JP7385944B2 - 尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップ及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップ及び方法に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的な種類の認知症であり、世界中で２６００万人以上の人々が認知症を抱えて暮らしている。私たちと他の研究者は、認知機能が正常な高齢者の大部分（３０％）の脳内のＰＥＴリガンドの保持率が高く、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に低いレベルのＡβ１－４２を示すことが発見されたことで、これらの人々も現在、前臨床期アルツハイマー病と診断されている。軽度認知障害（ＭＣＩ）は、ＡＤの前駆段階と見なされ、ＭＣＩ基準を満たす患者の４０～６０％が、最終的に臨床ＡＤに進展し、毎年約５～２５％を占める。散発性ＡＤの主な原因は、Ａβの蓄積及びＡβクリアランスの失敗である。現在この研究分野は、脳内のＡβの代謝の不均衡が神経変性及びＡＤ患者の認知機能低下の根本的な原因であるということを「アミロイドカスケード仮説」として広く支持されている。多くの動物及び遺伝学的研究では、単球／マクロファージ／ミクログリアの先天性貪食作用がＡβのクリアランスの促進及び老人斑の形成を予防することにより、ＡＤの進行を遅らせる可能性があることを示している。
脳、特に海馬の体積の減少（核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を通じて）を検出する手段、脳機能の変化（機能的核磁気共鳴画像法を使用）を検出する手段及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβ１－４０、Ａβ１－４２とｔａｕの濃度変化を検出する手段を含むバイオマーカーは、アルツハイマー病の早期診断のための有効な手段として有望である。ただし後者の手段は、侵襲的で、患者のコンプライアンスが非常に低いものとなっている。もう１つの有望な方法は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）３である。ニューロイメージング（ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ）は、高価で、臨床使用に利用できる施設の数が集団スクリーニングの需要量を満たすことができていない。血漿中のＡβ１－４２／Ａβ１－４０の比は、潜在的に高リスクのＭＣＩ又はＡＤ患者を識別する有効なバイオマーカーとして使用できることが研究によって示されているが、この検出も特別な機器が必要で、集団に対する全面的なスクリーニング検査に適していない。このためより実用的で、感度が高く、特異的な新規ＡＤバイオマーカーが緊急的に必要とされる。
ＡＤは、脳の障害や損傷だけでなく、全身の系統的疾患である。尿中には、血漿中の可溶性Ａβがろ過さて体外に排出されることができることを見出し、脳内のＡβ循環の変化を反映できる可能性がある。ヒトの尿中Ａβ濃度の最低値がＥＬＩＳＡ法の検出限界よりも低いため、現在、尿中ＡβをターゲットとしたＭＣＩ又はＡＤの診断のための臨床ルーチン診断手順はない。ターゲット抗原は、小さすぎて４．３ｋＤのみで、他のタンパク質と非特異的に結合しやすいため、慣用の「二重抗体サンドイッチ法」や「競合法」では高感度及び特異性を実現することが困難であった。
本発明は、従来技術における上述の問題点の克服を意図しており、尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップ及び方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明によって提供される技術的手段として、
尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップは、ＰＶＣベースシート（７）を備え、前記ＰＶＣベースシート（７）上に順次接しているサンプルパッド（１）、コンジュゲートパッド（２）、クロマトグラフィー検出パッド（３）及び吸水パッド（４）が敷かれ、前記コンジュゲートパッド（２）上にモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子を塗布し、前記クロマトグラフィー検出パッド（３）上のコンジュゲートパッド（２）に近い側に検出ライン（５）が設けられ、吸水パッド（４）に近い側にコントロールライン（６）が設けられ、前記検出ライン（５）上にＡβアミロイド結合ポリマーを塗布し、前記コントロールライン（６）上にヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を塗布する。
尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップは、ＰＶＣベースシート（７）を備え、前記ＰＶＣベースシート（７）上に順次接しているサンプルパッド（１）、コンジュゲートパッド（２）、クロマトグラフィー検出パッド（３）及び吸水パッド（４）が敷かれ、前記コンジュゲートパッド（２）上にモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子を塗布し、前記クロマトグラフィー検出パッド（３）上のコンジュゲートパッド（２）に近い側に検出ライン（５）が設けられ、吸水パッド（４）に近い側にコントロールライン（６）が設けられ、前記検出ライン（５）上にＡβアミロイド結合ポリマーを塗布し、前記コントロールライン（６）上にヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を塗布する。
好ましくは、Ａβアミロイド結合ポリマーは、グルタミン酸、リジン、アラニン、チロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含み、分子量が４～５２ｋＤの範囲である。
好ましくは、前記抗Ａβモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株から調製されたマウス抗Ａβモノクローナル抗体であり、又はモノクローナル抗体１Ｅ８、モノクローナル抗体４Ｇ８、モノクローナル抗体Ｗ０－２、モノクローナル抗体６Ｅ１０のうち少なくとも１種である。
好ましくは、前記サンプルパッド（１）上に電気泳動用緩衝液を塗布し、塗布量は、１０～１６μＬ／ｃｍの範囲であり、前記コンジュゲートパッド（２）上のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子の塗布量が６～９μＬ／ｃｍの範囲であり、前記検出ライン（５）上には、前記Ａβアミロイド結合ポリマーの濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布され、前記コントロールライン（６）上には、前記ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の濃度が２００μｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布される。
尿中Ａβアミロイドを検出する方法は、粒子径が２０～５０ｎｍの範囲のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子で尿中Ａβアミロイドを捕捉し、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体が形成され、次にＡβアミロイド結合ポリマーで金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を検出し；ここで前記モノクローナル抗体は、抗Ａβモノクローナル抗体で、前記Ａβアミロイド結合ポリマーがグルタミン酸、リジン、アラニン、チロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含む。
好ましくは、前記ペプチド鎖の分子量は、４～５２ｋＤの範囲である。
好ましくは、前記抗Ａβモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株から調製されたマウス抗Ａβモノクローナル抗体であり、又はモノクローナル抗体１Ｅ８、モノクローナル抗体４Ｇ８、モノクローナル抗体Ｗ０－２、モノクローナル抗体６Ｅ１０のうち少なくとも１種である。
前記Ａβアミロイド結合ポリマーは、Ａβアミロイド検出試薬、ＭＣＩ診断試薬及びＡＤ診断試薬の調製に使用させることができる。
本発明を以下にさらに説明する。
本発明は、粒子径が２０～４０ｎｍの範囲のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子で尿中Ａβアミロイドを捕捉し、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を形成する。貪食作用促進ペプチド群（Ａβアミロイド結合ポリマー、ＰＰＰと命名する）があり、特定のポリマーと少数の１５モノマーペプチドを含むことが分かり、この群はＡβ１－４２に対し高親和性に富んでいることを見出した。ポリマーの１つは、グルタミン酸、リジン、アラニン及びチロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含み、分子量が４～５２ｋＤ（平均６．５ｋＤ）の範囲である。新たに溶解したＡβ１－４２と古いＡβ１－４２の平衡解離定数ＫＤは、それぞれ６．６と２５．４ｎＭである。このポリマーは、Ａβ１－４２の検出に非常に有望で、ヒトＡβのクリアランスを促進することもできる。よって、Ａβアミロイド結合ポリマーで、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を検出し、感度が高く、検出限界が４０ピコグラム（ｐｇ）である。免疫クロマトグラフィー反応全体が横流クロマトグラフィーテストストリップシステムに統合されることで、迅速で経済的になり、ルーチン臨床病理検査に適し、集団に対する全面的なスクリーニング検査や家庭内のエンドユーザーの自己スクリーニング検査に適し、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）の早期診断と事前判断を臨床的に支援し、患者がＭＣＩ及びＡＤに進展する高いリスクがあるかどうかを予測するために用いられる。
本発明は、粒子径が２０～４０ｎｍの範囲のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子で尿中Ａβアミロイドを捕捉し、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を形成する。貪食作用促進ペプチド群（Ａβアミロイド結合ポリマー、ＰＰＰと命名する）があり、特定のポリマーと少数の１５モノマーペプチドを含むことが分かり、この群はＡβ１－４２に対し高親和性に富んでいることを見出した。ポリマーの１つは、グルタミン酸、リジン、アラニン及びチロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含み、分子量が４～５２ｋＤ（平均６．５ｋＤ）の範囲である。新たに溶解したＡβ１－４２と古いＡβ１－４２の平衡解離定数ＫＤは、それぞれ６．６と２５．４ｎＭである。このポリマーは、Ａβ１－４２の検出に非常に有望で、ヒトＡβのクリアランスを促進することもできる。よって、Ａβアミロイド結合ポリマーで、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を検出し、感度が高く、検出限界が４０ピコグラム（ｐｇ）である。免疫クロマトグラフィー反応全体が横流クロマトグラフィーテストストリップシステムに統合されることで、迅速で経済的になり、ルーチン臨床病理検査に適し、集団に対する全面的なスクリーニング検査や家庭内のエンドユーザーの自己スクリーニング検査に適し、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）の早期診断と事前判断を臨床的に支援し、患者がＭＣＩ及びＡＤに進展する高いリスクがあるかどうかを予測するために用いられる。
図２乃至図７は、本発明の実施例における結果図である。
１、抗Ａβモノクローナル抗体の生産と精製
艾比瑪特医薬科技有限公司（Ａｂ－Ｍａｒｔ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）が生産している商用マウスハイブリドーマ細胞株（ＢＧＭ０２）を購入して、マウス抗Ａβモノクローナル抗体を生産し、その他の商用可能なモノクローナル抗体クローンは、１Ｅ８、４Ｇ８、Ｗ０－２、６Ｅ１０などを含んで単独又は混合して使用することもできる。ガス透過性の疎水性細胞培養フラスコを使用して、ハイブリドーマ細胞を４５℃で解凍し、１％グルタミン、１％ストレプトマイシン／ペニシリン、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をハイブリドーマ細胞無血清培地に添加した（％はハイブリドーマ細胞の無血清培地中の成分の質量％を意味する）。
艾比瑪特医薬科技有限公司（Ａｂ－Ｍａｒｔ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）が生産している商用マウスハイブリドーマ細胞株（ＢＧＭ０２）を購入して、マウス抗Ａβモノクローナル抗体を生産し、その他の商用可能なモノクローナル抗体クローンは、１Ｅ８、４Ｇ８、Ｗ０－２、６Ｅ１０などを含んで単独又は混合して使用することもできる。ガス透過性の疎水性細胞培養フラスコを使用して、ハイブリドーマ細胞を４５℃で解凍し、１％グルタミン、１％ストレプトマイシン／ペニシリン、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をハイブリドーマ細胞無血清培地に添加した（％はハイブリドーマ細胞の無血清培地中の成分の質量％を意味する）。
培地が黄色くなると、細胞を継代し、細胞の継代における血清の割合は、２０％、１０％、５％、２％から無血清培地（０％）に低減し、細胞が生き残ることができた。この過程には、通常１ヶ月かかる。血清が消費されるまで上清を吸引除去しなかった。
バイオリアクターにおいて培地に接種する時、細胞を遠心分離して沈降させると共に注ぎ、凝集させ、注射器に集めた後、培地に接種した。ハイブリドーマ細胞をバイオリアクター内の無血清培地で培養させ、１０～１５日後に細胞培養上清を吸引除去した。
樹脂と結合した組換えプロテインＡでアフィニティークロマトグラフィーを介して抗体を精製した。
ハイブリドーマ細胞培養上清を１Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．５に調整した。回転数３６００ｒｐｍ／分間のベンチトップ遠心分離機で２０分遠心分離し、又は回転数７５００ｒ／ｍｉｎの高速遠心分離機で１０分遠心分離（推奨）して、全ての細胞破片を除去し、沈殿物を析出させた。
上清を組換えプロテインＡハイフローカラムに入れ、０．２２μｍプレフィルター又はガラス繊維メンブレン付きプレフィルターを使用できた。落地速度を２ｍＬ／分未満に保ち、カラム体を少なくとも５０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
５０ｍＬの４０ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出（１ｍＬ／ｍｉｎの速度）し、フラクションコレクターで溶出液を収集し、Ｎａ２ＨＰＯ３緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ９．５）ですべての収集液体を直ちに中和した。溶出後すぐにカラムを洗い流した。抗体を入れた遠心分離管を一緒に集め、Ａ２８０／Ａ２６０吸光度分光光度計又はタンパク質検出キットで濃度を測定した。抗体を分注し、－８０℃で保存した。
２、３０ｎｍの金コロイド粒子の調製
０．０１％ ＨＡｕＣｌ４溶液２００ｍＬを取り、ゆっくりとかき混ぜて沸騰させる。２分間沸騰させ続け、高速撹拌に切り替え、直ちに１％クエン酸三ナトリウム２．０ｍＬを加える。溶液が赤色／紫色になるまで沸騰させ続け、次に５分間沸騰させ続ける。電子顕微鏡で検査したところ、予想される粒子サイズが３０ｎｍである。サイズは、１％のクエン酸三ナトリウムの体積で調整でき、８．０、６．０、４．０、又は１．５ｍＬの体積で、それぞれ１０、１５、２０、５０ｎｍのサイズの粒子を生成した。
０．０１％ ＨＡｕＣｌ４溶液２００ｍＬを取り、ゆっくりとかき混ぜて沸騰させる。２分間沸騰させ続け、高速撹拌に切り替え、直ちに１％クエン酸三ナトリウム２．０ｍＬを加える。溶液が赤色／紫色になるまで沸騰させ続け、次に５分間沸騰させ続ける。電子顕微鏡で検査したところ、予想される粒子サイズが３０ｎｍである。サイズは、１％のクエン酸三ナトリウムの体積で調整でき、８．０、６．０、４．０、又は１．５ｍＬの体積で、それぞれ１０、１５、２０、５０ｎｍのサイズの粒子を生成した。
室温まで冷却し０．１Ｍ Ｋ２ＣＯ３でｐＨを７．２に調整した。ブレーキをかけずに回転数１００００ｇで３０分間遠心分離し、約２０ｍＬが残るまで上清を取り除き、４℃で保存した。
３、金コロイド粒子とモノクローナル抗体の共役カップリング
１００μＬの５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を試験管１～１０に追加し、１００μＬの抗体溶液を試験管１に添加し、よく混合し、試験管９まで順番に希釈し、１００μＬのホウ酸緩衝液を試験管１０のみ添加する。各試験管に１００μＬの金コロイド溶液（０．１Ｍ Ｋ２ＣＯ３でｐＨ９．０に調整する）を添加し、よく混合して１０分間インキュベートし、１０μＬの１０％塩化ナトリウムを添加し、よく混合し、６０～１２０分間静置する。タンパク質含有量が十分な場合、色は変化せず、タンパク質含有量が足りない場合、試験管１０の色が紺青に変わる。この方法を使用することで２０ｍＬの金コロイド粒子に必要なタンパク質の最小量（Ｘｍｉｎ）を見つけることができた。
１００μＬの５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を試験管１～１０に追加し、１００μＬの抗体溶液を試験管１に添加し、よく混合し、試験管９まで順番に希釈し、１００μＬのホウ酸緩衝液を試験管１０のみ添加する。各試験管に１００μＬの金コロイド溶液（０．１Ｍ Ｋ２ＣＯ３でｐＨ９．０に調整する）を添加し、よく混合して１０分間インキュベートし、１０μＬの１０％塩化ナトリウムを添加し、よく混合し、６０～１２０分間静置する。タンパク質含有量が十分な場合、色は変化せず、タンパク質含有量が足りない場合、試験管１０の色が紺青に変わる。この方法を使用することで２０ｍＬの金コロイド粒子に必要なタンパク質の最小量（Ｘｍｉｎ）を見つけることができた。
金コロイド粒子溶液（０．１Ｍ Ｋ２ＣＯ３でｐＨ９．０に調整）に、Ｘｍｉｎの質量に対して１０％の量の抗体（５ｍＭホウ酸緩衝液でｐＨ９．０）を追加し、室温で１５分間シェーカーに置く。
標識された金コロイド５０μＬに１０％ ５μＬを加えて、飽和度を確認し、３０分間静置する。金コロイドが青色に変化せず、金を析出した場合、飽和して標識されたことを示した。
１％ポリエチレングリコールＰＥＧ（２０ｋＤで、１％クエン酸三ナトリウム又は０．１Ｍ Ｋ２ＣＯ３でｐＨ７．２に調整）を加えて、最終濃度を０．１％にした。
２６０ｇで２０分間低速で遠心分離し、上清を保存して不純物（小粒子）を除去した。
ブレーキをかけずに１００００ｇで３０分間高速で遠心分離し、０．２％ ＰＥＧを４ｍＭリン酸塩／クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）に１０ｍｌまで加え、粒子を再懸濁して４℃で保存した。使用前に１０％ショ糖を加えた。
４、横流クロマトグラフィーテストストリップの組み立て
図１を参照すると、図１を参照すると、尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップは、ＰＶＣベースシート７を備え、前記ＰＶＣベースシート７上に順次接しているサンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、クロマトグラフィー検出パッド３及び吸水パッド４が敷かれ、前記コンジュゲートパッド２上にモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子を塗布し、前記クロマトグラフィー検出パッド３上のコンジュゲートパッド２に近い側に検出ライン５が設けられ、吸水パッド４に近い側にコントロールライン６が設けられ、前記検出ライン５上にＡβアミロイド結合ポリマーを塗布し、前記コントロールライン６上にヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を塗布する。
図１を参照すると、図１を参照すると、尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップは、ＰＶＣベースシート７を備え、前記ＰＶＣベースシート７上に順次接しているサンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、クロマトグラフィー検出パッド３及び吸水パッド４が敷かれ、前記コンジュゲートパッド２上にモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子を塗布し、前記クロマトグラフィー検出パッド３上のコンジュゲートパッド２に近い側に検出ライン５が設けられ、吸水パッド４に近い側にコントロールライン６が設けられ、前記検出ライン５上にＡβアミロイド結合ポリマーを塗布し、前記コントロールライン６上にヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を塗布する。
具体的な組み立てプロセスは、次の通りである。すなわち、
サンプルパッド及びコンジュゲートパッドをブロッキングバッファー（２０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％ ＮａＮ３）に４℃で３時間又は一晩浸した。パッドを蒸留水（又は超純水）で室温にて１５分間１回洗浄した後、３７℃で乾燥させた。
サンプルパッド及びコンジュゲートパッドをブロッキングバッファー（２０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％ ＮａＮ３）に４℃で３時間又は一晩浸した。パッドを蒸留水（又は超純水）で室温にて１５分間１回洗浄した後、３７℃で乾燥させた。
サンプルパッドを幅１５ｍｍのストリップにカットし、電気泳動用緩衝液（２０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、８％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％ ＮａＮ３）をスプレーし、塗布量は、１０μＬ／ｃｍである。
コンジュゲートパッドを幅１０ｍｍのストリップにカットする。標識された金コロイドをコンジュゲートパッドにスプレーし、塗布量は、１ｃｍあたり６～９μＬである。
クロマトグラフィー検出パッド（ニトロセルロースメンブレン）に検出ライン及びコントロールラインを８ｍｍ間隔で引く。検出ラインは、ポリマーＰＰＰを含む２ｍｇ／ｍＬ １０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、塗布量が２．５μＬ／ｃｍである。コントロールラインには、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体が含まれ、ＰＢＳに５００μｇ／ｍＬまで添加し、塗布量が２．５μＬ／ｃｍである。それぞれラインは、幅１ｍｍ、長さ４ｍｍである。
吸収パッドを幅１５ｍｍのストリップにカットする。
上記の構成要素を６０×３００ｍｍのベースシートに組み立て、幅４ｍｍの７５本のストリップにカットする。各テストストリップは、プラスチック製のケースに組み込まれる。
５、尿Ａβを検出するための横流クロマトグラフィーテストストリップの使用
尿サンプルは一日中いつでも採取できるが、同じ日に測定するのが最善である。尿サンプルを－８０℃で凍結保存できるが、凍結融解を繰り返すことはできない。
尿サンプルは一日中いつでも採取できるが、同じ日に測定するのが最善である。尿サンプルを－８０℃で凍結保存できるが、凍結融解を繰り返すことはできない。
キットケースのサンプルポートに１００μＬの尿サンプルをゆっくりと加える。２０分間静置した後、検出ライン及びコントロールラインを確認する。
結果の最良の読み取り時間は、２時間以内で、金コロイド免疫クロマトグラフィー分析計又は目視で読み取る。
結果の判定
陰性（－）：コントロールラインのみが呈色する。
弱陽性（＋／－）：検出ラインは薄く呈色し、コントロールラインが明確に呈色する。
陽性（＋）：検出ラインは呈色し、呈色強度がコントロールラインと一致する。
強陽性（＋＋）：検出ラインは明確に呈色し、コントロールラインが正常又は薄く呈色する。
極強陽性（＋＋＋）：検出ラインは鮮明で濃く呈色し、コントロールラインが極めて薄く呈色するか、呈色しない可能性がある。
陰性（－）：コントロールラインのみが呈色する。
弱陽性（＋／－）：検出ラインは薄く呈色し、コントロールラインが明確に呈色する。
陽性（＋）：検出ラインは呈色し、呈色強度がコントロールラインと一致する。
強陽性（＋＋）：検出ラインは明確に呈色し、コントロールラインが正常又は薄く呈色する。
極強陽性（＋＋＋）：検出ラインは鮮明で濃く呈色し、コントロールラインが極めて薄く呈色するか、呈色しない可能性がある。
６、Ａβポリマーの識別
ＰＰＰがＡβと相互作用できるかどうかをテストした。Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒｏｒのマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）でＰＰＰとＡβ１－４２との間の親和性を確認した。ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ４８８標識Ａβ１－４２（ＰＢＳ緩衝液中の８０ｎＭ）の１：１（体積）でＰＰＰを段階的に希釈し、平均分子量は、６．５ＫＤであった。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５システムにおける９５％のＬＥＤ及び４０％の赤外線レーザー出力で処理された標準キャピラリー内で測定する。結果は、分子量が６．６ｎＭの場合、ＰＰＰとＡβ１－４２との間に高親和性結合があることを示している。ＰＰＰとＡβ１－４２モノマーの化学量論比は、３である。Ａβ１－４２を４℃で１週間置いても、より多くのオリゴマーと繊維構造が析出され、ＫＤ分子量の実効値がやはり２５．４ｎＭと低く（図２）、Ａβモノクローナル抗体の親和性に近い。
ＰＰＰがＡβと相互作用できるかどうかをテストした。Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒｏｒのマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）でＰＰＰとＡβ１－４２との間の親和性を確認した。ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ４８８標識Ａβ１－４２（ＰＢＳ緩衝液中の８０ｎＭ）の１：１（体積）でＰＰＰを段階的に希釈し、平均分子量は、６．５ＫＤであった。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５システムにおける９５％のＬＥＤ及び４０％の赤外線レーザー出力で処理された標準キャピラリー内で測定する。結果は、分子量が６．６ｎＭの場合、ＰＰＰとＡβ１－４２との間に高親和性結合があることを示している。ＰＰＰとＡβ１－４２モノマーの化学量論比は、３である。Ａβ１－４２を４℃で１週間置いても、より多くのオリゴマーと繊維構造が析出され、ＫＤ分子量の実効値がやはり２５．４ｎＭと低く（図２）、Ａβモノクローナル抗体の親和性に近い。
円二色性（ＣＤ）分光法は、溶液中のペプチド－ペプチド相互作用を研究するための実用的な方法である。遠紫外線領域（１７８～２６０ｎｍ）のＣＤは、タンパク質骨格のアミドに由来し、タンパク質のコンフォメーションに敏感である。よってＣＤは、相互作用中にポリペプチドのコンフォメーションが変化するかどうかを確認できる。ＣＤ分光法は、Ａβ１－４２及びＰＰＰの結果を検出及び取得できる（図３）。ＣＤは定量分析の手法で、Ａβ１－４２とＰＰＰの相互作用が発生すると、ＣＤスペクトルの変化量は形成されたペプチド－ペプチド複合体に比例する。結果は、βシート構造がＡβ１－４２で優先的に形成されるのに対し、ＰＰＰではあまり明白ではないことを示している。この複合体は、明らかに異なる構造を示し、Ａβ１－４２とＰＰＰとの間に相互作用があることを示している（図３）。
さらにウェスタンブロッティング法でＡβ１－４２とＰＰＰとの間の相互作用を研究した。合成されたＡβ１－４２を異なる量のＰＰＰと異なる比率で混合し、次に混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ簡易電気泳動にかけた。電気泳動の線量を減らすことによりＰＰＰは、Ａβ１－４２を大幅に保持し、削減され単純化された条件下でも同じ（図４）で、Ａβ１－４２とＰＰＰとの間の結合が緊密であることを示している。
したがって、従来のポリクローナル抗体の横流イムノクロマトグラフィーと異なり、我々は、捕捉分子としてのＰＰＰでコンジュゲート金コロイド粒子に結合されたＡβを検出する。ＥＬＩＳＡ法と比較してこの方法は、検出感度を大幅に向上する。
７、尿Ａβを検出するための横流クロマトグラフィーテストストリップの臨床応用
まず、１００μＬのＭｉｌｌｉＱ超純水を使用して、０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の合成Ａβ４２を調製し、試験紙で順次テストした。結果は、０～５ｎｇ／ｍＬの間に良好な相関関係があり、高濃度の結果は抗原が多すぎることが原因である可能性があるＴラインの強度をさらに増加させなかったことを示している（図５）。
まず、１００μＬのＭｉｌｌｉＱ超純水を使用して、０～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度の合成Ａβ４２を調製し、試験紙で順次テストした。結果は、０～５ｎｇ／ｍＬの間に良好な相関関係があり、高濃度の結果は抗原が多すぎることが原因である可能性があるＴラインの強度をさらに増加させなかったことを示している（図５）。
次に、Ａβ４２を陰性尿サンプルに添加し、試験紙でテストした。結果は、超純水で調製されたＡβ４２試験紙の結果と一致していた。０．５～５ｎｇ／ｍＬのＡβ４２尿でテストした場合、Ｔラインが現れ、過剰な抗原（１０μｇ／ｍＬ）もテスト結果の比例した逓増を示さなかった（図５）。
１０歳未満の健康な子供の尿サンプルを本発明のテストストリップでテストした（図６）。健康な子供の尿サンプルの９０％以上のテスト結果が陰性であった。
１５２人の中国人漢民族の尿サンプルをこれらの試験紙でテストした（図７）。研究の対象は、中国の上海にある復旦大学の華山病院神経内科で募集された外来患者であった。うち男性は、５５例で、年齢が平均６８．５歳で、女性が９７例で、年齢が平均６８．１歳であった。年齢範囲は、４２歳～８９歳で、平均年齢が６８．３歳であった。
対象は、次の通りである。すなわち、
（１）認知機能正常対照群（ｎ＝３０）：既知の加齢性疾患は、なく、ミニメンタルステート評価尺度（ＭＭＳＥ）の点数が２７点以上であり、このグループの患者のうち２２人が外来診療で最近記憶力の低下を訴えた。他の８人は、患者の家族であった。
（２）ＭＣＩ群（ｎ＝４７）：初期ＡＤ患者を含む臨床評価（ＭＭＳＥ点数が２２～３０点）。
（３）軽度のＡＤ群（ｎ＝３７）：ＭＭＳＥ点数が１０～２０点
（４）重度のＡＤ群（ｎ＝６）：ＭＭＳＥ＜１０。
（５）その他の認知症（ｎ＝２１）：１５人の血管性認知症、３人の前頭側頭型認知症、及び３人のレビー小体型認知症を含む。
（６）パーキンソン病の患者（ｎ＝３）。
（１）認知機能正常対照群（ｎ＝３０）：既知の加齢性疾患は、なく、ミニメンタルステート評価尺度（ＭＭＳＥ）の点数が２７点以上であり、このグループの患者のうち２２人が外来診療で最近記憶力の低下を訴えた。他の８人は、患者の家族であった。
（２）ＭＣＩ群（ｎ＝４７）：初期ＡＤ患者を含む臨床評価（ＭＭＳＥ点数が２２～３０点）。
（３）軽度のＡＤ群（ｎ＝３７）：ＭＭＳＥ点数が１０～２０点
（４）重度のＡＤ群（ｎ＝６）：ＭＭＳＥ＜１０。
（５）その他の認知症（ｎ＝２１）：１５人の血管性認知症、３人の前頭側頭型認知症、及び３人のレビー小体型認知症を含む。
（６）パーキンソン病の患者（ｎ＝３）。
すべての尿サンプルは、ルーチン尿検査を実施した。高タンパク（２＋以上）の尿を除外した。
全体的な結果（表１）は、他の認知症とともに、ＭＣＩおよび早期／軽度ＡＤの検出率が高いことを示し、これらのテストストリップがＭＣＩ及びＡＤの臨床診断において高い潜在力があることを示している。
１ サンプルパッド
２ コンジュゲートパッド
３ クロマトグラフィー検出パッド
４ 吸水パッド
５ 検出ライン
６ コントロールライン
７ ＰＶＣベースシート
２ コンジュゲートパッド
３ クロマトグラフィー検出パッド
４ 吸水パッド
５ 検出ライン
６ コントロールライン
７ ＰＶＣベースシート
Claims (2)
- ＰＶＣベースシート（７）を備えた尿中Ａβアミロイドを検出するためのテストストリップであって、前記ＰＶＣベースシート（７）上に順次接しているサンプルパッド（１）、コンジュゲートパッド（２）、クロマトグラフィー検出パッド（３）及び吸水パッド（４）が敷かれ、前記コンジュゲートパッド（２）上にモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子を塗布し、前記クロマトグラフィー検出パッド（３）上の前記コンジュゲートパッド（２）に近い側に検出ライン（５）が設けられ、前記吸水パッド（４）に近い側にコントロールライン（６）が設けられ、前記検出ライン（５）上にＡβアミロイド結合ポリマーを塗布し、前記コントロールライン（６）上にヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を塗布する構成において、
前記Ａβアミロイド結合ポリマーは、グルタミン酸、リジン、アラニン、チロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含み、分子が４～５２ｋＤの範囲であり、
前記モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株から調製されたマウス抗Ａβモノクローナル抗体であり、又はモノクローナル抗体１Ｅ８、モノクローナル抗体４Ｇ８、モノクローナル抗体Ｗ０－２、モノクローナル抗体６Ｅ１０のうち少なくとも１種であり、
前記サンプルパッド（１）上に電気泳動用緩衝液を塗布し、塗布量は、１０～１６μＬ／ｃｍの範囲であり、前記コンジュゲートパッド（２）上のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子の塗布量が６～９μＬ／ｃｍの範囲であり、前記検出ライン（５）上には、前記Ａβアミロイド結合ポリマーの濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布され、前記コントロールライン（６）上には、前記ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の濃度が２００μｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布される
ことを特徴とするテストストリップ。 - 尿中Ａβアミロイドを検出する方法であって、粒子径が２０～５０ｎｍの範囲のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子で尿中Ａβアミロイドを捕捉し、金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体が形成され、次にＡβアミロイド結合ポリマーで前記金コロイド粒子とＡβアミロイドの複合体を検出し；ここで前記モノクローナル抗体は、抗Ａβモノクローナル抗体で、前記Ａβアミロイド結合ポリマーがグルタミン酸、リジン、アラニン、チロシンからランダムに合成されたペプチド鎖を含み、前記ペプチド鎖の分子量は、４～５２ｋＤの範囲であり、
前記抗Ａβモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ細胞株から調製されたマウス抗Ａβモノクローナル抗体であり、又はモノクローナル抗体１Ｅ８、モノクローナル抗体４Ｇ８、モノクローナル抗体Ｗ０－２、モノクローナル抗体６Ｅ１０のうち少なくとも１種であり、
サンプルパッド（１）上に電気泳動用緩衝液を塗布し、塗布量は、１０～１６μＬ／ｃｍの範囲であり、コンジュゲートパッド（２）上のモノクローナル抗体とコンジュゲートした金コロイド粒子の塗布量が６～９μＬ／ｃｍの範囲であり、検出ライン（５）上には、前記Ａβアミロイド結合ポリマーの濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布され、コントロールライン（６）上には、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の濃度が２００μｇ／ｍＬとなるリン酸緩衝生理食塩水の溶液であって、その塗布量が１．５～２．５μＬ／ｃｍの範囲で塗布される
ことを特徴とする尿中Ａβアミロイドを検出する方法。
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