KR20170022486A - 로타바이러스 vp 6 및 vp 7에 대한 단클론 항체 및 그 응용 - Google Patents
로타바이러스 vp 6 및 vp 7에 대한 단클론 항체 및 그 응용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 로타바이러스 VP6 및 VP 7에 대한 단클론 항체 및 그 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-브이피7과 항-브이피6 저분자 항체로부터 유래한 로타바이러스 검출 방법 및 진단 키트 개발에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 향후에 로타바이러스를 민감하게 검출할 수 있는 항체로 사용될 수 있으며, 더 나아가서는 로타바이러스의 치료제개발에 사용 가능할 것이다.
Description
본 발명은 로타바이러스 VP6 및 VP 7에 대한 단클론 항체 및 그 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항-브이피7과 항-브이피6 저분자항체로부터 유래한 로타바이러스 검출 방법 및 진단키트 개발에 관한 것이다.
Rotavirus는 Norovirus와 함께 위장염을 일으키는 대표적인 바이러스이다. Double-stranded RNA virus이며 VP6에 의해 구분되는 A, B, C, D, E 5개의 group을 가진다. 5개의 group 중에서 A가 가장 일반적인 감염의 원인이다. rotavirus A는 serotypes에 의해서 다른 strains을 가진다. G serotypes은 VP7에 의해서, P serotypes는 VP4에 의해서 결정된다.
Rotavirus는 여섯 구조단백질들; VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 및 VP7과 rotavirus에 의해 감염된 세포 안에서만 만들어지는 여섯 비구조단백질(NSPs); NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6를 가진다. 이때 구조 단백질들은 세 concentric protein layers로 구성되어있다. 각각 outer: VP4, VP7/ Inner: VP2/ Intermediate: VP6로 구성되어있다. 이때 VP4는 감염 후 VP8과 VP5로 절단되고 VP6가 노출된다.
fecal-oral route로 전염되며 일단 감염이 되면 탈수, 설사가 발생한다. 겨울철에 흔하고 보통 바이러스에 노출 후 2일째에 증상이 나타나며 거의 5살 이전에 감염을 경험한다. Rotavirus 감염에 대한 면역성은 불완전 면역으로 한번 감염되더라도 다음에 또다시 감염될 수 있다. 소장을 감염시키며 세포 벽에 enterotoxin을 분비한다. 신생아나 어린 아이가 rotavirus에 감염되었을 경우, 심하면 죽음에까지 이를 수 있다. 따라서 시기 적절한 진단과 치료가 중요한 문제이다.
바이러스는 각각 다른 구조적 특징과 기능적 특징을 가지고 있다. 따라서 각각에 맞는 항체를 만들기 위해서는 그들의 특징을 정확하게 파악하는 것이 중요하다. Bio-panning을 진행하기에 앞서, Norovirus와 Rotavirus에 대한 정보를 수집하고, 수집한 정보를 바탕으로 적절한 타겟 부위를 파악하였다. Rotavirus의 capsid 부분은 VP4, VP6, VP7이다. 이 부분을 타겟 항원으로서 적합하다고 판단하여 여러 가지 정보를 수집하였다. 특정 부분을 타겟팅하여 독특한 클론(clones)을 얻고, 얻어진 독특한 항체는 characterization을 진행한 뒤 진단 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허 공개번호 제2003-0015017호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 로타바이러스 VP 6 또는 VP 7에 대한 항체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-로타바이러스 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편을 제공한다:
서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체;
서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및
서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 19로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄;
서열번호 21로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 22로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄; 및
서열번호 23으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 항체 또는 그 기능적인 단편은 상기 서열로 한정된 항체에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 로타바이러스 VP6 또는 VP7에 대하여 결합하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명의 상기 본 발명의 단일클론 항체 생산 세포주를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포주는 KCCM11744P, KCCM11745P 및 KCCM11746P로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 세포주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 기탁된 세포주는 2015년 7월28일 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩 소재 한국미생물보존센터에 각각 KCCM11744P, KCCM11745P 및 KCCM11746P로 기탁하였다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 항-로타바이러스 단일클론 항체 또는 그 기능적인 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 항-로타바이러스 단일클론 항체 또는 그 기능적인 단편을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 유래한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 항-로타바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 로타바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 1) 샘플과 상기 본 발명의 또는 그 기능적인 단편을 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 또는 그 기능적인 단편과 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
대상체의 로타바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법을 제공한다.
또 본 발명은 1) 샘플과 상기 본 발명의 조성물을 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 조성물 내 항-로타바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
대상체의 로타바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법을 제공한다.
또 본 발명은 1)상기 본 발명의 또는 그 기능적인 단편; 및 2) 용기를 포함하는 로타바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또 본 발명은 1) 상기 본 발명의 로타바이러스 진단용 조성물; 및 2) 용기를 포함하는 로타바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 단클론 항체 또는 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 포함하는 인간로타바이러스에 의한 질병의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 진단용 조성물은 본 발명의 단클론 항체 및 면역학적 분석에 사용되는 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 공지의 모든 정량분석방법에 사용되는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 상기 정량분석방법의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 면역블롯팅, 면역침전법, 효소면역분석법, 단백질 칩, 래피트 어세이 및 마이크로 어레이 방법 등이 있다.
상기에서 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 과산화효소(peroxidase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신 이소티옥시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin) 및 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde)등을 사용할 수 있다. 발광물질로는 이소루미놀(isolumino), 루시게닌(lucigenin) 등을 사용할 수 있으며, 방사성 물질로는 131I, 14C, 3H 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따라, 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 시료내 로타바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 인간 로타바이러스 VP6 및/또는 VP 7단백질에 특이적인 제 1 항체를 고상체에 고정시키는 단계,
(2) 상기 고상체에 검사하고자 하는 시료 용액을 가하여 시료내 로타바이러스가 상기 항체에 결합하도록 반응시키는 단계,
(3) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
(4) 발색 효소에 결합된, 로타바이러스 VP6 또는 VP 7단백질에 특이적인 제 2 항체를 상기 고상체에 가하여 단계 (2)에서 결합된 제 1 항체와 로타바이러스의 복합체에 결합하도록 반응시키는 단계,
(5) 세척액을 사용하여 미반응 물질을 세척, 제거하는 단계,
(6) 세척한 고상체에 효소 기질 용액을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하는 단계, 및
(7) 반응 결과 나타나는 발색 정도를 측정하여 시료내 로타바이러스의 농도를 측정하는 단계.
또한, 상기한 샌드위치형 효소 면역 측정법에 의해 로타바이러스를 측정하기 위한 본 발명의 키트는 고상체에 고정된 항-로타바이러스 제 1 항체, 효소에 결합된 항-로타바이러스 제 2 항체, 시료 희석 용액, 효소 기질 용액, 세척액 및 로타바이러스 표준 용액을 포함한다.
상기 효소 면역 측정법 및 이를 위한 측정용 키트에 있어서, 사용된 항-로타바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 기탁된 세포주 클론으로부터 생산된, 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
발색 반응에 의해 로타바이러스의 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 사용하는 것이 바람직하고, 이 경우에 있어 효소의 기질 용액으로는 오르소-페닐렌다이아민(OPD) 용액을 사용한다.
또는 정량적 분석을 위하여 본 발명의 항체에 형광물질 (예, Alexa488)을 접하여 직접적으로 측정하는 방법도 있다.
또한 검사하고자 하는 시료는 분비물, 예를 들면 분변을 1:20 정도의 비율로 희석한 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 고상체로는 일반적으로 마이크로플레이트의 웰을 사용한다.
전술한 효소 면역 측정법외에, 본 발명에 따른 항-로타바이러스 단일클론 항체를 이용한 면역 측정법으로서, 면역 크로마토그래피법을 이용하여 시료내 로타바이러스의 감염 여부를 측정할 수도 있다.
상기 면역 크로마토그래피에 의한 측정 방법은 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 항체와 시료를 면역 반응시키고,모세관 현상에 의해 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 연속 이동하는 과정을 통해 멤브레인상에 미리 고정시킨 별도의 항-로타바이러스 항체 밴드와 상기 복합체가 결합하도록 함으로써, 밴드 위치의 착색 여부에 의해 시료내 로타바이러스의 존재 여부를 검출하는 방법이다.
상기한 방법은 샘플 부재, 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 제 1 항체가 일시적으로 고정되어 있는 면역 반응 부재, 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드(판정 라인)와 대조용 항체 밴드(대조 라인)를 함유하는 결과 표시 부재 및 흡수부재를 포함하는 면역 크로마토그래피 킷트를 사용하여 실시할 수 있다.
상기 각 부재들은 모세관 현상에 의해 시료 용액이 연속적으로 이동하도록 부분적으로 겹쳐지게 순서대로 일렬 배치되며, 상기 대조 라인은 판정 라인과 일정 간격을 두고 떨어져 위치하도록 한다.
면역 반응 부재에는 착색 미립자에 결합된 항-로타바이러스 제 1 항체가 멤브레인상에 일시적으로 고정되어 있어, 샘플 부재에 의해 흡수된 시료 용액내 로타바이러스와 면역 반응에 의해 복합체를 형성한 후, 모세관 현상에 의해 결과 표시 부재상으로 연속 이동하게 된다.
또한, 결과 표시 부재에는 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드와 대조용 항체 밴드로 이루어지는, 총 2개의 항체 밴드가 일정 간격을 두고 표면상에 고착되어 있다.
상기 항-로타바이러스 제 2 항체 밴드는 시료내 로타바이러스의 존재를 나타내는 결과 판정 라인으로, 상기 면역 반응부재에서 형성된 착색 미립자-항체-바이러스 복합체가 이동중에 이 밴드 지점을 통과하면서 항-로타바이러스 제 2항체와 특이적으로 반응하여 결합체를 형성하게 되고, 이에 따라 밴드 위치에 착색이 일어나게 된다.
반면, 통상 제 2 항체 밴드로부터 시료 이동 방향으로 하단 0.5 내지 2㎝ 정도의 지점에 위치하는 대조용 항체 밴드는 염소 항-마우스 IgG와 같은 일반적인 항체를 포함하고 있어, 상기 판정 라인을 통과한 미결합 시료 성분들과 면역 반응함으로써, 본 검사가 정상적으로 시행되었는지를 확인해 주는 역할을 한다.
이후, 나머지 시료 성분들은 모세관 현상에 의해 계속 이동되어 흡수 부재에 의해 흡수된다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 사용된 항-로타바이러스 제 1 항체 및 제 2 항체는 본 발명에 따른 클론으로부터 생산된, 로타바이러스에 특이적으로 결합하는 동일 또는 상이한 단일클론 항체로서, 상이한 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 로타바이러스 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 본 발명의 항체 또는 그 단일 측쇄 항체(scFv) 절편을 유효성분으로서 함유하는 항 바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면,하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제,바람직하게는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이러한 목적에 적합한 제형으로는 정제, 환제, 당제 (dragee), 산제, 캡슐제, 시럽제, 용액제, 겔제, 현탁제,에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구투여용 제제; 및 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입제 및 하이포스프레이 (hypospray)와 같은 분무제 등과 같은 비경구투여용 제제가 바람직하다. 주사 또는 주입용 제제의 경우에는 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체 분자는 사용 전에 적절한 무균 액체롤 재조정하여 사용할 수 있는 건조된 형태로 제제화될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 위장관 내에서 분해되기 쉬운 항체 분자를 포함하므로, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의하여 투여되어야 하는 경우에는 분해로부터 항체를 보호하고, 항체를 방출한 후에는 위장관으로 흡수되는 약제를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 또한 본 발명의 항체를 상기에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 동물, 바람직하게는 포유동물,더욱 바람직하게는 사람에게 투여되는 단계를 포함하는 로타바이러스암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 제제의 유효성분으로서 상기 항체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별, 약제조합, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 기능적 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab') 2 , scFv, Diabody, Tribody, dsFv, CDR을 함유하는 펩타이드 등을 들 수 있다.
Fab는 IgG를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다),H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합된 분자량 약 5만의 항원결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 당해 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.
F(ab')2 는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득되는 단편중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지영역의 S-S 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 F(ab') 2 는 본 발명의 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 S-S 결합시켜 작제할 수 있다.Fab'는 상기 F(ab') 2 의 힌지영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩타이드 링커(P)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩타이드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 scFv는 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Diabody는 예를 들면, 본 발명의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하고, 3 내지 15 잔기의 폴리펩타이드 링커를 갖는 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하며 당해 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여 당해 발현벡터를 원핵생물 또는 진핵생물로 도입함으로써 Diabody를 발현시켜 제조할 수 있다.
또한, linker P 길이가 3-10 일 때는 tribody가 형성되어, tribody로 포함할 수 있다.
dsFv는 VH 및 VL 중 각각 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를 당해 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 Reiter 등에 의해 기재된 방법[참조: Protein Engineering, 7, 697(1994)]에 따라서 항체의 입체구조 예측에 근거하여 선택할 수 있다.
인간 항체 gene을 phage 표면 단백질에 융합시킨 형태로 E.coli에서 발현시켜 phage의 표면에 다양한 항체를 display 할 수 있다. 이 기술을 phage display라고 하며, 인체 내에 존재하는 다양한 조합의 항체 library를 제작할 수 있다. 이 library로부터 패닝 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론 항체를 선별할 수 있다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, Selected Abs와 stool sample의 실험 결과로서, stool에 결합하는 signal값이 control값보다 더 높은 Abs는 10개 이며, 1.5 ~ 0.5 정도의 absorbance 값을 가지므로, 이들은 향후에 rotavirus를 sensitive하게 detection 할 수 있는 항체로 사용될 수 있으며, 더 나아가서는 rotavirus의 진단 및 치료제 개발에 사용 가능할 것이다.
도 1 내지 3은 항원 서열 VP4(도 1), 6(도 2) 및 7(도 3)과 각각의 common strain과의 alignment 결과,
도 4 및 5는 본 발명의 항체 스크리닝을 위한 실험 과정을 보여주는 그림,
도 6은 ELISA를 통해 최종 선택된 82 clones을 나타낸 그림,
도 7 및 8은 50 unique 클론의 anti-Rotavirus scFv phage Ab를 나타낸 그림,
도 9는 stool 샘플과 rotavirus 입자에 대한 상용 항체 (F사, B사, H사) 결합을 나타낸 그림이다.
도 10은 stool 샘플에 대한 본 발명의 파이지-항체의 실험 결과를 나타낸 그림으로, Rotavirus에 결합하는 것으로 확인된 B사의 상용항체 B1을 0.5와 2ug/mL 의 농도로 코팅하고, rotavirus positive stool (10% stool, 90% PBS)을 넣고 한 시간, anti rotavirus 파이지-항체를 넣고 상온에서 한 시간, HRP 컨쥬게이트 된 anti 파이지-항체를 넣고 한 시간, 각각 반응시킨 후 TMB 기질을 이용하여 디벨로프하였음. 도에서 별표는 왼쪽부터 차례대로 7-2G8, 6-2A6, 6-1B3 clone이며, 이외에 stool에 높게 결합하는 clones은 음성 stool에도 binding을 보여서 제외하였음.
도 11은 본 발명의 단클론 항체의 VH 및 VL 서열을 나타낸 그림.
도 12는 기탁한 세 개의 clones 중에서 정제된 7-2G8 clone의 data이며, rotavirus 및 norovirus stool에서의 결합을 확인한 그림으로, 1% Stool direct coating하여 실험을 진행하였으며, Rota positive 1: 180여명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota positive 2: 11명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, 음성 대조군 Norovirus stool (GI, GII)은 각각 단일 검체에서 나온 stool을 사용하였으며, 정제된 7-2G8: 1ug/mL로 100uL 사용하였으며, X축: coating한 샘플을 의미,
도 13는 rotavirus 및 음성 stool에서의 결합을 확인한 그림으로, 1% Stool direct coating하여 실험 진행하였으며, X축: 코팅한 stool 샘플을, Rota positive 1: 180여명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota positive 2: 11명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota음성 stool의 숫자는 각각 단일 검체를 의미함. 정제된 7-2G8: 1ug/mL로 100uL사용하였고,음성 대조군 phage noro Ab: 강원대에서 보유하고 있는, rotavirus에 결합하지 않는 anti noro 파이지-항체이며 80% phage sup.사용하였고,Phage 7-2G8: 80% phage sup.사용하였음.
도 4 및 5는 본 발명의 항체 스크리닝을 위한 실험 과정을 보여주는 그림,
도 6은 ELISA를 통해 최종 선택된 82 clones을 나타낸 그림,
도 7 및 8은 50 unique 클론의 anti-Rotavirus scFv phage Ab를 나타낸 그림,
도 9는 stool 샘플과 rotavirus 입자에 대한 상용 항체 (F사, B사, H사) 결합을 나타낸 그림이다.
도 10은 stool 샘플에 대한 본 발명의 파이지-항체의 실험 결과를 나타낸 그림으로, Rotavirus에 결합하는 것으로 확인된 B사의 상용항체 B1을 0.5와 2ug/mL 의 농도로 코팅하고, rotavirus positive stool (10% stool, 90% PBS)을 넣고 한 시간, anti rotavirus 파이지-항체를 넣고 상온에서 한 시간, HRP 컨쥬게이트 된 anti 파이지-항체를 넣고 한 시간, 각각 반응시킨 후 TMB 기질을 이용하여 디벨로프하였음. 도에서 별표는 왼쪽부터 차례대로 7-2G8, 6-2A6, 6-1B3 clone이며, 이외에 stool에 높게 결합하는 clones은 음성 stool에도 binding을 보여서 제외하였음.
도 11은 본 발명의 단클론 항체의 VH 및 VL 서열을 나타낸 그림.
도 12는 기탁한 세 개의 clones 중에서 정제된 7-2G8 clone의 data이며, rotavirus 및 norovirus stool에서의 결합을 확인한 그림으로, 1% Stool direct coating하여 실험을 진행하였으며, Rota positive 1: 180여명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota positive 2: 11명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, 음성 대조군 Norovirus stool (GI, GII)은 각각 단일 검체에서 나온 stool을 사용하였으며, 정제된 7-2G8: 1ug/mL로 100uL 사용하였으며, X축: coating한 샘플을 의미,
도 13는 rotavirus 및 음성 stool에서의 결합을 확인한 그림으로, 1% Stool direct coating하여 실험 진행하였으며, X축: 코팅한 stool 샘플을, Rota positive 1: 180여명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota positive 2: 11명 rotavirus 감염 환자 stool 혼합물을, Rota음성 stool의 숫자는 각각 단일 검체를 의미함. 정제된 7-2G8: 1ug/mL로 100uL사용하였고,음성 대조군 phage noro Ab: 강원대에서 보유하고 있는, rotavirus에 결합하지 않는 anti noro 파이지-항체이며 80% phage sup.사용하였고,Phage 7-2G8: 80% phage sup.사용하였음.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
1.
실시예
: 항원 구입
VP7
칼슘 리간드가 존재하여, calcium이 높은 농도로 존재하고 있을 때 homotrimer를 유지하고, 세포 안으로 들어간 뒤에 원형질에서 calcium 농도가 낮아지는 것이 outer layer의 수용화(solubilization)에 원인이 된다. 총 2개의 glycosylation site를 가진다.(참고: http://www.uniprot.org/uniprot/P10501)
VP6
금속 이온 결합 부위를 가진다. 숙주 세포에 감염 후, outer capsid protein이 벗겨지면 VP6가 노출된다. Glycosylation site가 없다.(참고: http://www.uniprot.org/uniprot/P08035)
인간에게 감염을 일으킬 수 있는 rotavirus strain A에 대한 항원 구매를 위해서 여러 가지 제약회사의 정보를 수집하였다. Human strain으로 생산된 재조합 단백질을 원했지만 대부분 simian strain이나 cow strain을 판매하고 있었다. 또한, 판매되고 있는 Rotavirus antigen은 정확한 target을 밝히고 있지 않거나, 대부분 VP6를 판매하고 있었다. Fitzgerald(Fitzgerald Industries International 30 Sudbury Road, Suite 1A North Acton, MA 01720 USA )라는 회사와의 접촉을 통해서 인간 strain으로 생산되는 항원을 구입하였다.
| VP6 | VP7 | |
| Strain | Rotavirus A (strain Human/United Kingdom/ST3/1975 G4-P2A[6]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1) (RV-A) (Rotavirus A (strain St. Thomas 3)) | |
| Amino acid | 397aa(full length) | 51-326aa (full mature protein length) |
| Species | Human | |
| Sequence | MEVLYSLSKTLKDARDKIVEGTLYSNVSDLIQQFNQMIVTMNGNDFQTGGIGNLPIRNWTFDFGLLGTTLLNLDANYVETARTTIEYFIDFIDNVCMDEMARESQRNGVAPQSEALRKLAGIKFKRINFNNSSEYIENWNLQNRRQRTGFVFHKPNIFPYSASFTLNRSQPMHDNLMGTMWLNAGSEIQVAGFDYSCALNAPANIQQFEHIVQLRRALTTATITLLPDAERFSFPRVINSADGATTWFFNPIILRPNNVEVEFLLNGQIINTYQARFGTIIARNFDTIRLSFQLMRPPNMTPAVNALFPQAQPFQHHATVGLTLRIESAVCESVLADANETLLANVTAVRQEYAIPVGPVFPPGMNWTELITNYSPSREDNLQRVFTVASIRSMLIK | QNYGINLPITGSMDTAYANSTQDNNFLFSTLCLYYPSEAPTQISDTEWKDTLSQLFLTKGWPTGSVYFNEYSNVLEFSIDPKLYCDYNVVLIRFVSGEELDISELADLILNEWLCNPMDITLYYYQQTGEANKWISMGSSCTVKVCPLNTQTLGIGCQTTNTATFETVADSEKLAIIDVVDSVNHKLNITSTTCTIRNCNKLGPRENVAIIQVGGSNILDITADPTTSPQTERMMRVNWKKWWQVFYTVVDYINQIVQVMSKRSRSLDSSSFYYRV |
표 1은 항원에 대한 정보이다.
구매한 항원은 재조합 단백질이며, E. coli 에서 발현된다. 따라서 glycosylation site 존재 여부를 확인하였다. Fitzgerald에서 판매하는 VP4는 VP5 domain의 ~44%만을 포함하고 있으며, 2개의 glycosylation site가 확인되었다. 판매되는 VP6는 full length를 가지고 glycosylation site를 가지지 않았다. VP7은 전체길이 중에서 일부분만을 판매하였으며 2개의 glycosylation site를 가지고 있었다.
각각의 alignment를 통해서 common strain과 antigen sequence간의 percent identity를 구하여 서로 높은 유사성을 보이는 것을 확인하였다.
표 1은 항원에 대한 정보이다.
구매한 항원은 재조합 단백질이며, E. coli 에서 발현된다. 따라서 glycosylation site 존재 여부를 확인하였다. Fitzgerald에서 판매하는 VP4는 VP5 domain의 ~44%만을 포함하고 있으며, 2개의 glycosylation site가 확인되었다. 판매되는 VP6는 full length를 가지고 glycosylation site를 가지지 않았다. VP7은 전체길이 중에서 일부분만을 판매하였으며 2개의 glycosylation site를 가지고 있었다.
각각의 alignment를 통해서 common strain과 antigen sequence간의 percent identity를 구하여 서로 높은 유사성을 보이는 것을 확인하였다.
| Percent Identity | |||
| VP4 | VP6 | VP7 | |
| Recombinant Protein | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
| human_ G2P [4] | 86.70 | 92.44 | 75.00 |
| human_ G1P8 ] | 89.27 | 99.75 | 82.97 |
| human_ G3P8 | 90.56 | 99.75 | 77.90 |
| human_ G4P [8] | 89.27 | 100.00 | 98.19 |
| human_ G9P8 | 90.13 | 99.75 | 83.33 |
| rVP4 | rVP6 | rVP7 | |
Alignment를 통해서 공통서열을 확인하였다. 도 1 내지 3에서 Fitzgerald는 구매한 항원이고 아래 있는 samples은 most common strain이다. Alignment 결과를 보면, 구매하고자 하는 protein에서 판매되는 부분인 [VP4: 247aa~479aa; VP6: 397aa (full seq.); VP7: 51aa~326aa]에서 높은 유사성을 보였다.(도 1 내지 3 참조)
실시예 2: rotavirus 항체 발굴 방법
rotavirus 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 발굴을 위하여 Phage-displayed 항체를 이용하여 biopanning을 도 5와 같이 진행하였다.
Biopanning은 항체 스크리닝을 위한 실험기법이다. 간략하게는 구매한 재조합 rotavirus 단백질 항원을 immune tube에 고정화시킨 뒤, 3% milk/PBS로 37℃에서 한 시간 동안 blocking 한 후, scFv(Single chain variable fragment) 항체를 display하고 있는 파이지-항체를 넣고 한 시간 동안 상온에서 반응한 다음 PBS/T로 세척하여 비결합 파이지-항체는 제거한다. 항원에 결합한 파이지-항체는 glycine 용액으로 용출한다. 이러한 방법으로 2번 더 추가 진행한 뒤, 최종적으로 얻은 파이지-항체의 특성을 다양한 방법으로 분석한다. 아래는 rotavirus에 대한 항체 발굴 방법을 상세히 기술하였다.
재조합 단백질 VP6 (11.2)와 VP7 (8)을 0.1M NaHCO3 용액(pH9) 에 용해한 후 각각 immunotube에 오버나잇 코팅한 후 3 회 4.5mL PBS (137mM NaCl/10mM Na2HPO4, 2.7mM KCl, 2mM KH2PO4_ pH 7.4)로 세척하였고,
4.5mL의 블록킹 용액 (PBS, 3% (w/v) 탈지 분유)으로 채워서 1시간 동안 37℃에서 블록킹 한 후 3 회 PBS로 세척하고 블록킹된 파이지 용액 을 첨가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다.
Rotavirus 재조합 단백질이 코팅된 튜브에서 파이지와 재조합 단백질을 반응 시킨 후 , 튜브를 PBS/T (0.1 % (v/v) Tween 20 in PBS)로 10회 세척하고 PBS로 5회 세척하고, rotavirus 재조합 단백질에 결합하는 파이지-항체를 100mM glycine-HCl, pH2.1로 상온에서 20 분간 용출하고 용출된 파이지를 1.5mL micro-centrifuge 튜브에 옮겨서 1M Tris-HCl pH8.0을 1:5 v/v 1M Tris-HCl:100mM glycine-HCl, pH2.1 첨가하여 그 혼합물을 중화하였다.
rotavirus 항체 발굴 효율을 분석하기 위하여 파아지-항체 titer를 다음과 같이 분석하였다. 5mL의 log phase TG1 세포(OD600:0.5-0.8)를 상기 용출된 파이지로 감염시키고 교반 없이 30분 간 배양한 후에 감염된 TG1 세포를 사용하여 2TY 배지로 10-2에서 10- 7으로 10-fold 연속적 희석을 하였다. 2TYAG (2TY media, ampicillin 100 ug/mL, 2% glucsoe) 아가 플레이트에 플레이팅하고 30℃/overnight에서 배양하여, titer 계산하였다.
파아지=항체를 증폭하기 위하여, 나머지 감염된 TG1 세포를 2000rpm/10min에서 스핀 다운하고;3mL 2TY에서 재부유하고; 243x243mm 2TYAG 플레이트에 스프리딩하고 그 플레이트를 30℃에서 오버나잇 배양하였다.
243x243mm 2TYAG 플레이트로부터 콜로니를 2TY 배지에 스크랩하고, 1/2 부피의 50%(v/v) glycerol을 첨가하여 혼합하고 샘플 재조합 rotavirus 단백질에 대한 1:50 희석에서 그 스크랩된 세포의 OD 600 를 체크하였다.
25mL의 2TY + 100/mL ampicillin에 100 uL 감염된 세포(즉 상기 스크랩된 세포)를 접종하고 37℃에서 mid-log (A600= 0.5에서 0.8)로 성장시켰다. 헬퍼 파이지를 최종 농도 5 x 1010pfu/mL ( MOI 10)으로 첨가하고, 상기 super-infected 세포를 오버나잇/25℃에서 배양하여 파이지 입자를 생산하였다. 다음 여기서 얻은 파이지-항체를 다음 biopanning round 에 사용한다. 두 번째, 세 번째 biopanning은 위에 언급한 첫번째 round와 비슷하지만 코팅하는 단백질의 양, 결합된 항체를 용출하기 전 사용하는 용액의 조성, 세척하는 횟수가 다르다. 총3회 biopanning을 진행 한 뒤 round 별로 얻은 input, output titer 값은 다음과 같다.
아래 표는 biopanning의 각각 round에서 진행된 실험결과이다.
| Antigen | Round | Input | Output | Total |
| 1 | 2.74×1011 | 4.2×104 | 768 clones | |
| VP6 | 2 | 3.49×1012 | 2.15×106 | |
| 3 | 4.52×1012 | 5.3×106 | ||
| 1 | 2.74×1011 | 4.3×104 | 474 clones | |
| VP7 | 2 | 6.77×1012 | 3.97×105 | |
| 3 | 8.21×1012 | 3.07×109 |
실시예
3: 파이지-항체 입자 생산
Biopanning을 통해 얻어진 파이지-항체의 특성을 분석하기 위해 파이지-항체 입자를 다음과 같이 생산하였다.
본 발명의 파이지-항체 입자 생산에 사용된 것은 헬퍼 파이지(VCSM13),2TY media (16g tryptone, 10g 효모 추출물, 5g NaCl/L). Ampicillin 200mg/mL in H2O, Kanamycin 50mg/mL, 40% glucose in H2O 및 교반 인큐베이터, 멸균 96 well microtitre plates 를 사용하였다.
먼저, biopanning output 플레이트로부터 콜로니를 픽업하여 96웰 플레이트에 ampicilin (100ug/mL)를 포함하는 2TY (2TY, 100ug/mL ampicillin and 2% glucose) 배지에서 콜로니를 배양하고 turbid(OD600 ~0.6)될 때까지 37℃에서 교반(600rpm) 하면서 성장시켰다.
플레이트 각 웰에 ampicillin (100ug/mL), glucose (2%)를 포함하는 2TY에 헬퍼 파이지를 첨가하였다 (최종: 5 x 1010 pfu/mL, MOI of 10). 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 천천히 교반(125 rpm)하여 헬퍼 파이지의 superinfection이 가능하게 하였다. 플레이트를 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 그 상등액을 피펫으로 떠서 kanamycin (50 ug/mL), ampicillin (100 ug/mL) 를 가지는 2TY에 세균 펠렛을 재부유하였다. 25℃에서 신속한 교반을 하면서 16시간 배양하여 파이지-항체 입자를 생산하였다.
실시예 4: 파이지-항체 선별을 위한 파이지-ELISA
Biopanning을 통해 얻어진 파이지-항체는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 조금 더 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다. ELISA는 파이지-항체 혼합물을 항원에 결합시키는 biopanning과 다르게 single 파이지-항체를 immunotube에 고정된 항원에 결합시켰다. 따라서 각각의 클론이 항원에 대해서 결합 시그널 값 확인이 가능하였다.
먼저, 100 uL 재조합 rotavirus 단백질 항원 (500ng/mL 항원 in 50mM NaHCO3, pH 9.0)을 maxisorp plate에 넣은 후 4℃에서 오버나잇하여 코팅하였다.ELISA 플레이트를 4℃ 저장으로부터 상온으로 옮겨서 코팅 물질을 털어내고 각 플레이트를 PBS/T로3번 세척하였다.
그 후, 플레이트를 웰 당 250 uL의 3%(w/v) milk/PBS/T로 1 시간 동안 37℃에서 블록킹하고 세척하였다. 발현된 single 파이지-항체 입자 역시 3%(w/v) milk/PBS/T로 1 시간 동안 블록킹 하였다.
상기 프리블록킹된 파이지-항체 입자를 각 항원 코팅된 ELISA 플레이트 및 대조군 (BSA) ELISA 플레이트에 옮기고 플레이트 교반기 상에서 1~1.5 hr 동안 반응시켰다.
PBS/T로 6번 플레이트를 세척하고, 각 웰 당 100 uL의 1:5000 희석된(200ng/mL) HRP 컨쥬게이트 된 anti-M13 항체(3%(w/v) milk/PBS/T에 용해된)를 첨가하고 1시간 상온에서 ~600rpm 교반하면서 반응시키고 그 플레이트를 PBS/T로6번 세척하였다.
100 uL TMB 기질을 웰당 첨가하고 플레이트를 읽기 전에 5-30 분 디벨로프하였다. 100 uL의 sulphuric acid 버퍼를 첨가하여 디벨로프를 중단하고 450nm에서 흡광도를 plate reader로 측정하였다. ELISA를 통한 Target/BSA의 450nm 흡광도 값 비율이 2.0 이상인 파이지-항체 클론을 선택하였다.
실시예 5: 선별된 파이지-항체 핵 민 아미노산 서열 분석
파이지-ELISA를 통해 선별된 파이지-항체의 plasmid DNA를 정제후 DNA 시퀀싱하여 단일 DNA 서열을 가진 파이지-항체 클론을 선별하였다. 이후 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역 및 분석 하여 단일 아미노산 서열을 가지는 파이지-항체를 재선별 하였다. 도 6 내지 7은 파이지-ELISA 및 아미노산 서열 분석을 통해 최종 50종의 단일 파이지-항체 클론을 선별하였다.
단일 파이지-항체 클론 (Unique clones)으로 선택된 파이지-항체는 MA 104 cell에서 발현된 Wa strain rotavirus 입자에 결합하는 파이지-ELISA 분석을 진행하였다. Rotavirus 입자를 코팅(5 ug/mL)하고 3% milk/PBS/T로 블록킹하였다. 이후에 세척 과정을 거친 뒤에 선택된 파이지-항체를 넣어준다. 이후로는 앞에서 진행한 ELISA 실험 방법과 동일하게 진행하였다. Rotavirus 입자/BSA의 450nm 흡광도 값 비율이 5.0 이상인 파이지-항체 클론 30개 scFv가 선택되었다.
실시예 6: 대변(Stool) 샘플에서 테스트
Stool 샘플에는 타겟 바이러스뿐만 아니라, 다른 수많은 물질들이 포함되어 있기 때문에 background를 없애기 위해서 발굴된 rotavirus 항체와 상용항체를 사용하여 sandwich ELISA로 진행하여 분석하였다.
이에 앞서, 상용항체를 구매하여 rotavirus stool 샘플에 결합하는 것을 분석 및 검증하였다. Stool샘플을 directly coating하여 B사, F사 그리고 H사에서 구매한 5종류의 상용항체를 결합하도록 반응시킨 후, HRP 컨쥬게이트 된 detection Ab와 TMB를 사용하여 stool 샘플에 결합하는 상용항체를 확인하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 상용항체 중 B사의 B1 항체가 stool sample에 제일 결합을 잘하는 것을 알 수 있었다. 따라서 발굴된 rotavirus 항체와 B사의 B1 상용항체를 사용하여 sandwich ELISA로 진행하여 rotavirus에 특이적으로 결합하는 파이지-항체를 아래와 같이 분석 및 선별하였다.
선별된 파이지-항체의 stool에서의 결합력을 확인하기 위해서, rotavirus에 binding하는 것으로 확인된 B사의 B1 상용항체를 2 ug/mL, 0.5 ug/mL 두 가지 조건으로 코팅하였다. 오버나잇으로 코팅된 플레이트를 PBS/T(0.05% T20)으로 세척 후에 3% milk/PBS/T로 블록킹하였다. 이후에 항원으로 stool 샘플을 100 uL(10% stool, 90% PBS) 넣고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 세척 과정을 거친 후에 발현된 파이지-항체를 80%사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후에 다시 세척 과정을 거친 후 HRP 컨쥬게이트 된 anti 파이지-항체를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 마지막으로 플레이트를 세척하여 TMB 기질로 반응시켰다.
도 10은 선별된 파이지-항체와 stool sample의 결합을 검증하는 파이지-ELISA 실험 결과로서, stool에 특이적으로 결합하는 파이지-항체를 선별하였다. 이 항체는 향후에 rotavirus를 sensitive하게 detection 할 수 있는 항체로 사용될 수 있으며, 더 나아가서는 rotavirus의 치료제개발에 사용 가능할 것이다.
본 발명에서 가장 효과가 우수한 단클론 항체를 선택하여 그 서열을 결정하였다(도 11 참조). 서열 결정과 CDR determination에 관하여서는 하기 레퍼런스를 참고하였다;Andrew C.R. Martin (2001) Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In Antibody Engineering Lab Manual ( Duebel, S. and Kontermann, R., Ed.), pp. 432-433. Springer-Verlag, Germany, 및
http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid
상기 참고문헌 및 사이트에서 제시한 방법은, CDR의 앞 또는 뒤의 서열을 확인하고 그 서열의 길이를 제시함으로서 CDR determination할 수 있다는 내용이다.
실시예
7: 대변(Stool) 샘플에 결합하는 rotavirus 항체 분석
최종적으로 선별된 파이지-항체를 scFv-Fc (maxibody) 형태의 항체로 동물세포 발현 벡터에 subcloning 하였다. maxibody 형태의 항체를 동물세포 (HEK293)에서 발현하여 proteinA 컬럼으로 정제하였다. 선별된 항체의 stool샘플에 결합을 확인하기 위해 ELISA 진행하였다. 정제된 항체를 rotavirus 양성 stool, 음성 대조군 noro GI, GII stool을 1% direct로 코팅하였다. 이외의 방법은 상기 파이지-ELISA와 동일하며, 정제된 항체는 100ng을 사용했다. 도 12에서 정제된 7-2G8 항체는 rotavirus 양성 stool에서는 1.5 이상의 높은 signal값을 가지는 반면, 음성 대조군인 noro GI, GII stool 각각 에서는 0.2 이하의 매우 낮은 값을 가진다.
도 13에서 코팅한 샘플은 rotavirus 양성 stool과 rotavirus 음성 stool 샘플이다. 정제된 항체와 파이지-항체를 비교하였고, 음성 대조군 파이지-항체로는 rotavirus에 결합하지 않는 것으로 알고 있는 anti norovirus 파이지-항체를 사용하였다. 파이지-항체 상층액은 80%으로 사용하였으며, 정제된 항체 7-2G8은 100ng으로 사용하였다. 이외의 방법은 상기 ELISA 방법과 유사하다. 도 13의 정제된 항체는 파이지-항체보다 rotavirus 양성 stool에서 더 높은 결합을 하는 것을 확인할 수 있었고, rotavirus 음성 stool에서는 0.1 이하의 매우 낮은 signal 값을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
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<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 of VH
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 of VH
<400> 2
Trp Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
20 25
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VH
<400> 3
Arg Gly Arg Val Ile Asp Ala His Lys Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 of VL
<400> 4
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 of VL
<400> 5
Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VL
<400> 6
Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 of VH
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 of VH
<400> 8
Trp Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
20 25
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VH
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Arg Gly Arg Val Phe Ser Asn Pro Arg Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 of VL
<400> 10
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 of VL
<400> 11
Tyr Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VL
<400> 12
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 of VH
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Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 of VH
<400> 14
Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
20 25
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VH
<400> 15
Lys Ala Leu Gly Glu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Ser Tyr Ser Asn Ala
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Tyr
1 5 10
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 of VL
<400> 18
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Val Ile Asp Ala His Lys Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 21
Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Val Phe Ser Asn Pro Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 22
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 23
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Leu Gly Glu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Ser Tyr Ser Asn
100 105 110
Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Asn Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Claims (15)
- 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-로타바이러스 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편:
서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체;
서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및
서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄로 구성되는 단일클론 항체. - 제 1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 단일 측쇄 항체(scFv)인 것을 특징으로 하는 항-로타바이러스 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
- 제 1항에 있어서, 상기 기능적 단편은 항원결합 분절(Fab)인 것을 특징으로 하는 항-로타바이러스 단일클론 항체, 또는 그 기능적 단편.
- 제 1항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 19로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄;
서열번호 21로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 22로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄; 및
서열번호 23으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄
로 구성된 군으로부터 선택된 단일클론 항체. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 로타바이러스 VP6 또는 VP7에 대하여 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 생산 세포주.
- 제 6항에 있어서, 상기 세포주는 KCCM11744P, KCCM11745P 및 KCCM11746P로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 세포주인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 생산 세포주.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항-로타바이러스 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항-로타바이러스 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 로타바이러스 유래한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항-로타바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 로타바이러스 진단용 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈, 자성입자, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 진단용 조성물.
- 1) 샘플과 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항-로타바이러스 단일클론 항체를 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단일클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
대상체의 로타바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법. - 1) 샘플과 제 8항의 조성물을 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 조성물 내 항-로타바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
대상체의 로타바이러스 감염 여부에 대한 정보제공 방법. - 1) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 항-로타바이러스 단일클론 항체; 및
2) 용기
를 포함하는 로타바이러스 진단용 키트. - 1) 제 10항의 로타바이러스 진단용 조성물; 및
2) 용기
를 포함하는 로타바이러스 진단용 키트.
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| Publication number | Publication date |
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| KR101750168B1 (ko) | 2017-07-03 |
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