为单独单抗的OD值，A1.2位叠加一抗的OD值)。判定标准：AI>50％表明识别抗原位点不同，AI<50％，则位点相似或相同。

3结果

3.1诱导表达VP6蛋白SDS-PAGE分析

重组菌pProHTa-NCDV-VP6/Rosetta扩大培养，加入IPTG诱导表达，诱导前与诱导后产物经SDS-PAGE分析，结果如图1。

经切胶纯化，得到纯化的VP6蛋白浓度为1.125mg/mL，SDS-PAGE结果如图2所示，纯化后的VP6蛋白与纯化前相比，无杂蛋白带减少，可见52kDa处有清晰条带，与所需蛋白大小相符。

3.2杂交瘤细胞株的筛选和建立

纯化的BRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠三次，在第三次免疫，测定鼠抗VP6血清的效价，当效价高于1:25600，对小鼠加强免疫，三天后进行细胞融合，融合结束后的3-5天，在镜下观察细胞融合情况，将检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆，克隆约3-4次。最终获得5株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为5A3、6E11、5C9、4D10和3G10。

3.3单克隆抗体效价的测定

将获得的5株杂交瘤细胞株扩大培养，调节细胞状态，收集细胞培养上清液。以BRV细胞毒为抗原，SP2/0细胞为阴性对照，经间接ELISA方法检测。检测结果为：3G10、6E11、5C9、4D10和5A3杂交瘤细胞上清液的效价分别为1:500、1:800、1：800、1：1000，1：800。所以选择4D10用于胶体金免疫层析试纸条的制备，并将该杂交瘤细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC NO.14726。

3.4杂交瘤细胞生物学特性鉴定

3.4.1单克隆抗体亚类鉴定

鉴定方法选择的是商品化单抗免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒。用试剂盒鉴定杂交瘤细胞分泌抗体的亚型。4D10和5A3两株杂交瘤细胞产生抗体类型为IgG2a，3G10、6E11和5C9三株杂交瘤细胞均为IgM。

3.4.2杂交瘤细胞染色体计数

骨髓瘤细胞及小鼠脾细胞染色体数分别为55～70条和40条。如图3所示，杂交瘤细胞染色体数数目比以SP2/0明显增多，经过染色体计数约为86～100条。接近于骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞染色体数之和。

3.4.3杂交瘤细胞稳定性鉴定

将3G10、6E11、5C9、4D10和5A3杂交瘤细胞连续传代3个月，并且经过反复的冻存和复苏，以BRV VP6为检测抗原，检测单抗细胞冻存前和冻存后效价。测得5株单抗细胞OD450nm，根据表1检测结果可知，单抗细胞冻存前后细胞上清的数值均显著高于SP2/0。由此可见杂交瘤细胞具有较好的稳定性。

表1杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定结果

3.4.4单克隆抗体Western-blot鉴定

结果见图4，可以发现5株杂交瘤细胞培养上清与BRV细胞培养物反应，在转印膜52ku处出现了明显的特异性条带，说明5株单抗均均与BRV发生特异性反应。

3.4.5间接免疫荧光试验

收集5株单抗上清分别与感染BRV的MA104细胞反应，加入荧光二抗。间接免疫荧光结果图5显示：5株单抗上清均与BRV反应，产生亮度较高荧光，而MA104无荧光出现，可知产生的荧光均为特异性荧光。

3.4.6单克隆抗体的特异性分析

将5株单抗上清和SP2/0上清分别与BRV及上述4种病毒反应。图6结果显示，5株单抗上清与BRV反应的P/N比都达到9左右，P/N值均远大于2。5株单抗上清与BPV、TGEV、PEDV和PoRV的P/N均小于1，说明5株单抗上清与上述不发生交叉反应，特异性很高。

3.4.7叠加ELISA试验结果

叠加ELISA方法对单克隆抗体表位进行初步分析，结果计算用公式：AI＝(A1.2--A1)/A2×100％。A1、A2为单独单抗的OD值，A1.2为两株叠加一抗的OD值。判定标准：AI>50％表明识别抗原位点不同，AI<50％为位点相似或相同。如下表2，说明5株抗体针对的抗原表位均不相同。

表2单克隆抗体表位初步分析结果

实施例2用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条的制备

1材料

1.1病毒与细胞

牛轮状病毒NCDV株、PoRV、TGEV、PEDV、BPV均由本实验室保存。MA-104细胞、SP2/0细胞均由实验室保存；牛轮状病毒VP6单克隆抗体细胞4D-10株均由本实验室制备。

1.2实验动物

SPF级10-12周龄BALB/c雌鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司；健康雌性家兔，体重2-3公斤。

1.3免疫层析材料

硝酸纤维素膜(M135)购自美国Milipore，玻璃纤维膜(GL0194)、吸水纸(H5076)、样品垫(GL-b02)、PVC板(A-9)、衔接胶带、快速检测塑料卡购自上海杰一。

1.4主要试剂的配制

1.4.1ELISA常用试剂及其配制方法

(1)包被稀释液：无水Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.93g，加超纯水1L，室温使用。

(2)洗涤液：0.5mL Tween-20加入1000mL PBS(KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，氯化钠8.0g，KCl 0.2g，1L去离子水，pH 7.2)中，转子室温混匀使用。

(3)封闭液：称取5g脱脂乳溶于100mL PB缓冲液(KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，1L去离子水)，少量配置，不易保存。

(4)终止液(2mol/L H₂SO₄)：将100mL的浓硫酸沿着玻璃棒缓慢地加到800mL三蒸水中，边加边搅拌，操作要小心。

(5)显色液：TMB显色液，使用时A液B液以1:1比例混合，现用现配。

1.4.2胶体金常用试剂及其配制方法

(1)氯金酸溶液：1g氯金酸溶于100mL超纯水中，0.22μm滤器过滤，锡纸包裹，4℃避光保存。

(2)柠檬酸三钠溶液：柠檬酸三钠粉末1g，加入超纯水至100mL，溶解后用0.22μm滤器过滤，分装4℃保存备用。

(3)0.01mol/L PB溶液(pH 7.2)：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g加超纯水100mL，Na₂HPO₄·12H₂O 7.16g加超纯水100mL。分别取1.9mL NaH₂PO₄·2H₂O和8.1mL Na₂HPO₄·12H₂O，定容到100mL，4℃保存使用。

(4)10w/v％BSA：10g BSA粉末，100mL去离子水。4℃保存备用，但只适合短时间保存。最好适量配置，现用现配。

(5)金标抗体复溶液：1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/LpH为7.2的PB溶液，4℃保存备用。

(6)样品处理液：2.0w/w％NaCl、1.0v/v％TritonX-100、0.3w/v％EDTA的PBS溶液，现用现配。

2实验方法

2.1兔抗牛轮状病毒多克隆抗体的制备及纯化

2.1.1兔抗牛轮状病毒多克隆抗体的制备

实验动物为成年雌性大白兔，抗原为纯化的BRV NCDV株，注射剂量为1mg/只/次。取1mg/mL纯化的BRV抗原1mL，加入等体积弗氏完全佐剂(FCA)1mL，用注射器进行乳化，直到乳化液体在水中不扩散才可注射。采用皮下多点注射病毒，间隔14天，同剂量病毒液，加入等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，皮下多点注射，每点注射0.1mL；间隔14天，注射部位与剂量均同第二次；第三次免疫后5-7天，耳缘静脉采血，采用间接ELISA方法测血清抗体效价，效价达到1:10000以上后，心脏采血，收集血清。

2.1.2兔抗牛轮状病毒多克隆抗体的纯化及鉴定

采集家兔心脏血，放入37℃温箱中1h，再放入4℃冰箱过夜，待血块收缩后分离血清。将血清4℃5000r/min离心30min，取上清，上清采用GE公司的proteinG纯化柱纯化，纯化后测多抗蛋白浓度，并经SDS-PAGE鉴定。

2.2单克隆抗体腹水的制备及纯化

2.2.1单克隆抗体腹水的制备

取SPF级10-12周龄BALB/c雌鼠，腹腔注射500μL灭菌液体石蜡，7天后腹腔注射杂交瘤细胞4D10 1×10⁶-1×10⁷个。每天观察小鼠腹围，约7-14天小鼠腹围明显增大，根据小鼠状态每隔一天或两天抽取腹水一次。收集的腹水4℃3000r/min离心10min，吸取中间层的腹水。将获得的单抗腹水分装，-80℃保存备用。

2.2.2单克隆抗体腹水的纯化

单克隆抗体腹水的纯化采用GE公司的proteinG纯化柱，方法同多克隆抗体的纯化步骤。

2.2.3纯化后腹水的鉴定

纯化后单克隆抗体腹水的鉴定方法同多克隆抗体的鉴定方法。

2.3间接ELISA法测定多抗和单抗腹水效价

抗原包被：每孔200μL BRV细胞毒，4℃过夜或37℃2h；洗涤：1×PBST每孔100μL震荡洗涤5min；反复洗涤3次，倾倒洗液时要迅速，倾倒后于干净的滤纸拍板；封闭：含有5w/v％脱脂乳的PBS(现用现配)，每孔200μL，4℃过夜或37℃2h；洗涤：1×PBST每孔100μL震荡洗涤5min；反复洗涤3次；加一抗：含有5w/v％脱脂乳的PBS稀释一抗(单克隆抗体腹水、BRV多克隆抗体倍比稀释)，每孔100μL，4℃过夜或37℃2h；洗涤：1×PBST每孔100μL震荡洗涤5min；反复洗涤3次；二抗：用含有5w/v％脱脂乳的PBS以1：5000稀释HRP标记山羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤：1×PBST每孔100μL震荡洗涤5min；反复洗涤3次；TMB显色：显色A液与显色B液1:1混合现用现配，每孔100μL，装入避光袋37℃避光显色10-20min；终止显色：终止显色液2mol/L H₂SO₄，每孔50μL；读值：检测OD450值。结果判定依据：P/N＝(待测样品孔OD)÷(阴性对照孔OD)，当P/N值≧2时，判定该孔为阳性；当P/N值≦2时，判定该孔为阴性；以此算出抗体的效价。

2.4胶体金颗粒的制备

2.4.1玻璃器皿的清洁及硅化

首先将玻璃器皿于浓H₂SO₄中浸泡24h，冲洗10次洗净残留的浓H₂SO₄，再用洗涤剂刷洗玻璃器皿，自来水冲洗10次，去离子水反复清洗5次，超纯水冲洗3-4次，烘箱干燥后硅化。硅化液为含有5w/v％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液。取适量的硅化液于玻璃器皿中，然后缓慢转动玻璃器皿，使玻璃器皿内壁都能被硅化液浸润过。

2.4.2胶体金颗粒大小的选择

1g氯金酸加入硅化后的玻璃瓶中，再加入超纯水定容至100mL，用0.45μm滤器过滤除菌。取1mL的1％氯金酸溶液于硅化处理过的锥形瓶中，加超纯水至100mL。稀释后的氯金酸溶液置于水浴锅中加热煮沸2-3min，用玻璃棒剧烈搅拌溶液的同时，加入一定量的柠檬酸三钠溶液(37℃提前预热)分别为1mL、1.5mL、2mL。制备直径为40nm、30nm、20nm的胶体金颗粒，继续煮沸5-8min后室温冷却，冷却后加入超纯水定容至100mL。用0.2mol/LK₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH至7.2-7.5。用0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存。

2.4.3胶体金质量鉴定

电镜观察直径不同的三种胶体金颗粒，对其进行质量鉴定，符合使用要求后才能用于后期试验。先将胶体金溶液做适当倍数稀释，将铜网在稀释后的胶体金溶液轻轻沾取，置于滤纸上自然干燥，用透射电镜检测胶体金颗粒质量。在透射电镜下观察胶体金颗粒的大小、形态是否均一，颗粒形状是否为圆形，是否有杂质或金颗粒聚集现象等。若无上述现象出现，说明胶体金溶液达到标准，可以用于标记抗体。

2.5金标抗体的制备及鉴定

2.5.1待标记抗体的准备

取出纯化的单克隆抗体腹水，调整抗体浓度至1mg/mL左右。由于高浓度的蛋白在冻存过程中容易形成聚合物，为了不影响胶体金标记抗体，稀释前抗体溶液3000r/min 4℃离心10min除去蛋白聚合物。

2.5.2最适标记量测定

用0.2mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8.5-9.0之间。将1030.0μg/mL的单克隆抗体做2倍比稀释。分别取100μL不同浓度蛋白加入EP管中，再加入1000μL胶体金溶液，混匀静置5min。再分别加入100μL 10％NaCl溶液，混匀后静置2h。同时设立两组对照，100μL抗体稀释液+1000μL胶体金溶液+100μL 10％NaCl和100μL抗体稀释液+1000μL的胶体金溶液(如表3)，观察结果。结果判定标准为：加入蛋白量达到或超过胶体金最低稳定量时，EP管颜色保持红色不变；否则EP管颜色变为紫色或蓝色。

表3抗体最适标记量的测定

2.5.3制备金标抗体最适pH值的测定

取1000μL胶体金溶液分装到EP管中，用0.2mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，使用精密pH试纸测试。同时设立对照组。每管中加入100μL最适浓度抗体与胶体金溶液混匀。静置5min后，再加入100μL 10％NaCl溶液，上下颠倒混匀静置2h后观察结果(表4)。EP管颜色仍然保持红色且pH值最低的为胶体金标记抗体最适pH值。

表4最适pH值的测定

2.5.4胶体金标记抗体

(1)将待标记单抗逐滴加入胶体金溶液中，加入时要边搅拌边加，且加入抗体速度不能过快，否则不利于蛋白的标记，1mg抗体大约5min加完即可，加完后室温静置20min；

(2)加入Tris-HC1缓冲液配制的10w/v％BSA溶液至终浓度为1w/v％作为稳定剂，以防止发生非特异性凝聚，室温下继续搅拌5min，室温静置15min；

(3)将金标抗体复合物低速1500r/min低温4℃离心20min，弃掉底部聚合物杂质，用移液器轻轻吸取上清转移到另一离心管中，再以4℃10000r/min离心20-30min；

(4)将得到的金标抗体产物用金标抗体复溶液稀释5-10倍，恢复至原体积的1/10。4℃避光保存备用。

2.5.5金标抗体质量鉴定

金标抗体的鉴定：采用斑点免疫金染色法(dot-IGS)，用微量加样器在NC膜(硝酸纤维素膜)上直接点2-3μL抗体，分别为山羊抗鼠IgG和兔抗BRV多抗，直接包被于NC膜上。37℃干燥10min；干燥后将NC膜浸在37℃封闭30min。PBST洗三次，每次5min；将包被山羊抗鼠IgG的NC膜浸于1:10稀释的金标抗体稀释液中。包被兔抗BRV多抗的NC膜浸于金标抗体稀释液和BRV细胞培养物1:1混合溶液中，室温反应10min。NC膜取出后，PBST洗三次，每次5min，取出可直接观察结果。

2.6试纸条反应条件的优化

2.6.1金标垫处理液的选择

分别选用含有以下四种溶液成分的0.01mol/L PB溶液作为金标垫处理液(见表5)。将金标垫分别作用于四种金标垫处理液中，室温作用10-20min后，置于37℃烘箱中干燥12h，观察金标抗体的释放效果。

表5金标垫处理液配方

2.6.2包被液的选择

选择以下三种溶液：0.01mol/L PB溶液、PBS溶液、20mmol/L Tris-Cl溶液，来稀释纯化的兔抗牛轮状病毒多抗和山羊抗鼠IgG。划线后在37℃烘干箱中，烘干1-2h。在保证其它条件都一致的情况下，观察检测线和质控线的反应效果，并对反应效果进行对比，选出最适合的包被液。

2.6.3封闭液的选择

将划好线的NC膜，分别浸于0.01mol/LPB溶液配制的3w/v％BSA、5w/v％BSA、3w/v％脱脂乳、5w/v％脱脂乳四种封闭液中，37℃封闭1h后，用PBS缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min，洗完膜后烘干。将烘干的NC贴于底板上，组合成试纸条，滴加阳性样品。观察反应在液体的流速、反应后NC膜的颜色、显色条带清晰度等指标选择最佳封闭液。

2.6.4样品垫处理液的选择

分别选用含有以下四种溶液成分的0.01mol/L PB溶液作为样品垫处理液(见表6)，将剪裁好的样品垫浸泡在样品垫处理液中室温作用30min，放入37℃烘箱中烘干2-3h，组装试纸条，滴加样品后观察结果。

表6样品垫处理液配方

2.6.5质控线与检测线抗体浓度的选择

胶体金试纸条质控线上包被的是山羊抗鼠IgG二抗，为了确定包被山羊抗鼠IgG的最适浓度，将山羊抗鼠IgG稀释为2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL分别包被到质控线上。检测线上抗BRV兔多抗，将其稀释为11.08mg/mL、5.54mg/mL、2.77mg/mL、1.38mg/mL、0.69mg/mL五个稀释度分别包被到检测线上。根据试纸条的显色情况，确定质控线兔多抗与检测线上山羊抗鼠IgG的最适划膜浓度。

2.7胶体金试纸条的组装及判定标准

2.7.1胶体金试纸条的组装

胶体金试纸条组成材料有五部分：样品垫、金标垫(玻璃纤维膜)、NC膜、吸水垫及PVC板。将各部分按照如下规格进行裁剪：NC膜，长30cm，宽2.5cm；金标垫：长30cm，宽1.2cm；样品垫；长30cm，宽1.4cm；吸水纸：长30cm，宽1.6cm。首先在PVC板的中间区域贴上划好线，处理好的硝酸纤维素膜。将吸水纸贴在硝酸纤维素膜质控线上方，压硝酸纤维素膜约2mm左右。金标垫贴在硝酸纤维素膜检测线的下方，金标垫压NC膜2mm，用衔接胶带将压膜处贴好。最后将样品垫压金标垫2mm贴好，同样用衔接胶带封好。组装完成后将30cm长的试纸条切割成3.5mm或4mm的单个试纸条。收集切割好的试纸条密封保存使用。胶体金免疫层析试纸条组装效果如图7所示。

2.7.2试纸条测试方法及结果判定标准

在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果。试纸条上方为质控线(C线)，下方为检测线(T线)。测试结果判定标准如图8所示。

(1)阳性结果：C线和T线都出现红色条带；

(2)阴性结果：仅在C线出现现一条红色条带；

(3)无效结果；若C线无条带出现，不论T线是否出现红色条带结果均判定为无效。

2.8试纸条性能测试

2.8.1试纸条特异性试验

用组合好的试纸条对牛轮状病毒(BRV)NCDV毒株、猪轮状病毒(PoRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)以及牛细小病毒(BPV)的细胞毒进行检测，阴性对照样品为：MA-104细胞上清、PB溶液，观察检测结果。

2.8.2试纸条灵敏性试验

将BRV NCDV毒株的细胞毒做5、10、15、20、25、30倍稀释后进行检测，测出细胞毒的最低检出量。

2.8.3试纸条重复性试验

用不同批次试纸条对各种细胞毒和MA-104细胞上清、PB溶液样品进行检测。将同一批次试纸条在不同时间对各种细胞毒和MA-104细胞上清、PB溶液样品进行检测。

2.8.4临床样品检测

收集来自吉林、辽宁、黑龙江牛场的粪便病料共95份，用样品处理液进行处理，处理后的样品用RT-PCR方法检测，根据GenBank上BRV NCDV株VP6基因的保守区，设计特异性引物。上游引物序列为：5'-CGATAATGTATGTATGGACG-3'，下游引物序列为5'-TGCTGAATAAGGGAAAATG-3'目的片段长度为211bp。检测结果同胶体金试纸条结果进行比较。

3结果

3.1多克隆抗体纯化结果鉴定

抗BRV兔多抗经proteinG纯化柱纯化，纯化后的蛋白经微量紫外分光光度计检测含量为22.16mg/mL，纯化的蛋白IgG稀释后经SDS-PAGE鉴定，多抗纯化后显示明显的轻链和重链，且无其它杂蛋白条带，鉴定结果如图9。

3.2单抗腹水纯化结果鉴定

单克隆抗体腹水经proteinG纯化柱纯化，经微量紫外分光光度计检测蛋白浓度为3.325mg/mL，纯化的蛋白IgG经SDS-PAGE鉴定，可以看到IgG明显的重链和轻链，无杂蛋白，表明纯化效果很好(图10)。

3.3多抗和单抗腹水效价检测结果

杂交瘤细胞纯化后腹水和纯化后的兔抗BRV多抗分别进行倍比稀释，然后用间接ELISA测定OD450值。判定依据：P/N＝(待测样品孔OD)÷(阴性对照孔OD)，当P/N值≧2时，判定该孔为阳性；当P/N值＜2时，判定该孔为阴性；最后确定纯化后4D-10腹水效价为1:11000，多抗效价为：1:12800。

3.4胶体金质量鉴定及颗粒直径的检测结果

根据所需胶体金颗粒大小，对照函数关系图，向100mL 0.01w/v％氯金酸溶液中分别加入2mL、1.5mL、1mL 1w/v％柠檬酸三钠溶液，制备直径约为20nm、30nm、40nm的胶体金，3-4min后混合液的颜色开始出现变化，无色一蓝色一浅蓝色一紫色，最后溶液变为酒红色。

观察显示，40nm的胶体金很不稳定，1个月后就变浑浊(图11)，且制备起来很困难。20nm的胶体金稳定性好，2个月未出现沉淀，且制备简单。电镜观察发现，本实验制备的20nm胶体金颗粒大小均一、圆形、无杂质碎片、无凝集现象(图12)。

3.5金标抗体的制备

3.5.1最适标记量测定结果

观察结果(图13)从1号管到5号管胶体金的颜色同12号管即对照管的颜色基本一致，这是由于加入抗体蛋白量达到或超过稳定胶体金的最低量，但从6号开始到11号管由于抗体加入量不足以稳定胶体金，胶体金溶液的颜色由粉色逐渐变蓝紫色。根据结果确定本试验单克隆抗体加入量，向1mL胶体金中加入100μL最低稳定量(64.38μg/mL)的蛋白溶液，在此基础上再增加30％作为最适稳定量，即稳定1mL胶体金所需单抗的蛋白浓度为83.69μg/mL。

3.52最适pH值的测定结果

胶体金标记抗体最适pH的测定结果如图14所示，4号管的颜色与8号对照管溶液颜色基本一致，其它管的颜色逐渐由粉红色变成蓝紫色。因此本试验胶体金标记抗体最适pH确定为8.5。

3.5.3金标记抗体的鉴定

3.5.3.1金标抗体质量鉴定结果

山羊抗鼠二抗包被在硝酸纤维素膜上，与金标抗体反应10min后结果如图15所示，出现明显的红色斑点，说明金标抗体可用。

3.5.3.2多抗血清质量鉴定结果

纯化的兔抗BRV多抗包被在硝酸纤维素膜上，与金标抗体反应10min后结果如图15所示，出现明显的红色斑点，说明多抗血清可用。

3.6试纸条反应条件优化结果

3.6.1金标垫处理液的确定

金标垫经四种金标垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干后观察，加入100μL0.01mol/L的PB溶液，观察不同金标垫处理液处理的玻璃纤维膜结合金标单抗的效果及释放金标单抗的效果。结果如图16所示。含有0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1w/v％BSA的金标抗体处理液效果最好，吸收金标抗体最均匀，其它三种处理液处理过的玻璃纤维膜结合金标单抗不均匀。

3.6.2包被液的确定

图17结果表明，0.01PB mol/L包被稀释液处理包被抗体的效果最好，质控线和检测线的中空现象弱，检测效果最佳。

3.6.3封闭液的确定

含有3w/v％BSA、5w/v％BSA、3w/v％脱脂乳、5w/v％脱脂乳的PB溶液作为封闭液，结果如图18所示，含有3w/v％BSA、5w/v％BSA的PB溶液作为封闭液反应背景颜色较浅，且含有3w/v％BSA的PB溶液作为封闭液时样品层析时间为8min左右，相比于含有5w/v％BSA的PB溶液作为封闭液时的层析时间(10min以上)更短，更适合用于快速检测。

3.6.4样品垫处理液的确定

对四种配方的样品垫处理液进行比较，滴加阳性样品，在其它条件保持不变的情况下，对结果进行分析。如图19，可以观察到B样品垫处理液(0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA)的效果最好，检测线的显色条带最亮。

3.6.5质控线与检测线抗体浓度的确定

3.6.5.1质控线抗体浓度的确定

质控线上山羊抗鼠IgG的浓度分别为2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，对比图20结果可知，随着山羊抗鼠IgG浓度的增加，显色条带越清晰，从能满足试纸条观察的要求出发，虽然0.5mg/mL也显色，但条带较弱，考虑试纸条需要长时间保存，受温度等干扰因素的影响，选择1.0mg/mL作为质控线上山羊抗鼠IgG的浓度。

3.6.2检测线抗体浓度的确定

检测线上包被纯化的兔抗BRV多抗，稀释度分别为11.08mg/mL、5.54mg/mL、2.77mg/mL、1.38mg/mL，0.69mg/mL。加入阳性样品，观察显色结果。如图21所示，可观察到随着多克隆抗体浓度的增加，检测线的条带越清晰，包被0.69mg/mL多抗的检测线几乎无颜色，1.38mg/mL的质控线虽有条带，但考虑到环境、样品、存放时间等因素，选择2.77mg/mL作为检测线上包被多克隆抗体的浓度。

3.7试纸条性能检测结果

3.7.1试纸条特异性试验结果

用牛轮状病毒NCDV毒株、PoRV、TGEV、PEDV、BPV细胞毒和MA-104细胞上清、PB溶液进行检测，观察检测结果，结果如图22所示。除BRV细胞毒为阳性外，其余样品均为阴性，表明试纸条特异性良好。

3.7.2试纸条灵敏性试验结果

将BRV NCDV毒株细胞培养物5、10、15、20、25、30倍稀释后用该试纸条进行检测。结果显示该试纸条能够检测出稀释度为15倍的细胞毒，即细胞毒最低检出量约为10⁵个TCID₅₀。

3.7.3试纸条重复性试验结果

用BRV、PoRV、TGEV、PEDV、BPV细胞毒和MA-104细胞上清、PB缓冲溶液进行检测，用胶体金试纸条进行批内重复性试验和批间重复试验。结果如图23和24，可知该试纸条重复性良好。

3.7.4临床样品的检测结果

用试纸条对来自吉林省、辽宁省、黑龙江省三个牛场的粪便病料共95个进行检测，同时处理粪样提取RNA反转录后，用PCR方法对粪样进行检测，结果见图25。对两种方法的检测结果进行比较，结果见表7。95份样品中共检出4份阳性样品，见图26，与PCR检测结果相符，其中黑龙江某牛场阳性样品数为0个，辽宁某牛场阳性样品数1个，吉林某牛场阳性样品数为3个。说明试纸条检测比较准确。

表7临床样品的检测结果

Claims

1.一种用于检测牛轮状病毒的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于所述的试纸条包括从左到右依次连接的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水滤纸，还包括位于下方的PVC底板，其中PVC底板的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG喷涂的质控线，以及兔抗牛轮状病毒多克隆抗体喷涂的检测线，胶体金垫上涂覆有胶体金颗粒标记的鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置；

2.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，用于牛轮状病毒检测时按照以下步骤进行：

(1)在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果；

(2)结果判定：

阳性结果：质控线和检测线都出现红色条带；

阴性结果：仅在质控线出现现一条红色条带；

3.一种制备权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)胶体金垫的制备

(1)玻璃器皿洗干净，浓H₂SO₄中浸泡24h，冲洗10次洗净残留的浓H₂SO₄，再用洗涤剂刷洗玻璃器皿，自来水冲洗10次，去离子水反复清洗5次，超纯水冲洗3-4次，烘箱干燥后，使用含5w/v％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液硅化，然后用去离子水冲洗，干燥备用。

(3)待标记抗体的准备

所述的金标抗体复溶液为含1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/LpH为7.2的PB溶液，4℃保存备用；

(7)先将玻璃纤维素膜浸泡在含0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1％w/vBSA的0.01mol/L PB溶液中10-20min，置于37℃烘箱中干燥12h，然后将金标抗体溶液均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干，得到胶体金垫；

(二)硝酸纤维素膜的制备

(三)样品垫的制备

(四)试纸条的组装

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，制备得到的裸胶体金溶液中胶体金颗粒的粒径为20nm。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，选择稀释后浓度为1.0mg/mL的山羊抗鼠IgG包被质控线；选择稀释后浓度为2.77mg/mL的兔抗牛轮状病毒多克隆抗体包被检测线。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，鼠抗牛轮状病毒VP6蛋白的单克隆抗体的标记量为83.69μg/mL。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，调节待标记抗体溶液的pH为8.5；调节裸胶体金溶液的pH为8.5。

8.权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条在制备检测牛轮状病毒试剂中的应用。